固定化酶的制备
固定化酶的化学制备方法
固定化酶的化学制备方法固定化酶是指将酶在一定条件下固定在某种多肽或多糖材料中，使其具有较高的稳定性和重复使用性。
固定化酶制备方法有很多种，下面就简单介绍一下常用的几种方法。
第一种是物理固定化法。
这种方法是通过将酶分子与载体材料表面的静电作用、氢键作用等力量结合在一起，从而实现酶的固定化。
常用的物理固定化方法包括吸附、沉淀、共价键等把酶与载体结合在一起。
吸附法是一种较简便、经济的酶固定化方法，但稳定性较差，适用于临时使用。
沉淀法是一种先定制载体材料，再将酶溶液与载体材料混合沉淀制成的固定化方法，能增强酶的稳定性。
共价键法则通过选择适当的交联剂将酶与载体基质之间形成强化学键，形成高度稳定的固定化酶。
第二种是化学固定化法。
这种方法是以某种化学反应方式将酶与载体结合，常见的方法有选择性基团反应和交联剂交联反应两种方法。
选择性基团反应是先在载体表面引入一些特定的官能团，再通过这些官能团再将酶基质固定在载体上，这种方式可以提高酶的活性和稳定性。
交联剂交联反应则是将酶与载体结合的过程中，通过交联剂，形成交联的结构，这种方法稳定性较高、经济实用，但固定化酶的活性较低，不适用于活性较高的酶。
第三种是生物固定化法。
生物固定化法是通过生物体系的作用将酶基质固定在载体材料上，这种方式主要适用于多肽、多糖等含有复杂生物结构的材料。
这种方法优点是酶的活性和特异性较高，但固定化酶的稳定性一般较差。
以上三种方法都可以用来制备固定化酶，不同的固定化方法适用于不同的酶类型、活性、载体材料等。
在实际制备过程中，需要根据实际情况选取相应的方法，以获得稳定和活性高的固定化酶。
制备固定化酶实验报告
一、实验目的1. 了解固定化酶的概念、原理及其在生物催化领域的应用。
2. 掌握固定化酶的制备方法，提高实验操作技能。
3. 通过实验，了解固定化酶的催化活性、稳定性及重用性能。
二、实验原理固定化酶是指通过物理或化学方法将酶固定在固体载体上，使其在催化反应中保持酶活性的一种技术。
固定化酶具有以下优点：1. 提高酶的稳定性，延长使用寿命；2. 方便酶的回收和重复利用；3. 易于控制反应条件，提高催化效率。
固定化酶的制备方法主要有吸附法、包埋法和结合法。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：纤维素、琼脂糖、聚丙烯酰胺、酶、底物、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、烘箱、恒温水浴锅、显微镜、酶标仪等。
四、实验步骤1. 吸附法固定化酶（1）将纤维素或琼脂糖溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与纤维素或琼脂糖溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
2. 包埋法固定化酶（1）将聚丙烯酰胺溶解于缓冲液中，配制成一定浓度的溶液。
（2）将酶溶液与聚丙烯酰胺溶液混合，搅拌均匀。
（3）将混合液倒入培养皿中，置于烘箱中干燥，形成凝胶。
（4）将凝胶用离心机离心，去除未固定的酶。
（5）将固定化酶洗涤、干燥，备用。
3. 结合法固定化酶（1）将酶蛋白分子与不溶性固相支持物（如离子交换树脂）进行离子键结合。
（2）将结合后的酶蛋白分子与底物反应，观察催化效果。
五、实验结果与分析1. 吸附法固定化酶：通过吸附法固定化酶，酶的活性保持较好，但固定化酶的稳定性较差，易受外界环境因素影响。
2. 包埋法固定化酶：通过包埋法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，但固定化酶的催化效率较低。
3. 结合法固定化酶：通过结合法固定化酶，酶的活性保持较好，稳定性较高，且催化效率较高。
六、实验结论1. 固定化酶的制备方法有吸附法、包埋法和结合法，各方法有其优缺点。
固定化酶技术及应用的研究进展
固定化酶技术及应用的研究进展一、固定化酶的制备方法研究进展固定化酶的制备方法包括物理吸附、共价键结和交联结构等。
近年来，研究者们发展了一系列新型的固定化酶制备方法，如钙凝胶法、包埋法、凝胶微球法和溶胶凝胶法等。
这些新方法不仅提高了固定化酶的稳定性和活性，还大幅度降低了制备成本，提高了酶的重复使用性。
固定化酶在生物工程领域的应用主要集中在酶催化反应、生物催化剂制备以及生物催化剂的应用等方面。
例如，固定化酶可以用于生物反应器中进行酶催化反应，实现对废水处理、医药合成和食品工业等的高效处理。
此外，固定化酶还可以用于制备各类生物催化剂，如药物微胶囊和生物传感器，用于治疗疾病和检测生物分子。
固定化酶在食品工业中的应用主要包括生产酶制剂、降解保健食品、生产高价值添加物以及改善食品品质等方面。
固定化酶可以用于生产各类酶制剂，如发酵酶、复合酶和水解酶等，以加速酶催化反应。
此外，固定化酶还可以用于生产特殊功能食品，如降解保健食品、胶原蛋白等，以满足不同人群的需求。
固定化酶在医药学领域的应用主要包括药物制剂、生物芯片、药物代谢和生物传感器等方面。
例如，固定化酶可以用于制备缓控释药物制剂，以提高药物的疗效和降低副作用。
此外，固定化酶还可以用于制备生物芯片，用于分析疾病标志物和药物代谢产物等。
固定化酶在环境保护领域的应用主要包括废水处理、大气污染控制和土壤修复等方面。
固定化酶可以用于废水处理中，加速有害物质的降解和去除。
