β-半乳糖苷酶活性分析
用试纸法快速检测β-半乳糖苷酶活性的研究
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β-半乳糖苷酶 标准
β-半乳糖苷酶，也被称为乳糖酶，是一种在生物体内广泛存在的水解酶。
它主要负责催化β-半乳糖苷键的断裂，从而在各种生物过程中发挥关键作用。
β-半乳糖苷酶的标准包括以下几个方面：1.定义和性质：β-半乳糖苷酶是一种能够催化水解β-半乳糖苷键的酶，具有高效性和专一性。
它通常由大肠杆菌、酵母、霉菌等微生物产生。
2.反应式和最适pH值：β-半乳糖苷酶的反应式通常表示为“底物+水→产物”。
其最适pH值一般在6.5-7.5之间，具体取决于不同来源的酶。
3.米氏常数：β-半乳糖苷酶的米氏常数是用来描述酶促反应动力学的一个常数，表示酶促反应速度与底物浓度之间的关系。
米氏常数的值会影响酶的催化效率。
4.专一性：β-半乳糖苷酶对底物的专一性较高，主要作用于含有β-半乳糖苷键的化合物。
不同来源的酶对底物的专一性可能会有所不同。
5.抑制剂和激活剂：一些物质可以抑制或激活β-半乳糖苷酶的活性，例如某些金属离子、有机溶剂等。
了解抑制剂和激活剂对酶的影响有助于更好地控制酶促反应的条件。
6.纯度要求：对于应用β-半乳糖苷酶的实验或工业生产，纯度是一个重要的考虑因素。
所需的纯度至少每毫克蛋白应含30单位的酶活性，而且其他糖苷酶的含量应少于0.01%。
7.稳定性：β-半乳糖苷酶的稳定性也是其标准之一。
它应能够在一定的温度和pH值条件下保持较长时间的活性，以便在实际应用中使用。
8.意义和应用：β-半乳糖苷酶在食品工业、生物制药、生物工程等领域有广泛应用，例如用于生产婴幼儿食品、测定生物样品中乳糖含量等。
了解其意义和应用有助于更好地发挥其作用。
总之，了解β-半乳糖苷酶的标准有助于更好地理解其性质和作用机制，为其在实际应用中的使用提供依据。
(完整版)β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化毕业设计
摘要从土壤中筛选出一株产β-半乳糖苷酶的枯草芽孢杆菌，并对菌株和其产生的β-半乳糖苷酶进行了测定。
单菌落的最佳生长时间是10h，最佳接种量是2.0%，最佳培养时间24h；该菌株产生的β-半乳糖苷酶的最适pH 是6.5，最适生长温度为37℃，酶的稳定性较高，4h后相对酶活仍能维持85%以上；Mg2+对酶活性的促进作用最强，当浓度为10 mmolL时，酶活力可达112.24％，Cu2+对酶活性抑制作用最强，少量Cu2+（1mmolL）就可使酶失活。
本实验还进行了β-半乳糖苷酶的固定化实验。
以海藻酸钠为栽体、戊二醛为交联剂，对乳糖酶进行固定化。
研究了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、戊二醛浓度、固定化时间对酶固定化的影响，并对固定化酶酶促反应的最适pH、温度等进行了测定。
结果表明，4％的海藻酸钠，在温度37℃、pH6~7、氯化钙浓度1％、戊二醛浓度0.1%下对乳糖酶的固定化率最高。
酶促反应特性测定结果表明，固定化后乳糖酶的稳定性增强，最适温度范围较非固定化乳糖酶大，最适pH范围与非固定化乳糖酶大致相同。
但固定化酶珠体机械强度较差，尚待改进。
关键词：β-半乳糖苷酶酶活性酶的固定化AbsractA strai n isolated from soil in producing β-galactosidase of Bacillus subtilis, and strains and β-galactosidase were measured which produces. A single colony of the best growth time is 10h, the best inoculum was 2.0%, the best culture time 24h; optimum pH β-galactosidase enzyme produced by this strain is 6.5, the optimum temperature is 37℃, enzyme be maintained above 85%; Mg2+on the activity of promoting the strongest, when the concentration of 10 mmolL, the enzyme activity of up to 112.24%, Cu2+ inhibition of