骨髓间充质干细胞向肝样细胞的诱导及分化
干细胞共培养的方法及其分化诱导_王珊青
ＣＲＴＥＲ复旦大学附属中山医院整形外科，上海市２０００３２王珊青★，女，１９８３年生，江苏省南京市人，汉族，２００７年复旦大学医学院毕业，硕士，住院医生，主要从事组织工程软骨方面的研究。
ｗｓｑｙｖｏｎｎｅ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ通讯作者：徐剑炜，主任医师，复旦大学附属中山医院整形外科，上海市２０００３２ｊａｍｅｓｗａｙ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ中图分类号：Ｒ３９４．２文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－８２２５（２００７）１１－０２１２２－０４收稿日期：２００６－１２－０７修回日期：２００７－０２－０１（０６－５０－１２－８８３１／ＺＳ・Ｑ）干细胞共培养的方法及其分化诱导★王珊青，徐剑炜Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎＡｂｓｔｒａｃｔＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｉｎｔｏｔｈｏｓｅｋｉｎｄｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｔｏｒｅｖｉｅｗｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＤＡＴＡＳＯＵＲＣＥＳ：ＴｈｅｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｉｎＰＵＢＭＥＤｂｅｔｗｅｅｎＪａｎｕａｒｙ１９９０ａｎｄＮｏｖｅｍｂｅｒ２００６ｕｓｉｎｇｃｏｍｐｕｔｅｒｗｉｔｈｔｈｅｋｅｙｗｏｒｄｓｏｆ＂ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｃｏｃｕｌｔｕｒｅ＂ｉｎＥｎｇｌｉｓｈ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｔｈｅｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｄｉｎＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌＦｕｌｌ－ｔｅｘｔＤａｔａｂａｓｅ（ＣＪＦＤ）ｂｅｔｗｅｅｎＪａｎｕａｒｙ１９９０ａｎｄＮｏｖｅｍｂｅｒ２００６ｗｉｔｈｔｈｅｓａｍｅｋｅｙｗｏｒｄｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅ．ＳＴＵＤＹＳＥＬＥＣＴＩＯＮ：Ｆｉｒｓｔｔｒｉａｌｗｉｔｈｔｈｅｄａｔａｗａｓｇｏｔｔｅｎ，ａｎｄｔｈｅｃｉｔａｔｉｏｎｓｏｆｅｖｅｒｙｒｅｆｅｒｅｎｃｅｗｅｒｅｃｈｅｃｋｅｄ．Ｉｎｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ：Ｔｈｅａｒｔｉｃｌｅｓｔｈａｔｒｅｌａｔｅｄｔｏｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｅｒｅａｄｏｐｔｅｄ．Ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ：ＲｅｐｅｔｉｔｉｖｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｒＭｅｔａａｎａｌｙｓｉｓａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｅｘｃｌｕｄｅｄ．ＤＡＴＡＥＸＴＲＡＣＴＩＯＮ：Ｔｏｔａｌｌｙ４０ｒｅｌａｔｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄ，ａｎｄ３０ａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅａｃｃｏｒｄｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｌｕｓｉｖｅｃｒｉｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ１０ｅｘｃｌｕｄｅｄａｒｔｉｃｌｅｓｗｅｒｅｏｌｄｏｒｒｅｐｅａｔｅｄｏｎｅｓ．Ｉｎｔｈｅｓｅ３０ａｒｔｉｃｌｅｓ，ｔｈｅｙｄｉｓｃｕｓｓｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｏｆｃｅｌｌｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｐａｒａｃｒｉｎｅａｃｔｉｏｎｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｃｅｌｌｓａｎｄｃｅｌｌｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｄｕｅｔｏｃｒｅｖｉｃｅｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＤＡＴＡＳＹＮＴＨＥＳＩＳ：Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｉｎｔｏｍａｎｙｋｉｎｄｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｄｅｆｉｎｅｄｍｅｄｉａ．