分子生物学实验报告

分子生物学综合实验实验报告

本次试验报告分为三个部分：

第一：每个基本实验的目的，原理，材料，试剂与仪器。

第二：以GFP质粒，P38质粒，植物DNA和植物RNA为材料的四个综合试验的实验过程。第三：试验总结。

第一部分：每个基本实验的目的，原理，材料、试剂与仪器：质粒DNA的提取

一、目的

学习碱裂解法提取质粒的原理

二、原理

质粒是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。目前，经人工改造的质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。

质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、实验材料、试剂与主要仪器

（一）实验材料

含质粒的大肠杆菌DH5α

（二）试剂

1. LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.0。高压灭菌20分钟。

2. LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20分钟。

3. 溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)。

4.溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH,1% SDS。（必须新鲜配制）

5.溶液Ⅲ：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1／L乙酸钾60 ml，冰乙酸11.5 ml，水28.5ml）。

6. TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl,1mmol/ L EDTA。

7. 无水乙醇和70%乙醇。

（三）仪器

1. Eppendorf管、离心管架

2. 10，100，1000μl微量加样器

3. 台式高速离心机

4. 摇床、高压灭菌锅

琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

一.目的

学习琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。二.原理

琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA 就能检测。其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DNA发射的荧光，增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA，就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应，使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定，提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压，也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。

当然也可以用同样的方法检测RNA。

三、试剂与主要仪器

（一）试剂

1. DNA样品

2. TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍（配制见附录）

3. 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

4. 溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶（注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）

5. 琼脂糖

（二）仪器

1. 电泳仪系统

2. 紫外灯

3. 恒温水浴箱

质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定

一、目的

学习质粒的酶切及电泳分析。

二、原理

限制性内切酶可以识别双链DNA特定位点，并产生特异的切割，形成粘性末端或平末端，这样有利于DNA片段再连接。

限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切点，酶切后就能产生多少个片段。因此，鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可以推断切点的数目；从片段迁移率的大小可以判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子量DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。

质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其

次是线状DNA和开环DNA。因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。

三、试剂与主要仪器

（一）试剂

1.EcoRⅠ酶

2.λDNA

3.TBE缓冲液（5×）：用时需稀释10倍

4.点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油

5.溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶（注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）

6.琼脂糖

（二）仪器

1.电泳仪系统

2.紫外灯

3.恒温水浴箱

聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA

一、目的

1.学习PCR反应的基本原理和实验技术。

2.了解引物设计的一般要求。

二、原理

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是体外酶促合成DNA片段的一种技术。利用PCR技术可在数小时之内大量扩增目的基因或DNA片段，以用于基因工程操作。

PCR进行的基本条件：

⑴DNA模板（在RT-PCR中模板是RNA）

⑵引物

⑶dNTP（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）

⑷Taq DNA聚合酶

⑸反应缓冲体系

PCR循环由三个步骤组成：

⑴变性使模板DNA解离成单链；

⑵退火使引物与模板DNA所需扩增序列结合；

⑶延伸DNA聚合酶利用dNTP合成与模板碱基序列互补的DNA链。

每一个循环的产物可作为下一个循环的模板，通过30个左右循环后，目的片段的扩增可达106倍。

引物设计：要保证PCR反应能准确，特异，有效的对引物DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下原则：

⑴引物长度：15~25个核苷酸；

⑵GC含量为40%~60%；

⑶Tm值为55℃（Tm=4（C+G）+2（A+T）计算；

⑷引物与非特异配对位点的配对率小于70%；

⑸引物自身配对形成的茎环结构，茎的碱基对小于3，

⑹两条引物间配对碱基数小于5个。

由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。

本实验以实验二中提取的质粒DNA为模板，进行PCR扩增，大量得到目的DNA片段。

三、试剂与仪器

（一）试剂

1. Taq DNA聚合酶

2.10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）

3.dNTP

4.引物（P1、P2）

5.溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶。注意：该试剂具致癌作用，用时要小心。

6.点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

（二）仪器

1. PCR扩增仪

2.电泳仪

3.台式离心机

4.紫外分析仪

5.恒温水浴

6.凝胶成像系统

植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析

一、目的

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

二、原理

十六烷基三甲基溴化胺（CTAB）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中，首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出，然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀，离心后，溶液分为三层，上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液，中层为蛋白质和细胞碎片，下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

