细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定
细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库

的构建及鉴定

(作者:_________ 单位:____________邮编:____________ )

作者:吕刚,芦亚君,范志刚,史大中,王虎,韩秀

【摘要】目的:构建细粒棘球绦虫(E.g.)成虫全长cDNA质粒

文库,并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA应用SMAR方法构建pBluescript II SK 全长cDNA质粒文库,检测文库的重组率及容量;用载体克隆位点两端的引物进行PCR T增,检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5’端测序,归并unigene,计算unigene得率,全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%,库容量1.13 X 106 ;平均插入片段长度约为1.2kb。24 个随机阳性克隆测序,unigene比例为69.57%,全长性比率为

64.71 %。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库,文库质量良好。【关键词】细粒棘球绦虫;成虫;全长cDNA质粒文库;构建;鉴定

[ABSTRACT Objective: To con struct and evaluate full M Le ngth cDNA library of adult Echi no coccus gra nul osus

(E.g. ) . Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the con structi on of full 拟、le ngth cDNA library using SMARTpBluescript II SK kit. The recombination rate and capability of the library was measured and the length of insert fracti on of the positive recomb inant clones was tested by PCR. Positive recomb inant clones were ran domly selected for 5' end seque ncing and the rates of unigene, full 扌!):le ngth cDNA was analyzed by EST data using bioinformatics. Results: The

full 松丿:length cDNA libray of adult E.g. was constructed successfully.The recomb in ati on rate and capability of the library were 95.04% and 1.13 x 106, respectively.The average len gth of insert fracti on was about 1.2kb.

24 recomb inant clones ran domly selected were seque need, the rate of unigene and full 拟le ngth cDNA were 69.57% and 64.71%. Con clusio ns: A high 拟quality of full Mlength cDNAplasmid library of adult E.g. has bee n con structed successfully.

[KEY WORDS Echinococcus granulosus;Adult;

Full 拟length cDNA plasmid library; Construction; Evaluation

细粒棘球绦虫(Echi nococcus granu losus , E.g.)成虫寄生于犬科动物

小肠,其中绦期幼虫细粒棘球蚴(包虫,echi nococcus cyst/hydatid cyst )寄生在中间宿主偶蹄类家畜(羊、牛、马等)

及人的多种器官、组织内,引起以占位性病变为主要临床表现的囊型包虫病(cystic echinococcosis ,CE,是一种严重危害人类健康和畜牧业生产的人畜共患寄生虫病。CE分布于世界许多国家的牧区,我国是CE的主要流行区之一,主要分布于西北牧区。CE是我国乃至

世界一个重要的公共卫生及经济问题 [1 ],已被列入我国十一五重大寄生虫病防治项目。疫苗及早期诊断是其防治的关键,目前尚无成熟的疫苗及诊断试剂。该虫的基因组学及功能基因组学尚未开展,已知

基因甚少,不利于对相关基础问题的研究,更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。

本研究目的在于通过构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库并对文库质量进行鉴定,为大规模表达序列标签(expressed seque nee tag,EST测序,开展基因表达谱分析,克隆和鉴定一批功能基因全长cDNA序列,并为开展重要基因的功能研究打下基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

E.g.成虫标本采自青海省西宁市人工感染犬小肠,用灭菌生

理盐水漂洗3次后液氮冻存。试剂:Trizol总RNA提取试剂盒、1 kb DNA

梯度标记物为GIBCO BRL公司产品;SMART IV寡核苷酸,CDS

HI/3JPCR 引物,pBluescript II SK 的改造载体(将EcoR I 和Not

I之间的序列改造为Sfi I A 和Sfi I B 接头序列),由上海联合基

因公司合成和提供;DH):5 a感受态菌,通用合成引物M13+/M13:, 异丙基拟B拟D):硫代半乳糖苷(IPTG)和x拟gal为上海生工生物工程技术有限公司产品;质粒抽提试剂盒,荷兰QIAGEN公司产品;DYEnamicTMET DYETerminator Kit (MegaBACETM为美国Amersham Biosciences产品;Milli拟Q水纯化系统,美国Millipore 公司产品;SpectraMax Plus384 连续波长酶标仪,美国Molecular Devices 公司产品;F^D;280电泳仪,上海复日公司产品;HYBAID PCR EXPRESS PCF仪,英国Thermo Hybaid公司产品;ABI PRISM 3700测序仪,美国PE ABI公司产品。