Ｗｉｔｈｔｈｉｓｐｒｏｐｅｒｔｙ，ｉｔｈａｄｐｒｏｖｉｄｅｄｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｉｔｈｍａｔｕｒｅｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏｔｈａｔｋｉｎｄｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ６ｋｉｎｄｓｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ，ｎａｍｅｌｙｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ，ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ，ｃｅｌｌｐｅｌｌｅｔ，ｃｅｌｌｓｈｅｅｔａｎｄｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｕｌｔｕｒｅ．Ｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓ＇ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗｅｒｅｔｈａｔｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓｐｒｏｖｉｄｅａｓｕｉｔａｂｌｅｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｆｏｒｅｘｐａｎｓｉｏｎｏｆｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｂｙｓｅｃｒｅｔｉｎｇｓｏｍｅｃｙｔｏｋｉｎｅｓ，ａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＰＩ３－ｋｉｎａｓｅ，ＭＡＰＫｓ，ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣ，ｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ，ｃｅｌｌ－ｔｏ－ｃｅｌｌｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｗａｓａｓｅｐａｒａｔｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｆｏｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｓｔｅｍｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｔｈｅｇａｐｊｕｎｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃａｎｂｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｂｙｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｏｍａｔｉｃｃｅｌｌｓａｎｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅｂｅｅｎａｃｅｒｔａｉｎｆｅａｓｉｂｌｅａｎｄｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄ．Ｂｕｔｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｓｓｔｉｌｌｕｎｃｌｅａｒ．ＷａｎｇＳＱ，ＸｕＪＷ．Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌｓｃｏ－ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．ＺｈｏｎｇｇｕｏＺｕｚｈｉＧｏｎｇｃｈｅｎｇＹａｎｊｉｕｙｕＬｉｎｃｈｕａｎｇＫａｎｇｆｕ２００７；１１（１１）：２１２２－２１２５（Ｃｈｉｎａ）［ｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ／ｚｇｌｃｋｆ／ｅｊｏｕｒｎａｌ／ｕｐｆｉｌｅｓ／０７－１１／１１ｋ－２１２２（ｐｓ）．ｐｄｆ］摘要目的：体细胞与干细胞共培养可以诱导干细胞向该种体细胞表型分化，文章就干细胞共培养的不同方法及其诱导分化的机制进行综述。
骨髓间充质干细胞形态
骨髓间充质干细胞形态
骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）是一类来源于骨髓的多能干细胞，具有广泛的应用前景。
BM-MSCs具有多向分化潜能，可以分化为成骨
细胞、软骨细胞、脂肪细胞等多种细胞类型，因此在组织工程、再生
医学、免疫治疗等领域有着广泛的应用。
BM-MSCs的形态特征是细胞体积较大，呈梭形或星形，细胞质丰富，核浆比例低，核染色质较少，细胞质内含有丰富的细胞器，如线粒体、内质网、高尔基体等。
此外，BM-MSCs表面具有多种细胞表面标志物，如CD29、CD44、CD73、CD90等，同时不表达CD34、CD45
等造血干细胞标志物。
BM-MSCs的分离和培养需要特定的培养基和条件。
目前常用的培养
基包括DMEM/F12、α-MEM等，通常添加10%的胎牛血清或人血清，以及一定浓度的抗生素和抗真菌剂。
