亚硝化细菌的分离纯化及诱变育种

亚硝酸菌的分离纯化及诱变育种
1.硝化细菌背景介绍：
硝化细菌-一类专性化能自养（无机营养）细菌，包括亚硝化菌和硝化细菌两个菌群，一般种类不能生长在有机培养基中。

在有氧的条件下，亚硝化细菌群将氨氮转化亚硝酸氮，硝化细菌群将亚硝酸氮转化硝酸氮，两者常生长在一起。

硝化细菌分离比较困难，由于它生长缓慢，平均代时10-20h以上，且不同菌株间差异较大。

亚硝化菌单细胞杆状以单根极生鞭毛运动，无荚膜，革兰氏阴性严格好氧，在有机培养基不能生长，能利用CO2唯一碳源。

菌落以小圆淡黄色为主，个别呈无色或乳白色。

个别菌株为球状，无鞭毛。

氨转化为亚硝酸盐过程中获得能量。

硝化细菌单细胞杆状不运动好气在有机培养基不能生长，能利用CO2唯一碳源。

亚硝酸细菌用格里斯试剂检测，呈现红色；硝酸细菌用二苯胺检测，呈现蓝色。

2.亚硝化细菌培养基配置：
2.1.富集培养基的配置：
硫酸铵2g/l，氯化钠0.3g/l，硫酸铁0.03g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，硫酸镁0.03g/l，碳酸氢钠1.6g/l，pH7.2。

将该培养基在0.1MPa下灭菌30min。

2.2.分离培养基的配置:
硫酸铵0.5 g/l，氯化钠2g/l，硫酸铁0.4g/l，磷酸氢二钾1.0g/l，硫酸镁0.5g/l，碳酸钙5g/l，pH7.2。

将该培养基在0.1MPa下灭菌30min。

亚硝化细菌固体分离培养基:在上述亚硝化细菌分离培养基中加入质量分数为2%的琼脂。

3.实验方法:
3.1.亚硝酸细菌的富集培养
将2mL活性污泥加入装有80m L富集培养基的300mL锥形瓶中，在30℃、130r/min的条件下振荡培养, 每隔几天取样, 采用格里斯试剂检验亚硝酸盐的生成情况, 呈现红色表示有亚硝酸盐存在, 然后移取1mL富集培养液接入新鲜富集培养基, 继续培养并进行上述测试。

经几次重复操作, 不断淘汰其他异养菌。

3.2.亚硝酸细菌的分离培养：
将1mL上述富集培养液涂布于固体分离培养基平板上,在30℃的培养箱中培养7～10d，得到单菌落，再进一步纯化获得纯菌落，对纯菌落尽心编号，置于4℃冰箱中保存，备用。

3.3.亚硝化细菌的活性：
取分离出的菌株，以20%的接种量接种于富集培养基中，通过氨氮去除率或亚硝酸盐氮的质量浓度来考察亚硝化细菌的活性。

3.4.亚硝化细菌的诱变育种：
3.4.1.诱变育种:
是选合适的诱变因素、处理剂量及处理方法，人为地对出发菌株进行诱变处理，然后运用合理的筛选程序及适当的筛选方法把优良的变异菌株筛选出来。

首先，通过诱变雨中可以提高产物的产量，即可以获得高产突变株。

其次，通过诱变育种可以改善菌种特性、提高产品质量。

减少或去除发酵副产物的生成量既可以提高产品质量，又可以简化产品分离提取工艺，降低成本。

第三，通过诱变育种可以选育出更合适于工业化发酵要求的突变株，简化工艺条件。

第四，通过诱变育种可以开发新产品
3.4.2.诱变因素:
3.4.2.1.物理诱变因素：紫外线（UV），X射线和γ射线，快中子（电离辐射）
3.4.2.2.化学诱变因素：碱基类似物，烷化剂，移码诱变剂，脱氨剂，羟化剂
3.4.2.3.生物诱变因素：转位因子（位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的DNA序列）
3.4.3.诱变剂的选择：
诱变剂亚硝基胍和甲基磺酸乙酯由于多数是引起碱基对的转换，得到的突变株的回复变率高，且化学试剂对人体有一定的伤害性。

而能引起缺失、码组移动，巨大损伤的电离辐射、紫外线和吖啶类等诱变剂，则不易产生回复突变。

其中紫外线（UV）作为诱变剂在实验操作中是最为经济简便的。

因此本次实验操作选用UV法进行诱变育种。

3.5.紫外诱变育种的实验方法：
3.5.1.紫外诱变的机理：
①紫外诱变有效范围是200-300nm，其中以260nm左右效果最好，作用光谱与核酸的吸收光谱一致，所以DNA容易受紫外的影响。

②DNA强烈吸收紫外线，尤其是嘧啶比嘌呤对紫外更敏感，引起了DNA分子内和分子间的交联，形成二聚体和水合物。

其中胸腺嘧啶二聚体的形成对生物活性改变研究最多。

③紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。

二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变死亡。

在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。

但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。

3.5.2紫外诱变的操作方法
3.5.2.1.菌悬液的制备：取纯菌种，用10ml无菌生理盐水将菌落洗下，倒入一支无菌大试管中，振荡30s，打散菌块。

离心（3000r/min，10min），弃去上清液，用无菌生理盐水将菌体洗涤2-3次，制菌悬液。

用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度107个/ml。

3.5.2.2.平板制作：将富集培养基融化，倒平板，凝固后使用。

3.5.2.3.紫外线处理：将开关打开预热约20min，取直径6cm无菌平皿3套，分别加入菌悬液3ml，放入一根无菌搅拌棒，将平皿置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离为30cm，功率为15w的紫外灯下分别照射1min，3min，3.5min。

3.5.2.
4.稀释：用10倍稀释法将菌悬液在无菌水中稀释10-1-10-6。

3.5.2.5.涂平板：取10-4-10-6稀释度来涂平板，每一个稀释度涂3套，以同样操作，取未处理菌液稀释涂布平板作对照。

3.5.2.6.培养与鉴定：置37℃，培养48h，在培养好的菌落上滴加格里斯试剂，测量红色光圈的深浅程度，红色光圈的直径。

选取颜色最深，直径最大的诱变菌种进行再次培养，得到高产的亚硝酸菌。

4.亚硝酸菌的活力测定：
硝化速率的测定：将纯化菌株和UV诱变后的菌株分别接种于液体培养基中，28-30℃黑暗培养10d，设立零对照即不加任何细菌的培养液对照和大肠杆菌对照。

采用纳氏试剂比色法测量培养基中氨氮的量，420nm下测量其吸光度。

硝化率（mg/L.d）=（零对照氨氮浓度—实验组氨氮浓度）/时间。