此外，固定化酶还可以用于大气污染控制，将有害气体转化为无害物质。
固定化酶还可以用于土壤修复，加速土壤中有毒物质的降解和去除。
综上所述，固定化酶技术在多个研究领域取得了重要的进展。
通过不断创新和改进固定化酶制备方法，研究者们加强了固定化酶的稳定性和重复使用性，提高了酶的应用效果和利用价值。
固定化酶技术的进一步发展，将为生物工程、食品工业、医药学和环境保护等领域带来更多创新和突破。
固定化酶法生产l-氨基酸制作流程
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固定化酶的方法
固定化酶的方法
固定化酶是将酶固定在载体上，形成固定化酶，具有高效、稳定、重复使用等优点。
下面是一种常用的固定化酶方法。
材料：
- 酶
- 载体（如聚丙烯脂、硅胶、玻璃等）
- 活性剂（如戊二醛、双醛、聚乙二醇等）
- 缓冲液（如PBS缓冲液）
- 洗涤液（如去离子水或PBS缓冲液）
步骤：
1. 制备载体：将载体清洗干净并消毒，然后在室温下干燥或烘干。
2. 固定化酶：将制备好的载体浸泡在含有活性剂的缓冲液中，搅拌均匀。
然后加入适量的酶，搅拌均匀并放置一段时间（根据不同的活性剂和载体类型，时间不同）。
最后用洗涤液洗净固定化酶。
3. 检测固定化酶活性：采用适当的方法检测固定化酶的活性，如比色法、荧光法等。
4. 贮存固定化酶：将固定化酶保存在干燥、阴凉、密闭的容器中，避免受潮和受热。
注意事项：
1. 活性剂的选择应根据酶的特性和载体的特点进行选择。
2. 固定化酶活性与载体、活性剂、酶的比例等因素有关，需要进行优化实验。
3. 贮存时要避免温度过高或过低，否则会影响固定化酶的稳定性和活性。
以上是一种常用的固定化酶方法，具体操作时应根据实验要求和条件进行调整。
固定化胰蛋白酶的制备研究
固定化胰蛋白酶的制备研究
一、背景介绍
固定化酶技术是指将酶固定在载体上，形成固定化酶，以提高其稳定
性和重复使用性。
胰蛋白酶是一种重要的消化酶，常用于医药和食品
工业中。
因此，制备固定化胰蛋白酶具有重要的应用前景。
二、制备方法
1. 固定化胰蛋白酶的载体选择：常用的载体有凝胶、纤维素、硅胶等。
其中凝胶是最常用的载体。
2. 固定化方法：包括物理吸附、共价键结合和交联等方法。
其中，共
价键结合法是最常用的方法。
3. 制备步骤：
（1）将选好的载体与活性胰蛋白酶混合；
（2）加入交联剂进行交联反应；
（3）去除未固定的胰蛋白酶和交联剂；
（4）测定固定化后的活性。
三、影响因素
1. pH值：pH值对于固定化后的活性有较大影响，一般选择pH 7.0-8.0为最佳条件。
2. 温度：温度也是影响固定化后活性的重要因素。
一般情况下，选择
40℃为最佳条件。
3. 固定化时间：固定化时间对于固定化后的活性也有影响。
一般情况下，选择1-2小时为最佳条件。
四、应用前景
固定化胰蛋白酶具有较好的应用前景。
在医药领域，可以应用于制备消化酶剂和治疗胰腺疾病；在食品工业中，可以应用于酿造、发酵等过程中的蛋白水解反应。
五、总结
固定化胰蛋白酶的制备是一项重要的技术，在医药和食品工业中具有广泛的应用前景。
其制备方法包括载体选择、固定化方法和测定固定化后活性等步骤。
同时，pH值、温度和固定化时间等因素也对其活性产生影响。
第五章酶的固定化ppt课件
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概念
固定化酶是指固定在载体上并在一定的 空间范围内进行催化反应的酶。固定化酶既 保持了酶的催化特性，又克服了游离酶的不 足之处，具有增强稳定性，可反复或连续使 用以及易于和反应产物分开等显著特点。直 接固定菌体或菌体碎片的，称为固定化菌体 或固定化死细胞。
（2）半透膜包埋法 将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小
球内，制成固定化酶. 制备方法： 酶， 水， 乙二胺
癸二酰氯+氯仿
包埋法 优点：结合力牢、活力回收高、底物专一性不变。
缺点：制备较难，载体无法回收、扩散限制。
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三 固定化酶的性质
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固定化酶的四种方法[整理版]
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1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。
通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。
因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。
通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。
物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。
从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。
该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。