由于CTAB能溶解于乙醇，在洗涤过程中CTAB即可被除去。

三、实验材料、试剂与主要仪器

（一）实验材料

小麦幼苗

（二）试剂

1. DNA 抽提液

用时将下述三种溶液按1:1:0.4 (V/V)比例混匀，加入亚硫酸氢钠（3.8g/L），即为抽提液。

① DNA extraction（500ml）：

31.885g sorbitol (山梨醇)

6.05g Tris pH8.2 (一般不调)

② Nuclei lysis buffer（500ml）:

100ml 1M Tris pH7.5

100ml 0.25M EDTA

200ml 5M NaCl

10g CTAB

100ml ddH2O

③ 5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基钠盐) 500ml

2.氯仿：异戊醇（24：1）

3 70% 乙醇

4.异丙醇

5.HindIII酶

6.EcoRⅠ酶

（三）器材

1.台式离心机

2.恒温水浴

3.紫外分析仪

4.微量加样器

RNA分离与纯化

一、目的

掌握RNA提取的基本技术，了解RNA提取过程中的各种注意事项。

二、原理

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。

RNA提取和DNA提取有类似的地方，因为它们都是核酸，都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞，然后用提取液将RNA溶出，反复抽提去除蛋白质，加入乙醇沉淀RNA，将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开？DNA和RNA的溶解性不同，DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度，而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度，所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外，RNA的分子量一般比较小，而DNA 分子很大且和蛋白结合成复合体，所以DNA更容易随蛋白沉淀，而RNA具有较好的溶解性。

RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1％的DEPC水37℃过夜浸泡，然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水，而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应，应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。

判断RNA 的质量主要有两个标准，一是纯度，二是完整性（是否被降解）。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260／A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明，未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带（如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带）。RNA电泳系统也要严格对RNA 酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳，则用尽量减少电泳时间。

三、试剂与器材

（一）试剂

1.暗培养7天的小麦苗，用前光照处理3 h

2.DEPC

3.DEPC处理的ddH2O

4.RNA提取液：（每1000毫升中含有）

Tris 6.06 克(最终浓度为50 mM )

LiCl 6.03 克(LiCl -H2O 9.06克) (最终浓度为150 mM )

EDTA（0.5 M）10ml (最终浓度为5 mM )

SDS 50 克(最终浓度为5 % )

5. 8 M LiCl：33.92克LiCl 溶于100 ml DEPC处理的ddH2O

6. 水饱和酚

7. 氯仿

8. 0.5M NaCl

9. 溴乙啶(EB)：10mg/ml溴乙啶。（注意：该试剂具致癌作用，用时要小心）

10.点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。

（二）器材

1.分光光度计

2.电泳仪

3.台式离心机

4.手提式紫外监测仪

5.恒温水浴

6.凝胶成像系统

RT-PCR扩增目的基因cDNA

一、目的

学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二、原理

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因，但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子，所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子，不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除，是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶，在反义引物或oligo（d T）的引导下合成mRNA互补的DNA （complemental DNA），再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板，扩增出不含内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5，和3，端经改造可直接用于基因工程的表达，因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