在培养过程中，需要控制细胞密
度和培养时间，以保证细胞的生长和分化。
BM-MSCs的应用前景非常广泛。
在组织工程领域，BM-MSCs可以
用于修复骨、软骨、肌肉等组织缺损，同时也可以用于修复心肌、神
经等组织缺损。
在再生医学领域，BM-MSCs可以用于治疗糖尿病、
肝病、肾病等疾病。
在免疫治疗领域，BM-MSCs可以用于治疗自身
免疫性疾病、移植排斥等疾病。
总之，BM-MSCs是一类非常有前途的干细胞，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断进步和研究的深入，相信BM-MSCs将会在更多的领
域得到应用。
不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的比较
不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的比较研究郭 燕 1， 赵凤琴2（1.辽宁医学院，辽宁 锦州 121000；2.辽宁医学院附属第三医院 体检中心，辽宁 锦州 121000）摘要：目的 探讨不同诱导条件对大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向心肌样细胞分化的影响。
方法 分离培养大鼠MSCs，将第4代经鉴定证实的MSCs随机分成4组：血管紧张素II（AngiotensinII，AngII）诱导组（含不同浓度3个亚组）、心肌细胞裂解液诱导组、AngII+心肌细胞裂解液共同诱导组及空白对照组，并进行定向诱导，观察细胞形态学变化，采用免疫细胞化学法对分化细胞进行鉴定并计算阳性细胞转化率。
结果 除对照组外，其余各组经诱导培养4周后的细胞形态均有改变，且都表达心肌特异性肌钙蛋白I（Cardiac-specific troponin I，cTnI）及间隙连接蛋白43（Connexin-43），但表达率不同，共同诱导组较其余各组形成的克隆、肌管结构多，细胞转化率较高（P<0.05），AngII 单独诱导时以0.2mol/L组诱导效果最佳（P<0.05）。
结论 AngII和心肌细胞裂解液均可将MSCs定向诱导分化为心肌样细胞，二者联合应用转化率更高。
在一定浓度范围内，单独应用AngII诱导，诱导剂浓度越高，转化率越高。
关键词：骨髓间充质干细胞；诱导；心肌样细胞；血管紧张素II；心肌细胞裂解液中图分类号：R 322.11 文献标识码：B心肌梗死（myocardial infarction,MI）后坏死心肌的修复和再生一直是临床医生和科研工作者面临的严峻挑战。
心脏移植因供体来源极其困难、手术技术要求高、费用高昂，在临床难以推广。
随着分子生物学的发展和对干细胞的深入研究，干细胞移植为MI的治疗带来了曙光。
骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其取材方便、易于体外扩增、具多重分化的潜能而成为理想种子细胞之一[1]。
骨髓间充质干细胞培养 ppt课件
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结论
上述实验结果证实，体外分离培养的SD大鼠 骨髓细胞为纯度较高的骨髓间充质干细胞而非其 他造血谱系干细胞，并建立了一套简单、有效、 获得纯度较高的骨髓间充质干细胞分离培养、增 殖、鉴定的方法。传代至第3代时，可获得纯度 高、数量足、生物活性高的骨髓间充质干细胞， 为本研究课题进一步实验研究奠定了实践基础以 及提供了数量充足的种子细胞。
全骨髓贴壁接触培养SD大鼠骨 髓间充质干细胞
省科学技术计划项目
ppt课件
1
主要内容
1.前言
2. 实验方法
3. 结果
4. 结论
2
前言
近来研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)不但具有来源广泛、易于获取、增殖迅速、可自体 移植、体外基因转染率高等特点，而且在不同诱导剂培养下可分别诱导分 化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，神经细胞及肝细胞等已成为适合 组织和细胞移植的种子细胞，以及基因治疗的理想靶细胞。但在骨髓中骨 髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓有核细胞总数的0.001%-0.1%，如 何为组织和细胞移植及基因治疗提供数量充足、活性良好的骨髓间充质干 细胞成为国内外学者研究的重点。 依据骨髓间充质干细胞对塑料培养瓶具有黏附贴壁特性，实验采用贴 壁法，建立一套简单、快速、有效的SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养、 增殖和纯化方法，观察其生长形态和生物学特性，验证其向成骨、成软骨、 成脂分化能力，为进一步研究骨髓间充质干细胞移植、基因治疗及组织工 程奠定实验基础。
8
骨髓间充质干细胞多向诱导分化
取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞，以 5×107 L-1接种于24孔板，待细胞贴壁生长融 合至70%-80%时，向各诱导孔中分别加入成 骨细胞诱导剂(含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维 生素C-2磷酸钠)，成软骨细胞诱导剂(含地塞米 松、转化生长因子β、维生素C)，成脂细胞诱导 剂(含地塞米松、胰岛素、吲哚美辛)。各诱导孔 定期换液，以未经处理的骨髓间充质干细胞培养 孔作为对照。