1.2方法

1.2.1全长cDNA质粒文库的构建

121.1 样品总RNA抽提及mRN纯化

按提取试剂盒操作说明书抽提总RNA产物,于260nm及280nm测

吸光度(A260及A280),计算A260/A280比值判定纯度(纯RNAA260/ A280=1.9-2.1),1.1%琼脂糖电泳检测RNA完整性。

根据QIAGEN^司的Oligotex mRNAKits操作说明书进行分

离,A260及A280检测及1.1%琼脂糖电泳检测抽提结果。

1.2.1.2 cDNA 第一链合成

0.5mL灭菌离心管中加入以下试剂:2卩g样品RNA 1卩L SMART IV Oligo nucleotide ,1 卩LCDS III/3 ' PCR Primer,加水补足5

卩L,混匀试剂并稍离心,72C温浴2min,冰浴2min,稍离心后加入下列试剂:2.0 卩L 5 x First 拟Strand Buffer , 1.0 卩L DTT (20mmol/L),1.0 卩L dNTP Mix (10mmol/L) , 1.0 卩L PowerScript Reverse Transcriptase ,总反应体系为10.0卩L,混匀试剂并稍离心,42 C温浴

1hr,将离心管置于冰上终止第一链合成。

1.2.1.3 LD PCR 扩增cDNA

将PCF仪预热至95C,反应管中加入下列试剂:2卩L cDNA第一链,80 卩L 去离子水,10 卩L 10x Advantage 2 PCRBuffer ,2卩L 50 x dNTP Mix 2 □ L 5' PCR Primer,2 L CDS III/3 ' PCR Primer,2 □ L 50 x Advantage 2 Polymerase Mix,总反应体系100 卩L。轻拍混匀,稍离心后置于已预热PCF仪,按下面程序开始PCR95C 1min,26cycles;95 C 15sec,68C 6min。循环结束后取5卩L 样品1.1% 琼脂糖电泳检测。

1.2.1.4 PCR产物纯化

合并LDU.PCF产物至0.5mL菌离心管中,加入2卩L蛋白酶K( 20 卩g/卩L),混匀试剂并稍离心,45 C温浴20min,离心,加入50卩L 去离子水,100卩L酚:氯仿:异戊醇抽提,17530X g离心5min,收集上层液体转移至另一干净离心管中,加入等体积的氯仿:异戊醇

混匀,离心5min,转移上层液体,加入1/10体积3mol/L乙酸钠, 2.5倍体

积95%室温乙醇,室温条件下立即17530X g离心20min,去上清,100卩L 80 %乙醇洗沉淀物,空气干燥约10min,加79卩L 去离子水溶解沉淀。

1.2.1.5 Sfi I 消化

0.5mL离心管中加入下列试剂:79卩L cDNA, 10卩L 10 x Sfi Buffer , 10 卩L Sfi I Enzyme , 1 L 100 x BSA 加去离子水补充体

积至100卩L。充分混匀,50C温浴2h。加2卩L 1%二甲苯胺染料。

121.6 cDNA 的分级分离

备11个收集管,700卩L缓冲液清洗spin拟400柱子后将酶切产

物约100卩L平稳加于胶层中间,直至产物全部渗到胶面下。加100 卩L 缓冲液使染料层下降数毫米,放置好第一收集管。加600卩L缓冲液并开始收集滴出液体,每管收集35卩L。合并第2?7管,拟.20C 乙醇沉淀过夜。17530X g离心20min,弃上清,室温干燥10min,加7 口 L去离子水溶解沉淀,1.1%琼脂糖电泳检测。