enzyme activity most, a small amount of Cu2+ (1mmolL) can inactivate the enzyme.The experiments were also β-galactosidase immobilization experiments. The lactase was immobilized on sodium alginate carrier by cross-link with glutaraldehyde. The effects of flutaraldehyde concentration, amount of the enzyme and temperature immobilization were analyzed. The reaction conditions (optimun pH and temperature) of the immobilized lactase were studied. The results show that the of enzyme目录摘要 (I)Absract (II)目录 ............................................................................................................................................ I II 第1章绪论 (7)1.1 研究背景 (7)1.2 课题研究目的和意义 ..................................................................... 错误！未定义书签。
β-半乳糖苷酶的活性测定中注意事项
细胞内β - 半乳糖苷酶的活性测定
影响活性测定的因素
1、菌量的选择：与后面A550值大小有关。
A550值>0.05时，影响A420值。
2、裂解时间：与1)酶的释放是否彻底，决定实验结果的重现性；2)后面A550值大小有关。
3、反应时间：A420测定值是否与时间成线性关系。
4、反应产物的A420的线性范围。
5、活性计算：MIU=A420/t/(A600xV)。
这个值用于比较各种菌之间的酶活。
确定上述因素的实验
1. 菌量按照1OD600取10μl，20μl，40μl的量来取菌液
2. 裂解时间分别取5min，10min，15min，
3. 反应时间一般按照5min来反应
4. A420的线性范围的确定。
若测得的A420为0.8，稀释2倍为0.4，稀释4倍为0.2，稀释5倍的值不为0.16，则可以确定其线性范围为0.2-0.8
5. 细胞裂解后，测得的A550>0.05
6.最终测得的A420要大于0.5以减少误差。
菌量裂解时间反应时间A420 A550
10μl 5min 5min
10min
15min
20μl 5min 5min
10min
15min
40μl 5min 5min
10min
15min。
GENMED真菌酵母细胞半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书
GENMED SCIENTIFICS INC.GENMED真菌/酵母细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）要紧用途GENMED真菌/细胞β-半乳糖苷酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在利用化学和物理方式，快速有效地裂解真菌细胞，通太高速离心，取得澄清细胞裂解悬液，在β-半乳糖苷酶反映体系里，以邻硝基苯基-β-D- 半乳糖苷为无色底物，水解所产生的亮黄色的邻硝基酚，即采纳比色法定量测定细胞裂解悬液制备样品中的β-半乳糖苷酶活性，藉此成立一种简单的定量评判报告基因的权威而经典的技术方式。
该技术通过精心研制、成功实验证明的。
普遍应用于基因组学、蛋白质组学和其它分子生物学研究。
其适用于转基因后的真菌/酵母活体细胞分析。
产品即到即用，性能稳固，参数优化，操作简便、比色灵敏，可谓国际上同类产品最正确。
技术背景大肠杆菌的标志基因Lac Z编码β-半乳糖苷酶（β-galactosidase ；β-gal），在其催化作用下，半乳糖可从乳糖的水解作用中取得。
β-半乳糖苷酶超级稳固，对蛋白水解降解作用抗性强，且容易测试。
因此β-半乳糖苷酶成为目前最经常使用的报告基因，以评判载体转染的成效。
邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷（o-nitrophenyl-β-D-galactopyraniside；ONPG），是一种无色底物，以替代乳糖，在β-半乳糖苷酶的催化下，水解成无色的半乳糖和亮黄色的邻硝基酚（o-nitrophenol；ONP），通过420nm波长的吸光值分析，来测定β-半乳糖苷酶的活性单位。
产品内容GENMED裂解液（Reagent A）10毫升GENMED强化液（Reagent B）2毫升GENMED活性液（Reagent C）250微升GENMED稀释液（Reagent D）20毫升GENMED反映液（Reagent E）4毫升GENMED终止液（Reagent F）10毫升产品说明书1份保留方式保留GENMED裂解液（Reagent A）、GENMED活性液（Reagent C）和GENMED反映液（Reagent E）在－20℃冰箱里，幸免反复冻融；其余的保留在4℃冰箱里；GENMED反映液（Reagent E）幸免光照；有效保证6月用户自备15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器毫升离心管：用于样品操作的容器（微型）台式离心机：用于样品操作比色皿或酶标板：用于比色分析的容器恒温水槽或培育箱：用于反映物孵育计时器：用于反映计时分光光度仪或酶标仪：用于比色分析实验步骤实验开始前，开启分光光度仪预热，设置波长420nm；开启恒温水槽，设置温度为28℃。
细胞衰老检查的实验技术及原理(一)
细胞衰老检查的实验技术及原理（一）关键词：细胞色素成纤维细胞酶磷酸试剂标准物质北京标准物质网衰老细胞的形态变化主要表现为形状变大、变平、胞核增大、核膜内陷、染色质固缩、胞内溶酶体变多等。
衰老细胞中细胞器数量尤其是线粒体数量减少，胞质内有色素堆积和空泡形成，最终导致细胞死亡。
总体来说衰老细胞的各种结构呈退行性变化。
根据其特征，目前常用于检测衰老的方法如下：一、β-半乳糖苷酶活性1995年，Dimiri等发现体外培养二倍体成纤维细胞在培养基pH值为6时，其β-半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而逐渐上调，他们把这种中性β-半乳糖苷酶定义为SA-β-gal，即衰老相关的β-半乳糖苷酶。
衰老细胞或组织产生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X—Gal，生成深蓝色产物，从而在光学显微镜下很容易观察到(图5-5-1)。
在人体表皮角质层细胞中，也可以发现SA-β-gal 随年龄的增加而增加。
并且，SA-β-gal不依赖于DNA复制，可以区分衰老细胞与静止期的细胞。
SA-β-gal是一种体内体外都适用的检测衰老的生物标记物。
由于检测SA-β-gal的方法简单易行，其在检测衰老细胞方面有很广泛的应用，目前已经有2400多篇论文应用了这种方法。
二、端粒长度的检查端粒是位于真核细胞染色体末端顶部的核蛋白结构，由高度保守的TTAGGG 重复序列组成，其存在可以保护染色体末端，是维持染色体稳定的重要因素。
鉴于端粒的特殊结构，端粒的长度会随着每次细胞的分裂而缩短，因此，端粒长度是衰老的一个重要生物标志。
这里我们主要讨论端粒限制性片段(TRF)分析及荧光原位杂交(FISH)法。
端粒限制性片段分析：TRF分析也称作端粒的Southern印迹法，是应用针对端粒重复序列的探针来检测限制性酶切后所保留的端粒的方法。
限制性酶会将基因组DNA消化为短的片段，留下大量完好的端粒，即所谓的端粒限制性片段。
以凝胶电泳分离基因组片段，通过放射性探针(CCCTAA)。
β-半乳糖苷酶活性测定方法
β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。
Z buffer (总体积100 ml)：Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO4·7H2O1mM 0.0246gβ-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。
Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.0624gONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。
乳糖固定化实验报告