离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。
该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可以得到较高活性的固定化酶。
采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。
2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。
常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
3载体结合法最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。
在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。
参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。
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固定化酶制备及酶活力测定实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20实验指导：易喻摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。
酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。
本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。
结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
关键词：固定化酶酶活力包埋法Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity.前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。
与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。
依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。
其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。
所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。
分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。
它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。
酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。
正文：1.实验过程1.1试剂与仪器1.1.1试剂①海藻酸钠、3.0%氯化钙②碱性蛋白酶（1.0mg/mL）③福林试剂④1%酪蛋白溶液⑤PH10缓冲液⑥标准酪氨酸溶液⑦0.4mol/L碳酸钠溶液，0.4mol/L三氯醋酸溶液1.1.2仪器①磁力搅拌器②恒温水浴锅③注射器④烧杯（100mL,500mL）⑤布氏漏斗⑥分析天平⑦容量瓶⑧移液管⑨721分光光度计1.2操作步骤1.2.1酶的固定化称取1.00g海藻酸钠于盛有30mL蒸馏水的烧杯中，加热至沸腾完全溶解后，放置室温渐冷却至38℃左右，加入预先制备好的碱性蛋白酶溶液20mL。
用注射器抽取海藻酸钠－酶混合物，将混合物缓慢滴入盛有200mL3.0％氯化钙溶液的烧杯中，同时烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，滴完后静置硬化30min，倾去氯化钙溶液，用适量蒸馏水洗涤2-3次，除去漂浮的空化珠状颗粒后，即制备得到固定化的碱性蛋白酶。
1.2.1酶活力的测定1.2.1.1制备酪氨酸标准曲线(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
（见下表）(2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1mL，于40℃水浴中保温15 min，取出后，加入0.4 mol/L三氯醋酸3 mL，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
(3)分别吸取滤液1mL放入另7支试管中，加入0.4 mol/L碳酸钠溶液5 mL，福林试剂1mL，充分摇匀，于40℃水浴中保温15 min，然后于每管中各加入3 mL蒸馏水，充分摇匀。
(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680 nm处测定光密度。
(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