1.2.1.7 cDNA 与pBluescript II SK改良载体相连

反应管中加入下列试剂: 1.0卩L cDNA,1.0卩L Vector (25

ng/mL),1.0 卩L 10 x Ligation Buffer ,1.0 卩L ATP (10mmol/L),1.0 □ L T4 DNA Ligase,加去离子水 5.5 卩L 至10.0 卩L,16C PCR 仪上过夜。

1.2.1.8 重组质粒的转化

按常规方法取1卩L连接液转化200卩L感受态大肠埃希菌DH',5

a。

1.2.2文库质量的鉴定

1.2.2.1 质粒文库的容量及重组率

转化后的菌液涂布于15cm培养皿(Apr拟IPTG/x拟gal LB固体培

养基),37C过夜。计数菌落总数和蓝色菌落数,计算质粒文库的容量和重组率。重组率二(菌落总数拟蓝色菌落数)/菌落总数X 100% 库容量二菌落数X连接产物量。

1.222 插入片段大小

随机挑取12个阳性克隆,以通用载体引物M13+般PCR扩增,

扩增产物1.1%琼脂糖凝胶电泳,计算插入片段平均长度。

1.2.2.3 5 '端EST测序及测序结果的unigene、全长性判定随机挑取24个阳性克隆,送上海联合基因科技有限公司进行测序。>450bp的序列作为有效序列,使用Washington大学wU以blast 程序(2.0a19MP)对测序结果进行同源性分析。依据100bp 95%勺标准进行归并为unigene。通过与相关已知的对应基因的5'末端进行同源比较来判断全长性。

2结果

2.1全长cDNA质粒文库的构建

2.1.1总RNA抽提、纯化及鉴定

1.5g成虫样本共抽提获得总RNA469.4g,OD260 OD280 OD230 分别为58.68、27.18、23.51,OD260/OD280=

2.16 达到纯度要求,琼脂糖凝胶电泳显示3条清晰条带(图1),表明总RNA完整,符合建库要求。

2.1.2 mRNA 纯化

对所获RNA?行mRN纯化,终浓度为44.9ng/卩L,共获得8.98

卩g mRNA OD260 OD280 OD230分别为 1.125、0.499、0.535 ,

OD260/OD280=2.25得率为1.9%,符合建库要求。

2.1.3 cDNA合成、酶切及分级分离

合成第一链cDNA梯度扩增,反应产物琼脂糖电泳,约500?3 OOObp之间有一涂布均匀的DNA带谱(图2A),符合非哺乳动物RNA 分布范围。第一链经酶切及分级分离后琼脂糖电泳见图2B。

2.1.4 cDNA与pBluescript II SK* 改良载体连接及重组质粒转

定向插入cDNA片断(Sfi I A - Sfi I B )后,重组质粒转染感受态宿主菌,涂布于固体培养基培养,2个平板平均菌落数1128个,蓝斑56个。

2.2 cDNA文库质量评价

2.2.1文库的重组率及容量

该cDNA文库的重组率及库容量分别为95.04%、1.13 X 106。

2.2.2 cDNA文库的PCF鉴定

随机选取12个阳性克隆进行PCF鉴定,结果显示插入片段平均长度为1.2kb (图3)。

2.2.3 5 '拟EST测序、unigene归并及全长性分析

随机选取24个阳性克隆,5'端测序,去掉低质量及450bp以下的序

列、屏蔽掉载体序列后获得23条有效序列,有效序列unigene 归并,得到16 条unigene,unigene 比例为16/23 X 100%=69.56% 同时对序列进行全长分析,在23条序列中有17条序列有相关同源信息,结果为其中11条全长或可能全长,全长性比率为11/17 X 100%

=64.71 %

3讨论

CE作为重要的人畜共患寄生虫病,对人类健康以及畜牧业生产危害极大。但关于E.g.的基因组学研究尚未开展,到目前为止,在Gen Ba nk( NCB)中仅有该物种230多条全长核苷酸序列,若不包括重复序列,实际只有几十个基因的序列资料。这与CE在全球及我