一、实验目的1. 了解乳糖酶的性质和作用。
2. 掌握乳糖酶固定化的基本原理和方法。
3. 研究不同固定化方法对乳糖酶活性的影响。
4. 探讨固定化乳糖酶在乳糖水解中的应用。
二、实验原理乳糖酶（β-半乳糖苷酶）是一种能够催化乳糖水解为葡萄糖和半乳糖的酶。
乳糖不耐受症患者由于体内缺乏乳糖酶，无法消化乳糖，导致食用乳制品后出现腹胀、腹泻等症状。
固定化乳糖酶可以克服传统酶制剂的缺点，如酶活性不稳定、易失活等，从而提高乳糖水解效率。
本实验采用化学结合法将乳糖酶固定化在载体上，通过比较不同固定化方法对酶活性的影响，筛选出最佳的固定化方法。
三、实验材料与仪器材料：1. 乳糖酶2. 载体：壳聚糖、明胶、海藻酸钠3. 乳糖4. 磷酸盐缓冲液5. pH计6. 离心机7. 酶标仪仪器：1. 烧杯2. 移液器3. 恒温水浴锅4. 电子天平5. 显微镜四、实验步骤1. 乳糖酶溶液的制备：将乳糖酶用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的酶溶液。
2. 载体的制备：a. 壳聚糖：将壳聚糖用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。
b. 明胶：将明胶用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。
c. 海藻酸钠：将海藻酸钠用磷酸盐缓冲液溶解，配制成一定浓度的溶液。
3. 乳糖酶固定化：a. 壳聚糖固定化：将壳聚糖溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。
b. 明胶固定化：将明胶溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。
c. 海藻酸钠固定化：将海藻酸钠溶液与乳糖酶溶液混合，搅拌均匀，加入一定量的交联剂戊二醛，反应一定时间后，用离心机分离固定化酶。
4. 固定化酶的活性测定：将固定化酶分别与乳糖溶液混合，在一定条件下进行水解反应，通过测定水解产物的浓度来计算酶的活性。
5. 结果分析：比较不同固定化方法对乳糖酶活性的影响，筛选出最佳的固定化方法。
五、实验结果与分析1. 固定化酶的活性：通过实验发现，壳聚糖固定化酶的活性最高，明胶固定化酶的活性次之，海藻酸钠固定化酶的活性最低。
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β-半乳糖苷酶活性检测
nifH-lacZ表达的β-半乳糖苷酶活性测定：
（1）液体活化待测菌株，将待测菌株接种于5ml含适当抗生素的液体L3基本培养基中，37℃摇床，250rpm振荡，过夜培养；
（2）收集菌体，并用无氮的L3基本培养基洗2次；
（3）将菌液用不含氮的L3培养基稀释至OD600=0.2~0.4；
（4）将4ml菌液注射至事先配气的血清瓶中（空气+氩气，调整合适的氧气浓度，微好氧3%），37℃，200rpm诱导3.5~4hr（每个样品3个重复）；
（5）取出2ml样品于离心管中，100μl用于测定β-半乳糖苷酶活性，其余用于测定OD600；（6）100μl样品加到2ml离心管中，加入900μl Z-Buffer混匀，加入20μl 0.1%SDS，40 μl 氯仿，振荡20~30sec，同时设两个空白对照，加入100μl不含菌体的培养基作为样品，其余与测试样品的处理完全一致；
（7）样品和ONPG (4mg/ml)置于28℃水浴平衡5~10min，依顺序加入200μl ONPG并准确计时，直至样品变黄，加500μl 1M Na2CO3溶液终止反应，准确记录反应时间；
（8）离心12000rpm，15min，取上清测定OD420和OD550。
按以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性：
（T：反应时间，V：反应中菌体体积）
β-半乳糖苷酶活性分析试剂:
（1）Z-buffer：16.1g/L Na2HPO4·7H2O；5.5g/L NaH2PO4·H2O；0.75g/L KCl；0.246g/L MgSO4·7H2O；调pH至7.0，121℃灭菌30min，室温可保存一年。
（2）Z-buffer/β-ME ：100ml Z-buffer中加入0.27ml β-巯基乙醇。
（3）ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷): 提前两小时将ONPG溶于Z-buffer/β-ME中，浓度为4mg/ml，-20°C保存。