试管编号酪氨酸含量（μg）1㎎/mL酪氨酸标准溶液（mL）蒸馏水( mL )0 1 2 3 4 5 6 01002003004005006000.10.20.30.40.50.62.01.91.81.71.61.51.41.2.2固定化酶活力测定上述固定化的蛋白酶或相当量的游离蛋白酶（20 mL）置于盛有20 mL pH 10缓冲液的三角瓶中，加20 mL 1%酪蛋白溶液，于40℃水浴保温15min后，取3 mL置于试管中，加3 mL三氯醋酸溶液。
对照管为1 mL 缓冲液＋1 mL 蛋白酶液＋3 mL 三氯醋酸溶液＋1 mL 1%酪蛋白溶液（顺序不可颠倒），于40℃水浴保温15min 。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1mL ，加入0.4 mol/L 碳酸钠溶液5mL ，福林试剂1 mL ，充分摇匀，于40℃水浴保温15min ，然后每管各加入3 mL 蒸馏水，摇匀。
用721型分光光度计在波长680 nm 处，以对照管为对照，测定吸光值。
2.结果与讨论2.1结果2.1.1酪氨酸标准曲线的绘制表2-1酪氨酸含量与吸光度关系表 酪氨酸含量（微克） 0 100 200 300 400 500 600 吸光度 00.1180.2020.2680.3930.5630.600图2-2酪氨酸标准曲线y = 0.001x - 0.0045R 2= 0.974700.10.20.30.40.50.60.70100200300400500600700酪氨酸含量（微克）A 680n m舍去与拟合直线差距较大的点（500,0.563），再次拟合，得到的标准曲线线性较好。
图2-3酪氨酸标准曲线y = 0.001x + 0.0051R 2 = 0.991400.10.20.30.40.50.60.70100200300400500600700酪氨酸含量（微克）A 680n my=0.001x+0.00512.1.2酶活力的测定本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH 10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位（U ）。
本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算： 每克碱性蛋白酶的活力单位 = m / t ×fm ： 样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg ）； t ： 酶促反应的时间（15 min ）；f ： 酶的稀释倍数，本实验中f = 1000表2-4固定酶与游离酶活力的测定比较表2.2讨论2.2.1标准曲线的分析图2-2为将实验测得的六组数据绘制的标准曲线，拟合得到的R 2＜0.99，线性关系不是很理想，因此舍去了偏离直线较远的点（500，0.563）,得到图2-3，线性关系良好。
部分数据与直线偏离较远，可能是由于比色皿没有洗干净,水浴保温时每管的水浴时间不一样等其它原因。
标准曲线是为了计算酪氨酸含量的，标准曲线越标准，计算出来的数据才有意义，如果线性不好的话，会对结果造成影响。
酶量（毫克） OD 值 酪氨酸量（微克） 碱性蛋白酶活力单位(U) 酶结合效率（%） 空白1.0 0.000 0.0 0.00 58.06%固定酶 1.0 0.269 263.9 17593.33 17626.671.00.270 264.9 17660.00 游离酶 1.00.455 449.9 29993.33 30360.00 1.00.466460.930726.672.2.2酶活力的分析表2-4为酶活力的测定以及比较。
由表中数据分析得：固定酶的酶活力要低于游离酶的酶活力，说明在酶固定的过程中有部分酶的损失。
并且从表中可发现相同酶的两组OD值还是有差距的，尤其是游离酶的两组实验数据的差距比较大，可能是在实验的过程中保温时间控制的不好，没有及时加入三氯醋酸。
实验结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。
3.注意事项与心得总结3.1注意事项①酶液与加热溶解的海藻酸钠混合时，海藻酸钠溶液一定要冷却至40℃以下后再加入酶液，以免高温导致碱性蛋白酶酶失活。
②固定化酶颗粒制备中，海藻酸钠－酶混合物向CaCl2溶液滴加的速度不要过快，混合物要呈颗粒进入CaCl2溶液，以免形成念珠状颗粒。
③在制备酶活力测定的空白对照时要先加入三氯醋酸使酶失活，再加入酪蛋白溶液，顺序不可以颠倒。
④在酶活力测定是要严格控制水浴保温的时间一致，控制变量，减少实验误差。
3.2心得总结本实验通过包埋法进行了固定化酶的制备及固定酶与游离酶的酶活力比较，发现固定酶虽然能够增强酶的稳定性，便于酶和底物的分离，但是会造成酶量的损失，使酶活力降低。
所以需要寻求一种能提高酶结合率的固定方法。
本实验仅单纯的对游离酶和固定酶的酶活进行了比较，还可以设计系列实验对固定酶的其它性质如最适温度，最适PH等进行研究。
致谢：感谢队友们的合作以及易喻老师的耐心指导！参考文献：[1]固定化酶的制备及应用[期刊论文] 李彦锋, 李军荣, 伏莲娣, LI Yan-feng, Li Jun-rong, FU Lian-di - 《高分子通报》2001年2期[2]黑曲霉果胶酯酶固定化前后酶学性质比较研究[期刊论文] 张庆坤, LEI Ji, 付亚敏, FAN Yang, 刘刚, ZHANG Qing-kun, LEI Ji, FU Ya-min, FAN Yang, LIU Gang - 《食品工业科技》2008年7期。