国对人类健康及畜牧业生产的危害性不相匹配,不利于对相关基础问题的研究,更不利于相关疫苗、诊断试剂及药物的研究。而基因组研究需大量投入,在经费有限的条件下,构建全长cDNA文库是高效、

大规模获得基因全序列信息并开展功能基因组研究的一条有效途径

:2]。

自1994年首个全长cDNA文库构建以来]3],在全长cDNA 文库构建方面已经取得了很大的进展,已成为发现新基因和研究基因功能的基本工具,全长cDNA文库的构建方法也不断涌现,如CAPture 法[4]、Olig o 拟cap 拟pi ng 法[5]、SMART! [6]和Cap以jump ing 法[7]等等。以上方法均着眼于真核生物mRNA 5端的帽子结构,既有各自

的独到之处,但也均存在一定的缺陷,在文库构建时应根据实验目的和实验室的工作条件选择适合的构建方法。已有多种寄生虫

如疟原虫]8]、日本血吸虫]9]和华支睾吸虫[10]等通过构建全长cDNA文库开展功能基因组学研究。

全长cDNA文库构建技术的出现,客观上促进了人们对基因结构和功能的认识。所谓全长cDNA是指那些不仅包含完整的阅读框架,还拥有完整5'和3'端非编码区的cDNA全长cDNA文库的大多数克隆是全长的,因此能提供完整的mRNA!息,可通过基因序列比对获得mRNA?接信息,还可对蛋白质序列进行预测,及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等,大大提高基因测序和生物信息学分析及基因功能研究的进程[11]。此外,全长cDNA文库是高效、大规模获得基因序列信息的有效途径,尤其是对基因组庞大,近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说更是进行功能基因组研究的一条重要途径。

本课题应用SMAR袪构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库,鉴定结果表明文库质量良好,为后期大规模5' EST随机消减测序获得大量EST 和全长基因、丰富该物种的生物学信息,从中克隆、鉴定出一批重要的功能基因并开展该物种的功能基因组学研究奠定了基础。

【参考文献】

1李雍龙.人体寄生虫学[M.第6版.北京:人民卫

生出版社,2006.157拟158.

2 Suzuki Y, Yoshitomo 拟Nakagawa K, Maruyama K, et al. Con structi on and characterizati on of a full le ngth Hen riched and a 5'拟end拟enriched cDNA library [ J ] . Gene, 1997, 200(1 拟2): 149 拟156.

3 Kato S, Sekine S, OhSW,et al. Construction of a human full 拟length cDNA bank : J] . Gene, 1994, 150(2):243 拟250.

4 Edery I, Chu LL, Sonenberg N, et al. An efficient

strategy to isolate full 拟、le ngth cDNAs based on an mRNA cap retention procedure (CAPture) [ J ] . Mol Cell Biol, 1995,

15(6):3363 拟3371.

5 Suzuki Y, Suga no S. Con structi on of a full 拟le ngth enriched and a 5 ' t^end enriched cDNA library using the oligo 拟capping method [ J ] . Methods Mol Biol, 2003, 221(1):73 拟91.

6 Zhu YY, Machleder EM, Chenchik A, et al. Reverse

tran scriptase template switchi ng: a SMART approach for

full 拟length cDNA library construction [ J ] . Biotechniques, 2001,3(4):892 拟897.

7 Carninci P, Kvam C, Kitamura A, et al.

High 拟efficiency full 拟length cDNAcloning by biotinylated CAP

trapper [J] . Genomics, 1996, 37(3): 327 拟336.

8 Shibui A, Shiibashi T, NogamiS, et al. A novel method for developme nt of malaria vacc ines using full 拟Je ngth cDNA libraries : J ] . Vaccine, 2005, 23(34):4359 拟4366.

9苑纯秀,冯新港,林矫矫,等.日本血吸虫(中国大陆株)虫卵全长cDNA文库的构建及分析]J].中国预防兽医学报,2006,28 (1) :109 拟112.

10陈守义,余新炳,徐劲,等.华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选]J].中国热带医学,2003, 3 (3): 282拟284.