间充质干细胞的研究进展。
间充质干细胞的研究进展。
饶圣宏【摘要】间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）具有低免疫原性、免疫调节作用及多向分化潜能，并且来源充足、可避免伦理学争议的优点，使其有望成为种子细胞，应用于临床干细胞移植治疗．目前通过体内外诱导等方法已能实现MSCs的扩增和定向分化，本文对MSCs的研究进展作一综述，希望对今后MSCs的相关研究与临床应用提供参考．【期刊名称】《赤峰学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(000)009【总页数】2页(P111-112)【关键词】间充质干细胞;免疫原性;分化【作者】饶圣宏【作者单位】安徽三联学院护理系,安徽合肥230601【正文语种】中文【中图分类】R329间充质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)是一种来源于中胚层具有自我复制更新和多向分化的成体多能干细胞，研究最早并且最深入的是骨髓间充质干细胞(BMSCs)[1].它具有容易获得、能稳定传代、低免疫原性、可移植性等特征，具有免疫调节作用可有效降低GVHD的发生率及严重程度，实验证明MSCs在特定的条件下能够诱导分化为骨、软骨、神经等不同组织类型的细胞，给许多疾病的治疗展示了美好前景.间充质干细胞广泛存在于人体骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊水等组织中[2]，可分化成骨、软骨、心肌样细胞及神经元细胞等多种组织，具粘附性，纺锤形、成纤维细胞样形态.对于间充质干细胞的鉴定，现在还没有统一标准，国际细胞治疗协会提议，间充质干细胞的鉴定标准之一就是细胞表面标志CD105、CD73和 CD90阳性率超过 95%，CD34、CD45、CD14或 CD1lb、CD79a或 CD19 和 HLA-DR阴性率超过95%[3].Saito[4]等人首次证明MSCs具有归巢的能力，MSCs归巢是指在移植或自体动员后，干细胞可以定向趋向性迁移越过血管内皮细胞至靶向组织并定植存活的过程.自体或外源性MSCs在多种因素作用下，向缺血或损伤组织归巢是其重要的特征[5].造血干细胞是最早应用于临床移植的干细胞，主要的并发症之一是移植物抗宿主病(GVHD).MSCs由于不表达HLAⅡ类分子及 Fask、B7-1、CD40等部分共刺激分子，低水平表达或不表达HLAⅠ类分子等，因此能够逃避免疫系统的攻击[6].又有实验证明，在胎羊免疫功能发育后，将人MSCs植入胎羊体内，MSCs能长期存活而无排斥反应.因此人们预言了MSCs的低免疫原性在临床移植、组织工程等方面都有巨大潜能[7].实验表明，MSCs对机体具有免疫调节作用.它可抑制免疫系统对自己发起的攻击，其免疫调节效应是没有抗原特异性和选择性的，对各种免疫细胞，如T细胞、B细胞、树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)等，均具有免疫调节作用[8].在体外实验中发现MSCs可抑制T、B淋巴细胞增殖，使其停滞在G0/G1期而发挥免疫调节作用[9]；还能通过诱导调节性T细胞的扩增来增强其免疫抑制功能、直接抑制B淋巴细胞分泌抗体等[10]，这些均能促进移植物植活及降低GVHD发生率的作用[11].I期临床试验结果已经证实，在接受异基因造血干细胞移植的患者中，同时接受异基因MSCs者的GVHD发生率明显降低[12].间充质干细胞能够向成骨细胞、软骨细胞分化，Centeno等将BMSCs治疗退行性关节病变，此方法可促进骨的再生，对于骨关节炎和半月板损伤具有重要的治疗意义.Miao等将少量软骨细胞与BMSCs体外共培养，均成功形成成熟软骨样组织，且发现含20%软骨细胞的共培养体系最适合BMSCs成软骨分化[13].间充质干细胞在体内外可被诱导分化为多种上皮细胞，如肺和气管上皮细胞、肾小管上皮和角膜上皮细胞等，表达上皮细胞特异性标志.MSCs回输体内后，可有效修复损伤的肺上皮细胞组织，缓解炎症损伤，减轻肾小管细胞损伤、促进肾小管上皮细胞再生；也可在载体上利用MSCs构建生物角膜，进行眼表修复[14].另外，MSCs还可以向胰腺导管上皮细胞、子宫内膜上皮细胞、生精上皮细胞等分化[15]，MSCs在临床治疗上皮细胞损伤类疾病中展现出巨大的潜能.间充质干细胞经诱导可以向心肌样细胞分化.研究表明，人脐带源间充质干细胞（HUMSCs）利用5-氮杂胞苷或二甲基亚砜诱导分化后，免疫组化检测到心肌样细胞所特有的cT-NI、cTNT和心肌结蛋白.RT-PCR可以检测到心肌特异性转录因子等说明HUMSCs能向心肌样细胞分化.Scorsin等证实干细胞移植后心脏在体功能改善[16].间充质干细胞经诱导可以向肝样细胞分化.Kakinuma等证明，HUMSCs在体外和体内均可诱导成肝样细胞[17].任红英等采用改良的二步法肝细胞分化培养体系体外诱导HUMSCs向肝细胞分化，结果显示HUMSCs低表达AFP、ALB和细胞角蛋白-19(CK-19)的mRNA和蛋白，在诱导分化后14和28天，高表达肝细胞标志AFP、AIB、CK-19以及色氨酸2，3-双加氧酶基因.提示HUMSCs在体外能够分化为有功能的肝样细胞.在特定的条件下，间充质干细胞经过诱导在体内和体外均可分化为神经元样细胞，并表达一些神经标志性蛋白.在体外利用化学诱导、神经营养因子等多种方法诱导HUMSCs后，可表达神经干细胞的标记巢蛋白，神经元的标记神经元特异性烯醇化酶、神经元核抗原、神经微丝-M以及星形胶质细胞标记胶质纤维酸性蛋白[18].