三、试剂与器材

（一）试剂

1. RNA模板

2. cDNA引物

3. 反转录缓冲液

4. dNTP

5. MMLV反转录酶

6. RNA抑制剂（RNasin）

7. Taq酶及10×PCR缓冲溶液

8. 引物（P1、P2）

（二）器材

1.PCR扩增仪

2.电泳仪

3.台式离心机

4.恒温水浴

第二部分：实验过程

一、GFP质粒部分

实验思路：GFP质粒提取→转化→阿拉伯糖诱导表达→绿色荧光反应

（一）ＧＦＰ质粒的提取：

1. 用1000μl移液枪吸取1.4ml（0.7ml×2）菌液移入1.5ml 离心管，离心30秒（6000rpm），倒去上清液。

2.用移液枪加入100μl预冷的溶液Ⅰ和10μl RNAse，用涡旋震荡器充分悬浮。

3.用移液枪加入150μl溶液Ⅱ，快速颠倒温和混匀，室温放置5分钟。此时溶液应非常粘稠。

4.用移液枪加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀）,冰浴5分钟。

5.12000rpm离心10分钟。用移液枪将上清液转移至另一1.5ml离心管中。

6.加800μl（二倍体积）无水乙醇到上清液中，混匀，12000rpm离心10分钟，除去上清（尽可能除去残液，残留的小部分清夜可用10μl移液枪吸净）。

7.用1ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，除去乙醇（尽可能除去残液）。

8.静置使乙醇挥发完全，干燥DNA。

9.加30μl TE溶解DNA，待用（或-20℃保存）。

（二）细菌细胞的转化

１、感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)

（1）从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。

（2）将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为

0.4。

（3）取培养好的菌液1.4ml于一1.5ml离心管中，4℃离心6 000rpm×1 min。

（4）弃上清，加500 μl0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心6000rpm×1 min。

（5）彻底除去残液, 加100 μl0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，用枪头吹打，充分悬浮菌体。

（6）冰浴静置20 min 。

2、大肠杆菌的转化

（1）将GFP质粒1 μl加入100 μl制备好的感受态细胞悬浮液中，冰上放置30 min。

(2）42℃热激90s。

(3) 迅速冰浴5min。

(4)加入800 μl LB液体培养基，37℃轻摇培养40min。

(5) 加入30 μl X-gal、6 μl IPTG和70 μl LB液体培养基混匀。

（三）、阿拉伯糖诱导表达

(1) 取上述菌液100 μl涂布在含有50 μg/ml氨苄的LB固体培养基（含阿拉伯糖）中。

(2) 37℃倒置，避光培养16-20 h。

（四）绿色荧光反应

将培养的平板在暗处用紫外器进行检测。

检测结果：

实验分析：（１）由质粒电泳结果（大胶倒数第五个泳道）可知条带的亮度较暗，宽

度较窄且只有一个条带，意味着提取的质粒质量不是很好。条带的亮度是因为DNA与溴乙锭结合而被染色，DNA越长，结合的溴乙锭越多，染色越深。与其他组相比较（两个条带，离点样孔的位置）可以排除菌体不够或者RNA和染色体DNA的原因，那么原因可能是在碱变性的时候质粒的共价闭合环状大部分分离。