11 Carni nci P, Shibata Y, Hayatsu N, et al.

Normalization and subtraction of cap拟trapper 拟selected cDNAs to

prepare full fUle ngth cDNA libraries for rapid discovery of new genes [ J ] . Genome Res, 2000, 10(10): 1617 拟1630.

绦虫习题

绦虫习题 一、选择题 1. 关于绦虫形态描述,错误的是( ): A.无消化道 B.虫体分节 C.雌雄异体 D.虫体背腹扁平 E.头节有吸盘或吸槽等固着器官 2. 绦虫的成虫均寄生于脊椎动物的( ): A.肌肉 B.肺脏 C.脑部 D.小肠 E.大肠 3. 绦虫成虫有( ): A.口和消化道 B.无口和消化道 C.有口无消化道 D.无口无消化道 E.有口无肛 4. 祖国医学中记载的寸白虫是指( ): A.蛲虫 B.细粒棘球绦虫 C.犬复孔绦虫 D.猪带绦虫和牛带绦 E.微小膜壳绦虫 5. 细粒棘球绦虫对人体的感染阶段是( ): A.囊尾蚴 B.六钩蚴 C.虫卵 D.棘球蚴 E.成虫 6. 确诊带绦虫病的诊断方法是( ): A.粪便直接涂片法 B.饱和盐水漂浮法 C.水洗沉淀法 D.观察孕节子宫侧支 数 E.活组织检查法 7. 确诊脑囊虫病的最有效方法是( ): A.脑电图 B.脑室造 C.脑脊液的免疫学试 D.X线扫描 E.脑部CT 8. 细粒棘球绦虫病传染源下列错误的是( ): A.狼 B.羊 C.豺 D.牧犬 E.家犬 9. 牛带绦虫对人体的感染阶段是( ): A.虫卵 B.似囊尾蚴 C.钩球蚴 D.棘球蚴 E.囊尾蚴 10. 在治疗前确诊为猪带绦虫病的依据可以找到( ): A.头节 B.囊虫 C.虫卵 D.六钩蚴 E.成节 11. 预防猪带绦虫感染的关键是( ): A.粪便管理 B.取消连茅圈 C.肉类检 D.治疗病人 E.不吃生的或未煮熟的猪肉 12. 棘球蚴砂是指囊液内含有( ): A.原头蚴、生发囊、子囊和虫卵 B.石灰小体 C.只有生发囊 D.只有子囊 E. 原头蚴、生发囊、子囊 13. 猪带绦虫对人体的主要危害是( ): A.小钩和吸盘对肠壁的刺激 B.吸收大量的营养 C.代谢产物毒素作用 D. 六钩蚴穿过组织时的破坏作用 E.囊尾蚴寄生组织器官所造成的损害 14. 棘球蚴病的病原体来自下列何种有细粒棘球绦虫成虫寄生的动物( ): A.犬 B.羊 C.猪 D.马 E.牛 15. 链状带绦虫的卵内含有( ): A.尾蚴 B.毛蚴 C.卷曲幼 D.六钩蚴 E.钩球蚴 16. 猪带绦虫病确诊的依据是( ): A.粪便中查到带绦虫卵 B.粪便中发现链状带绦虫孕节 C.皮下触到囊虫结节

细粒棘球绦虫病(包虫病)