而且HUMSCs能表达神经营养因子，可以为受损神经再生提供营养因子[19]. MSCs研究近年在很多国家都取得了较大的进展，但仍有一些问题亟待解决，如MSCs在体外定向分化的细胞是否为有功能的细胞；如何体外操作MSCs使其成功定向分化；MSCs在体内如何干扰损伤的细胞或疾病的病理生理过程以及是否具有远期的致瘤性等.这些问题的成功解决将在未来促进间充质干细胞的研究不断深入以及组织工程学的不断发展.【相关文献】〔1〕Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et a1.Pluripoteney of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.Nature.2002,418(6893):4149.〔2〕Caplan A I.Why are MSCs therapeutic?New data:newinsight[J].JPathol,2009,217(2):318-324.〔3〕DOM INICI M,LE BLANCK,MUELLERi,et a1.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.〔4〕Saito T,Kuang JQ,Bittira B,et a1.Xenotransplant cardiac chimera:immune tolerance of adult stem cells[J].Ann Thorac Surg,2002,74(1):19-24.〔5〕Gimble J M,Katz A J,Bunnell B A.Adipose-derivde stem cells for regenerative medicine[J].Circ Res.2007,100(9):1249-1260.〔6〕刘晶,宋琳,邹伟等.体外扩增间充质干细胞功能有效性与移植安全性评价研究进展[J].生物工程学报,2010,26(12):1629-1635.〔7〕Maitra B,Szekely E,Gjini K el a1.Human mesenchymal stem cells support unrelated donor hematopoietic stem cells and suppress T-cell activation[J].Bone Marrow Transplant,2004,33(6):597-604.〔8〕PUISSANT B,BARREAUC et a1.hnmunonmdulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells:comparison with bone marrow mesenchymal stem cells [J].Br J Haematol.2005,129(1):118-129.〔9〕CORCIONE A,BENVENUTO F,FERRETYI E,et a1.Human mesenchymal stemcells modulate B cell functions[J].Blood,2006,107(1):367-372.〔10〕LE BLANC K,RASMUSSON I,SUNDBERG B,et a1.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stemcells[J].Lancet,2004,363(9419):1439-1441.〔11〕Aggarwal S,Pittenger MF,Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses[J].Blood,2005,105:1815-1822.〔12〕Tian Y,Deng YB et al.Bone narrow derived mesenchymal stemcells decrease acute graft-versus-host disease after allergenic hematopoietic stem cells transplantation [J].Immunol Invest,2008,37(1):29-42.〔13〕Miao CL.Zhou GD,Liu TY,et a1.Preliminary study of in vitro chondrogenesis by coculture of bone marrow stroma cells and chondrocytes.Acad J SSMU.2004,24:246-249. 〔14〕Braun M,Lelieur K,Kietzmann M.Purinergic substances promote murine keratinocyte proliferation and enhance impaired wound healing in m ice[J].Wound RepairRegen,2006,14(2):152-161.〔15〕Du H,Taylor HS.Contribution of bone marrow-derived stem cells to endometrium and endometriosis.Stem Cells,2007,25(8):2082-2086.。
人E钙粘素融合蛋白基质对人骨髓间充质干细胞向肝细胞定向诱导分化的影响研究