（2）提取质粒加入溶液Ⅲ时按理论溶液应变得清晰，但是本次实验却发现是浑浊的（做了两次），推测原因是菌体溶液浓度较高，菌体没有被完全溶解。

（3）绿色荧光标记的结果表明感受态细胞的制备以及菌体的转化是比较成功的，但是涂布能再均匀一些更好。

二、P38质粒部分

对P38质粒主要进行了蓝白斑筛选实验，单酶切及Southern 杂交实验。

（一）蓝白斑筛选实验

实验思路：P38质粒提取→质粒PCR→TA连接→转化→蓝白斑筛选→菌落PCR。

P38质粒提取：

1. 用1000μl移液枪吸取1.4ml（0.7ml×2）菌液移入1.5ml 离心管，离心30秒（6000rpm），倒去上清液。

2.用移液枪加入100μl预冷的溶液Ⅰ和10μl RNAse，用涡旋震荡器充分悬浮。

3.用移液枪加入150μl溶液Ⅱ，快速颠倒温和混匀，室温放置5分钟。此时溶液应非常粘稠。

4.用移液枪加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀）,冰浴5分钟。

5.12000rpm离心10分钟。用移液枪将上清液转移至另一1.5ml离心管中。

6.加800μl（二倍体积）无水乙醇到上清液中，混匀，12000rpm离心10分钟，除去上清（尽可能除去残液，残留的小部分清夜可用10μl移液枪吸净）。

7.用1ml 70% 乙醇洗DNA沉淀一次，除去乙醇（尽可能除去残液）。

8.静置使乙醇挥发完全，干燥DNA。

9.加30μl TE溶解DNA，待用（或-20℃保存）。

注意：8、乙醇挥发不完全会影响会影响以后DNA的剪接过程。

PCR扩增：

1.

试剂体积（50μl）

2x Ｍｉｘｅｒ，包括：ｄＮＴＰ（2.5

15μl

ｍＭｅａｃｈ），Ｔａｑ酶，10 x buffer

（含25mM Mg2+）

引物Ｍ13（Primer P1（μM），Primer P2

2μl

（μM））

P38质粒2-3μl

ddH2O 11-10μl

2.设置PCR程序：

94 ℃180s

94 ℃45s加热

32 cycles: 55℃45s退火

72 ℃60s 延伸

72 ℃600s

3.运行PCR程序

4.PCR产物鉴定

反应结束后，取20μl PCR产物进行1.2% 琼脂糖电泳分析。

电泳结果:

TA连接：

1. 取一个PCR离心管依次加入下列试剂:

Mixer 6μl

PCR目的片段：3μl

T4 DNA连接酶：1μl

用移液枪枪头吹打混匀，室温下静置1h以上。

2.4℃过夜连接。

（四）转化

１、感受态细胞的制备(0.1M CaCl2方法)

（1）从LB固体平板挑单克隆于5ml LB液体培养基中(不加抗生素)，37℃×200rpm×12-16h，可过夜培养。

（2）将活化菌体按1`～5％接种到LB中，扩大培养37℃×200rpm×2h，至OD600约为

0.4。

（3）取培养好的菌液1.4ml于一1.5ml离心管中，4℃离心6 000rpm×1 min。

（4）弃上清，加500 μl0.1M CaCl2 (灭菌预冷)洗菌体，4℃冷冻离心6000rpm×1 min。

（5）彻底除去残液, 加100 μl0.1M CaCl2 (灭菌预冷)，用枪头吹打，充分悬浮菌体。

（6）冰浴静置20 min 。

2、大肠杆菌的转化

（1）将P38质粒10 μl加入100 μl制备好的感受态细胞悬浮液中，冰上放置30 min。

(2）42℃热激90s。

(3) 迅速冰浴5min。

(4)加入800 μl LB液体培养基，37℃轻摇培养40min。

(5)4000rpm,离心1min。

(6)用移液枪吸走750μl上清液，再用枪头轻轻吹打沉淀，混匀。

(7)将菌液150 μl全部、30 μl X-gal、6 μl IPTG和70 μl LB液体培养基涂布在含有50 μg/ml 氨苄的LB固体培养基（含阿拉伯糖）中。

(8) 37℃倒置，避光培养16-20 h。

蓝白斑筛选

观察长出的单菌落克隆，挑选出白斑的菌落进行菌落PCR。

菌落PCR：

1.

2.设置PCR程序：

94 ℃180s

94 ℃45s加热

32 cycles: 55℃45s退火

72 ℃60s 延伸

72 ℃600s

3.运行PCR程序

4.PCR产物鉴定

反应结束后，取5μl PCR产物进行1.2% 琼脂糖电泳分析。

电泳分析结果：

实验分析：（1）P

质粒的提取过程中，错误地在加溶液Ⅲ的时候加成了溶液Ⅰ，最

38

后继续加溶液Ⅲ，结果还能成功的提取到了质粒，因为溶液Ⅰ作用是溶解菌体及RNA，所以多加不会有太大影响。不应过早放弃！

（2）蓝白斑筛选的原理是不含外源基因的菌体可以分解X-gal，生成蓝色物质，呈现蓝斑。而含有外源基因的菌体，即连接成功的质粒并成功转化的菌体，分解X-gal的基因被外源基因取代，最终呈现蓝斑，即为阳性菌落，亦即目的菌落。实验结果很成功，只有几个蓝斑，但是白斑的单菌落较少，证明我们的涂布技术有待提高。