棘球蚴病(echinococcosis)是由棘球绦虫的幼虫寄生于人兽体内引起的疾病,俗称包虫病(Hydatidosis)。我国有由细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的幼虫引起的囊型包虫病(cystic echinococcosis)和多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的幼虫引起泡型包虫病(alveolar echinococcosis)。我国以囊型包虫病为主,目前21个省(市、区)报道有原发性人、畜包虫病及家、牧犬细粒棘球绦虫感染。流行区主要分布于西部、北部和西北的牧区和农牧区,以西藏、青海、四川、新疆、甘肃、宁夏、内蒙和云南等省(自治区)最为严重。由于流行广泛,宿主丰富,地理生态复杂,分布于我国的细粒棘球绦虫可能存在不同的株型。泡型包虫病又被称为“虫癌”,是高度致死的疾病,患者不经治疗,10年死亡率可达90%。主要流行于西藏、青海、四川、宁夏、甘肃、新疆的部分地区。我国是世界上包虫病高发的国家之一,重要的流行国家尚有东亚的蒙古,中亚的土耳其、土库曼斯坦,西亚的伊拉克、叙利亚、黎巴嫩,南美的阿根廷、巴西、智利,大洋洲的澳大利亚,以及非洲北部、东部和南部的一些国家。其他人体棘球蚴病的病原体还有少节棘球绦虫(E. oligarthrus)和伏氏棘球绦虫(E. vogeli),目前我国没有这两种虫体。 一、病原 (一)形态 1. 细粒棘球绦虫 (1)成虫:眼观乳白色,长度为2~11mm,多数在5mm以下。显微镜下观察,虫体由4~6个节片组成,最前端为头节,其后为颈节,后接链体,根据生殖器官发育程度链体又分为幼节、成节和孕节。头颈部呈梨形,有顶突和4个吸盘,顶突上有大小相间的呈放射状排列的两圈小钩共28~48个。吸盘圆形或椭圆形,平均直径0.014mm。幼节仅见生殖基。成节内有雌雄生殖器官各一套,生殖孔开口于节片一侧的中部或偏后,睾丸45~65个,分布于生殖孔水平线的前后方。孕节长度占虫体全长的1/2,几乎被充满虫卵的子宫所占据,子宫向两侧伸出不规则的分支,子宫有侧囊是细粒棘球绦虫的特征,子宫内含虫卵200~800个。

细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建及鉴定

细粒棘球绦虫成虫全长cDNA质粒文库 的构建及鉴定 (作者:_________ 单位:____________邮编:____________ ) 作者:吕刚,芦亚君,范志刚,史大中,王虎,韩秀 【摘要】目的:构建细粒棘球绦虫(E.g.)成虫全长cDNA质粒 文库,并检测文库质量。方法:提取E.g.成虫mRNA应用SMAR方法构建pBluescript II SK 全长cDNA质粒文库,检测文库的重组率及容量;用载体克隆位点两端的引物进行PCR T增,检测插入片段大小。随机挑选阳性重组克隆5’端测序,归并unigene,计算unigene得率,全长性判定主要根据同源全长基因5'末端进行比较判定并计算全长率。结果:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库。文库的重组率为95.04%,库容量1.13 X 106 ;平均插入片段长度约为1.2kb。24 个随机阳性克隆测序,unigene比例为69.57%,全长性比率为 64.71 %。结论:成功构建E.g.成虫全长cDNA质粒文库,文库质量良好。【关键词】细粒棘球绦虫;成虫;全长cDNA质粒文库;构建;鉴定 [ABSTRACT Objective: To con struct and evaluate full M Le ngth cDNA library of adult Echi no coccus gra nul osus

(E.g. ) . Methods:mRNA was extracted from the adult E.g. and used for the con structi on of full 拟、le ngth cDNA library using SMARTpBluescript II SK kit. The recombination rate and capability of the library was measured and the length of insert fracti on of the positive recomb inant clones was tested by PCR. Positive recomb inant clones were ran domly selected for 5' end seque ncing and the rates of unigene, full 扌!):le ngth cDNA was analyzed by EST data using bioinformatics. Results: The full 松丿:length cDNA libray of adult E.g. was constructed successfully.The recomb in ati on rate and capability of the library were 95.04% and 1.13 x 106, respectively.The average len gth of insert fracti on was about 1.2kb. 24 recomb inant clones ran domly selected were seque need, the rate of unigene and full 拟le ngth cDNA were 69.57% and 64.71%. Con clusio ns: A high 拟quality of full Mlength cDNAplasmid library of adult E.g. has bee n con structed successfully. [KEY WORDS Echinococcus granulosus;Adult; Full 拟length cDNA plasmid library; Construction; Evaluation 细粒棘球绦虫(Echi nococcus granu losus , E.g.)成虫寄生于犬科动物

相关文档
最新文档