（ Ｓ ｃ ｈ ｏ ｏ ｌ ｏ ｆＣ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ，Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｔ ｉ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ３ ０ ０ ０ ７ ２， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） （ Ｄ ｅ ｐ ａ ｒ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ｆＢ ｏ ｉ ｏ ｍ ｏ ｌ ｅ ｃ ｕ ｌ ａ ｒ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ，Ｔ ｏ ｋ ｙ ｏ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｆＴ ｏ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｙ ｏ ｋ ｏ ｈ ａ ｍａ ２ ２ ６—８ ５ ０ １ ，Ｊ ａ ｐ ａ ｎ ）
的融 合 蛋 白 （ ｈ Ｅ — ｃ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ — Ｆ ｃ ） ， 并 将 其 用 于疏 水 材 料 的表 面 修 饰 仿 生 构 建 细 胞 一细 胞 间 相 互 作 用 的 细 胞 外 微 环 境 ，
检测其对 ｈ Ｂ ＭＳ Ｃ ｓ 向 肝样 细胞 定 向 诱 导 分 化 的影 响 。诱 导 分 化 培 养 ４ 周后， 与组织培 养板 （ Ｔ Ｃ － Ｐ Ｓ ） 、 明胶 （ Ｇ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｎ ） 基质相 比 ， ｈ Ｅ — ｃ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ － Ｆ ｃ 基质显著促进细胞表达 Ａ Ｌ Ｂ 、 Ｃ Ｋ １ ８ 、 Ｈ Ｎ Ｆ － ４等 肝 细 胞 分 化 基 因 ， 并 且 细胞 的 糖 原 合 成 和 吲 哚青 绿 （ Ｉ Ｃ Ｇ） 摄 取 功 能均 显 著 提 高 。在 ｈ Ｅ — ｅ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ — Ｆ ｃ基 质 表 面 分 化 培 养 ４周 时 ， 白蛋 白 和 尿 素 合 成 的量 为 ２ ． ７ ｐ ｇ ／ 细胞 ／ ｄ和 ３ ６ ． ７ Ｐ ｇ ／ 细胞／ ｄ ， 相 对于 Ｔ Ｃ — Ｐ Ｓ和 Ｇ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｎ分别 提高 了 ４ ２ ． １ ％和 ２ ８ ． ６ ％、 ５ ７ ． ５ ％和 ２ ５ ． ７ ％ 。综 上 所 述 ， 利用 ｈ Ｅ — ｃ ａ ｄ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ — Ｆ ｃ 基质化构建细胞外微环境 ， 有 利 于促 进 人 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 向 功 能化 肝 细 胞 的 定 向分 化 。 关键 词 ： 人 骨 髓 间充 质 干 细 胞 ； 肝细胞 ； 分化 ； 融合蛋 白； 人 Ｅ一钙 粘 素 中图分类号 Ｒ ３ １ ８ 文献标志码 Ａ 文章编号 ０ ２ ５ ８ — ８ ０ ２ １ （ ２ ０ １ ３ Ｊ ０ ６ － ０ ７ ０ ８ — ０ ８
体外诱导人骨髓间质干细胞分化为肝细胞样细胞
［ 摘
要 ］ 目的 ： 探讨人骨髓 间质 干细胞 （ Ｃ ） 体外特 定条 件下是 否可 以转 化 为肝细胞 样细 胞。方法 ：分离培 ＭＳ ｓ 在
养人骨髓 间质干细胞 ， 采用肝细胞生 长因子（ ｅ ａ ｃｔ ｇｏ ｔ ｃｏ， Ｆ 、 ｈｐｔ ｙ ｒｗｈｆ ｔｒ ＨＧ ） 碱性成纤 维细胞生长 因子 （ ａｉ ｆ ｒ ｌ ｔ ｏ ｅ ａ ｂｓ ｂｏ ａ ｃｉ ｂ ｓ
ｔ ｉｆｒ ｎ ｉ ｔ ｎｏ ｈ ｐ ｔ ｃ ｔ —ｉ ｅ ｃ ｌｓ ｕ ｄ ｒ ａ ｐ ｏ ｉａｅ ｃ ｎ ｔ ｎ ｉ ｉｒ ｏ ｄ ｆｅ ｅ ｔａｅ ｉ ｔ ｅ ａｏ ｙ ｅ ｌｋ ｅ ｌ ｎ ｅ ｐ ｒ ｐｒ ｔ ｏ ｄｉ ｏ ｎ ｖｔｏ． Ｍ ｅ ｈｏ ｉ ｔ ｄｓ：Ｔｈ ｕ ａ ｏ ｅ ｅｈ ｍ ｎ ｂ ｎ
［ ｓｒｃ ］ Ｏｂｅｔ ｅ Ｔ ｘ ｌ ｅｗ ｅｈｒ ｕ ａ ｏｅｍａｒｗｍｅｅｃ ｙ ａ ｓ ｍ ｃｌ （ Ｓ ｓ ａｅａ ｌ Ａｂｔａ ｔ ｊｃｉ ： ｏｅｐｏ ｈ ｔｅ ｍ ｎｂ ｎ ｒ ｓｎ ｈ ｍ ｌ ｔ ｅ ｓ Ｍ Ｃ ） ｒ ｂｅ ｖ ｒ ｈ ｏ ｅ ｌ
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骨髓间充质干细胞及其外泌体治疗终末期肝病的研究进展
!L"!骨髓间充质干细胞及其外泌体治疗终末期肝病的研究进展梁 悦１，２，胡永红１，２，刘 伟１，２，慕永平１，２，陈佳美１，２，刘 平１，２，３１上海中医药大学附属曙光医院，上海市中医药研究院肝病研究所，上海２０１２０３；２肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海２０１２０３；３上海中医药大学交叉科学研究院，上海市中医药化学生物学前沿基地，上海２０１２０３摘要：终末期肝病是各种急慢性肝病的晚期阶段，病死率高，严重危害人民健康。