（3）菌落PCR的最终结果不是很理想，最终证明是没有菌落。是吸取菌落的时候出了问题。（二）单酶切实验

实验思路：用P38 质粒的PCR扩增片段进行EcolⅠ单酶切，并与原PCR片段进行凝胶电泳对比。

P38 质粒10μl

EcoRⅠ/l2μl

EcoRⅠBuffer（10×）2μl

ddH2O 6μl

5μl P38 质粒原PCR产物分别点样对照）。

38

电泳分析结果：

实验分析：上面的图片只是酶切的结果，没有与PCR的对比试验的照片。预期结果应该是酶切的PCR片段要比原PCR片段短，即酶切的泳道有多个条带，且条带离点样孔较远。

（三）Southern 杂交

实验思路：用P38 质粒的PCR目的片段作为标记探针，再将其与P38 质粒，PCR 产物及P38 质粒酶切产物进行杂交。

探针的标记

1.用灭菌去离子蒸馏水稀释1.5ml DNA至总体积16μl。

2. PCR目的片段热变性：把PCR目的片段置于沸水中，水浴10分钟。然后，迅速地插

入碎冰中3分钟以上。

3. 加4μl DIG Random Labeling Mix(高效)，混匀后再2000RPM离心5分钟。

4. 置于37℃反应至少120分钟。时间越长，产量越高。延长反应时间至20小时可明显增加地高辛标记PCR目的片段的产量。应根据需要控制反应时间。

5. 加入2μl EDTA以终止反应。

Southern转移

1. 将目的基因经琼脂糖凝胶电泳的胶板从电泳槽中取出，凝胶浸入0.25M HCl 中10分钟。HCl处理的作用主要是通过嘌呤使PCR目的片段分子断裂，因而有利于PCR目的片段的转移，但不能处理时间过长。

2. 进入变性液之前，用蒸馏水漂洗20分钟。

3. 把凝胶浸入变性液中，室温浸泡15分钟一次。

4. 蒸馏水漂洗凝胶2次。

5. 把凝胶浸入中和液中，室温浸泡15分钟×2次。

6. 处理凝胶的同时，切一张同样大小的尼龙膜或者硝酸纤维素膜。硝酸纤维素膜用2×SSC 浸泡。剪两张Whatman3#滤纸和吸水用的粗滤纸。（注意不要用手直接触及膜面）

7. 准备转移用平器和支架，平器中放20×SSC。支架上搭滤纸桥使得溶液能够虹吸上来。

8. 依次放：处理好的凝胶，硝酸纤维素膜（做好标记），吸水纸，适量重物（500-1000g）。

注意：检查pH值，用硝酸膜时pH<9。要用玻璃棒来回碾压，确保各层间没有气泡，否则会发生局部绝缘，气泡处的DNA 难以吸附到膜上。

9. 于室温转移12-20小时。

10. 取出转移膜，用2×SSC 漂洗数次，以去处困难吸附在膜上的凝胶。

11. 固定：可选择下述方法之一进行DNA固定。

·紫外线固定：使用长波紫外线照射10-20分钟，简单漂洗干燥备用。

·尼龙膜置于120℃烘烤30分钟。

·硝酸纤维素膜置于普通烘箱中80℃烘烤2小时

Southern杂交

1. 将转移好的尼龙膜或硝酸纤维素膜装入杂交管中，贴壁放置（吸附有核酸的一面不

要贴壁），赶走杂交膜和管壁间的气泡。

2. 加入20ml Standard buffer，65℃预杂交4-20小时。

3. 将制备的DNA探针沸水浴加热10min，迅速置冰浴5min。全部加入杂交管。

4. 使用和预杂交相同的杂交温度，一般杂交16-20小时。

5. 杂交结束后将杂交液倒入带盖的试管中，储存于-20以备下次使用。这样至少可以保存一年。再次使用之前应在冻融之后，加热至+95℃ 10分钟以变性探针。

6. 取出杂交膜，用Wash Solution I 洗5分钟×3次。

7. 保温冲洗：用Wash Solution II 于68℃冲洗15分钟×2次。

BCIP/NBT 显色检测法

1. 经过杂交及杂交后的冲洗之后，膜置于冲洗液中平衡1分钟。

2. 用干净的平皿，封闭液（脱脂奶粉）室温封闭至少60分钟。

3. 用封闭液1：2500—5000稀释Anti-DIG-AP，例如2μl Anti-DIG-AP加至5-10ml封闭液中（根据染色情况而调整）。稀释液4℃可稳定12小时左右。

4. 加Anti-DIG-AP，37℃反应60分钟。

5. 用冲洗液洗15分钟×3次，每次100ml。

6. 按1：50配制底物显色液：例如100μl“BCIP/NTP储备液”加至5ml显色缓冲液中，未用完的显色剂应避光保存。

7. 显色缓冲液20ml平衡2分钟后倾掉。

8. 加100ml底物显色液（100 cm2）。将膜及显色剂封在塑料袋中，开始避光显色。显色过程中可以观察。一般数分钟即开始出现颜色，显色过程可以持续至12小时。应绝对避免震动，以免出现颜色带的移位。

9. 当所需要的显色点或带出现之后，蒸馏水洗以终止反应。结果可以进行照相记录；也可以直接保存于TE缓冲液，在此情况下，颜色长期不退。还有一种选择时让膜干燥，颜色消褪。但若将膜放置于TE缓冲液中，显色重新出现。

杂交结果

实验分析：Southern 杂交是一种精细的技术，需要比较强的动手能力和对实验各个步

骤的原理和使用的试剂有较好的理解，最终才能得出较好的结果并对结果做出正确分析。本次试验是用P38质粒的PCR片段做标记探针，分别与PCR产物，酶切产物以及P38质粒本身杂交。最终结果良好，从纤维素模上的条带分析看，探针与三种被杂交对象都成功进行了杂交，与预期的结果相符。

三、植物基因组DNA提取，酶切及电泳分析

实验思路：CTAB法提取植物DNA→酶切→凝胶电泳

（一）CTAB法提取植物基因组DNA

1.取0.15×4g左右小麦叶片，在液氮中研磨后放入分装如四支1.5ml离心管中，加入700μl抽提液（65℃预热）混匀，加入10μl RNase（10mg/mL），室温放置2min，放入65℃水浴中，裂解40分钟，期间温和混匀几次。

2、10000rpm离心5min。

3.取出裂解好的DNA ，加入700μl 氯仿：异戊醇（24：1），猛烈混匀，离心（10000rpm，10分钟）。

4.取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍预冷异丙醇，缓慢混匀后，再猛烈混匀，使DNA成团，-20℃放置半小时以上。

5.将析出的DNA 离心，10000rpm，10分钟。

6.去掉上清，将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗两次，干燥，溶于50μl TE或水中。冷冻保存。（二）酶切及电泳分析

将植物酶切DNA产物与总DNA进行凝胶电泳对比分析。

植物基因组DNA 16μl

EcoRⅠ/l2μl

EcoRⅠBuffer（10×）2μl

37℃反应4h，加入4μl EDTA终止反应

2. 0.8%琼脂糖凝胶电泳100V，35min（10μl酶切DNA与8μl总DNA分别点样对照）。

3.观察并记录结果。

实验分析：总体来说实验结果不是很好，DNA的提取与纯化比RNA容易，总DNA的泳道上应该只有一个清晰的条带，而酶切DNA的泳道上会有很多个条带，因为经酶切后DNA被切成很多个小片段，而且被酶切的DNA长度也不是一样的，所以会产生多个条带。