目前有效的治疗方法是肝移植，但囿于供体短缺、费用高昂等因素极大地限制了其临床应用。
近年来临床与基础研究表明，骨髓间充质干细胞及其外泌体在治疗终末期肝病上具有良好的临床应用前景。
本文就骨髓间充质干细胞及其外泌体在终末期肝病治疗中的作用机制与临床应用研究概况作一综述，期冀为进一步研究提供参考。
关键词：终末期肝病；间充质干细胞；外泌体；治疗学基金项目：国家自然科学基金重点项目（８２１３０１２０）；国家自然科学基金面上项目（８１９７３６１３）；中国博士后基金面上项目（２０２１Ｍ７０２２１８）Ｒｅｓｅａｒｃｈａｄｖａｎｃｅｓｉｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅＬＩＡＮＧＹｕｅ１，２，ＨＵＹｏｎｇｈｏｎｇ１，２，ＬＩＵＷｅｉ１，２，ＭＵＹｏｎｇｐｉｎｇ１，２，ＣＨＥＮＪｉａｍｅｉ１，２，ＬＩＵＰｉｎｇ１，２，３．（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅｓ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈｕｇｕａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌＡｆｆｉｌｉａｔｅｄｔｏＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；２．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＬｉｖｅｒａｎｄＫｉｄｎｅｙＤｉｓｅａｓｅｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ；３．ＳｈａｎｇｈａｉＡｄｖａｎｃｅｄＢａｓｅｏｆＣｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｌｏｇｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＩｎｔｅｒ ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ：ＣＨＥＮＪｉａｍｅｉ，ｃｊｍ０１０２＠１２６．ｃｏｍ（ＯＲＣＩＤ：００００－０００１－９８０８－９６１０）；ＬＩＵＰｉｎｇ，ｌｉｕｌｉｖｅｒ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ（ＯＲＣＩＤ：００００－０００２－６１５２－４５０８）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｉｓｔｈｅｌａｔｅｓｔａｇｅｏｆｖａｒｉｏｕｓａｃｕｔｅａｎｄｃｈｒｏｎｉｃｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｍｏｒｔａｌｉｔｙａｎｄｓｅｒｉｏｕｓｌｙｔｈｒｅａｔｅｎｓｐｅｏｐｌｅ’ｓｈｅａｌｔｈ．Ｌｉｖｅｒｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｉｓｃｕｒｒｅｎｔｌｙａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｉｓｄｉｓｅａｓｅ，ｂｕｔｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｓｇｒｅａｔｌｙｌｉｍｉｔｅｄｂｙｔｈｅｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｓｈｏｒｔａｇｅｏｆｄｏｎｏｒｓａｎｄｈｉｇｈｃｏｓｔｓ．Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ，ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｂａｓｉｃｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｓｈｏｗｎｔｈａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙ ｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｈａｖｅｇｏｏｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｒｅｖｉｅｗｓｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆａｃｔｉｏｎａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｄｉｔｓｅｘｏｓｏｍｅｓｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓ ｅａｓｅ，ｓｏａｓｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｎｄ－ＳｔａｇｅＬｉｖｅｒＤｉｓｅａｓｅ；ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌＳｔｅｍＣｅｌｌｓ；Ｅｘｏｓｏｍｅｓ；ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓＲｅｓｅａｒｃｈｆｕｎｄｉｎｇ：ＫｅｙＰｒｏｊｅｃｔｏｆＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８２１３０１２０）；ＧｅｎｅｒａｌＰｒｏｊｅｃｔｏｆＮａｔｉｏｎａｌＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎａ（８１９７３６１３）；ＣｈｉｎａＰｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（２０２１Ｍ７０２２１８）ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－５２５６．２０２２．１１．０４１收稿日期：２０２２－０４－１５；录用日期：２０２２－０７－１４通信作者：陈佳美，ｃｊｍ０１０２＠１２６．ｃｏｍ；刘平，ｌｉｕｌｉｖｅｒ＠ｖｉｐ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ 终末期肝病（ｅｎｄ－ｓｔａｇｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅ，ＥＳＬＤ）以肝功能不能满足人体的正常生理需求为特征，是各种急、慢性肝损伤所致的晚期阶段，主要包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病引起的失代偿期肝硬化及肝衰竭。
免疫磁珠法-这一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应,在细胞表面形成玫瑰花结
学术术语来源---
骨髓间充质干细胞及其向肝样细胞分化的潜能
文章亮点：
1 此问题的已知信息：骨髓间充质干细胞具有ห้องสมุดไป่ตู้向分化潜能，在不同的诱导条件下，其具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如成骨细胞、成脂肪细胞等，近几年来，很多研究表明其也有向肝细胞分化的能力。
2 文章增加的新信息：细胞因子和生长因子如肝细胞生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子及肿瘤坏死因子1等在肝脏的发育和再生过程中起重要的作用，单独和联合应用会在体外诱导骨髓间充质干细胞增殖并向肝系细胞分化。
免疫磁珠法-这一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进
行抗原抗体反应，在细胞表面形成玫瑰花结，
免疫磁珠法-这一方法的核心是在磁珠表面包被具免疫反应性的抗体进行抗原抗体反应，在细胞表面形成玫瑰花结，这些结合了磁珠的细胞一旦置于强大的磁场下，就会与其他未被结合的细胞分群，具超强顺磁场的磁珠脱离磁场后立即消失磁性，这样就可以筛选或去除所标记的细胞，从而达到阳性或阴性选择细胞的目的。
主题词：
骨髓；间质干细胞；细胞分化；肝细胞
摘要
背景：研究表明，在一定条件下骨髓间充质干细胞可诱导分化为肝样细胞，为治疗急性肝衰竭等终末期肝病提供了新的思路。
目的：对骨髓间充质干细胞的发现、分离培养、诱导分化及应用前景等方面做一综述。
3 临床应用的意义：将骨髓间充质干细胞作为肝细胞移植的细胞来源有重要的临床意义。但是，若要在临床上广泛应用骨髓间充质干细胞治疗终末期肝病，还需要进一步确定体外及体内诱导转化证据，不断完善分离纯化、扩增和诱导分化的技术方法，以更有效地改善病变肝组织的结构和功能将成为今后研究的重要内容。
关键词：
骨髓间充质干细胞膜片的设备制作方法及其应用与设计方案
本技术公开了骨髓间充质干细胞膜片的制备方法及其在治疗心肌缺血再灌注损伤上的应用。
利用密度梯度离心、细胞贴壁和细胞冻存的方法提取扩增细胞，可以获得足够量的未分化的较为单一的MSCs，增殖能力较强，纯度高，可以作为组织工程的种子细胞，为组织工程血管的构建提供依据。
而且较Reyes方法去除了免疫磁珠选择的步骤，在实际应用中减少了昂贵的费用，操作中减少了污染的机会。
权利要求书1.骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：用20ml注射器吸取10ml骨髓液，将细胞悬液贴壁缓慢注入到预置有等体积密度为1.077kg/L的人淋巴细胞分离液的试管内，使两者间形成清晰的界面；S2：以2500r/min离心20min，吸取中间的乳白色云雾状单核细胞层，PBS漂洗，1500r/min离心10min，弃上清，加入含15％FBSDMEM-LG培养液10ml，制成单细胞悬液；S3：以3×105/cm2密度接种于50ml培养皿内，置入37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养，4d后首次半量换液，将未贴壁的细胞全部弃掉，以后每2～3d全量换液一次；S4：待细胞汇合成单层后，以0.25％胰蛋白酶(含0.02％EDTA)消化，即得到原代MSCs悬液，再以1×104/cm2的密度以1：2传代培养以形成细胞膜片；S5：倒置显微镜观察细胞生长；S6：绘制细胞生长曲线；S7：测定贴壁率并绘制贴壁率曲线。
2.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S1中，注射器内含稀释的肝素钠2500U/ml约0.5ml。
3.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S1中，骨髓液的吸取方法为选髂后上棘穿刺点，无菌条件下局部麻醉后骨髓穿刺针穿刺成功后拔出针芯，接含有5ml生理盐水和肝素(100U/ml)的10ml注射器穿刺抽取骨髓10ml。
4.根据权利要求1所述的骨髓间充质干细胞膜片的制备方法，其特征在于，在所述的S2中，用于离心的离心机为台式高速离心机。