五、植物RNA提取，定量及电泳分析

实验思路：植物RNA提取→凝胶电泳→RT（逆转录）→PCR

（一）植物RNA提取

1. 称取小麦叶片２０×４mg,于研钵中加液氮研磨成粉末，迅速分装转移到４支

1.5ml离心管中。

2. 加入1 ml Trizol Reagent，室温×5min。

3. 加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15 sec，室温×3min。

4. 冷冻离心12 000 rpm×15min。

5. 将上清液转移到另一个离心管中，加0.5ml预冷异丙醇,混匀，-20℃放置20min。

6. 冷冻离心12 000 rpm×10min，弃上清。

7. 加入0.5ml 70%乙醇于RNA沉淀中并悬浮沉淀，10000 rpm×2min，除去乙醇。

8. 加入30 μl DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

（二）快速电泳检测

10μl RNA＋1μl buffer点样电泳，200V，稳压，10min。

RNA

（三）RT

1. RNA的反转录

①在PCR管中依次加入

RNA模板8 μl

Olig（dT）18引物1μL

DEPC H2O 3 μL

混合后，70℃水浴5 min（破坏二级结构），迅速冰浴5min。

②在管中依次加入(反应体系为20 μL)：

5×RT buffer 4μL

RNasin 1μL

10mM dNTP 2μL

混匀，37℃保温5min。

M-MΜLV反转录酶 1 μL

置于42℃水浴，1h。

③ 70℃保温5min（使酶失活）。

④于-20℃保存备用。

(四) PCR扩增cDNA

（１）在灭菌的0.2ml PCR管中，依次加入

3μl cDNA

10μl 10×PCR buffer（含Mg2+）

2μl RT引物AWP12

加ddH2O 补足２０μl ，混匀。

（２）在灭菌的0.2ml PCR管中，依次加入

3μl 总DNA（小麦DNA）

10μl 10×PCR buffer（含Mg2+）

2μl RT引物AWP12

加ddH2O 补足20μl ，混匀。

PCR程序：

94 ℃ 3 min

95 ℃30 s

35 cycles: 55 ℃60 s

72 ℃90 s

72 ℃10 min

RT-PCR

实验分析：（1）因为RNA酶的广泛存在，所以要提取出纯度较高且质量较好的RNA

就需要较高要求，所以本实验最能考验我们的操作技术和水平。

（2）RNA的电泳结果表明我们小组的操作水平存在很大问题，RNA几乎没有，最可能的原因是操作不规范导致RNA被RNA酶降解。

（3）cDNA电泳的结果也不好。按理论上讲，因为逆转录产生的cDNA中没有内含子，所以会比总DNA短，因此电泳时，cDNA泳道中的条带应该是离点样孔比较远。

第三部分：试验总结

1、本次实验从总体上讲，自己表现良好，没有迟到早退和旷课现象。并且比较认真的学习

理论知识和进行实验前预习。实验的基本过程和操作都认真参与，除了一些实验室条件不允许以及涉及班级共享问题的实验外。

2、然而，从每一个部分的实验结果看，这一次实验又是不理想的。可以看到，虽然每一次

实验都会有结果，但是并不成功。证明自己的实验操作技术急需加强。另外，自己对每一次实验的原理以及每一个操作步骤的理论知识并不掌握得很好，还不具备独立分析最终结果的能力，大部分时候都是依赖老师。希望自己在以后的实验中多锻炼和注意。

3、未能对实验结果进行及时的分析与整理，包括实验中出现的问题与电泳结果的照片。

4、对本次试验的意见与建议：建议老师提前将整个实验的思路进行讲解，以便同学们对电

泳的结果进行明确的命名。让同学们对自己的最终结果进行点评。