奶粉中金黄色葡萄球菌的检测
奶粉中金黄色葡萄球菌的检测一、【实验步骤】1.样品的采集和送检采取10包小型包装的奶粉，注意要采取整件包装及包装的完整性。
2.检样处理用75%酒精棉球擦拭消毒袋口后，手戴消毒手套，以无菌刀打开袋口，无菌杓对10个包装进行取样，注意每取一个样品时更换新的无菌刀，杓。
在铺有等大无菌硫酸纸的精度为0.1g的分析天平上分别秤取10个样品各25g并放入10个装有玻璃珠的三角烧瓶内，每秤取一个新样品时更换新的无菌硫酸纸，用记号笔在烧瓶底部分别编号为1~10，用1个200ml 的灭菌量筒和1个50ml灭菌的量筒分别量取200ml和25ml已用电炉温热的灭菌生理盐水共225ml徐徐加入1号三角烧瓶内（先加少许使奶粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结块），振摇均匀，使充分溶解后即为1：10稀释液。
2~10号烧瓶操作与1号相同。
小结：这一过程需要的仪器试剂有75%酒精棉球一包，消毒手套一双，无菌刀十个，无菌杓十个，无菌硫酸纸20张，精度0.1g的分析天平一台，300ml装有玻璃珠的三角烧瓶十个，记号笔一支，200ml灭菌量筒一个，50ml灭菌量筒一个，灭菌生理盐水 10L，1L大烧杯2个。
3.增菌培养用电炉将7.5%NaCl肉汤培养基加热至融化，取10个直径9cm的无菌平皿用记号笔在平皿底部分别编号为1~10，用一个 50ml的灭菌量筒量取45ml融化的培养基倒入1号平皿中，用一支5ml的无菌吸管吸取一号烧瓶中的稀释液5ml加入1号平皿中，2~10号样品按同法制成相应的2~10号平皿，注意每吸取一个样品需要更换一支新的5ml灭菌吸管。
将这十个平皿置于37℃温箱培养24h。
看到样品在肉汤中呈浑浊生长。
小结：这一过程需要的仪器试剂有电炉一台，37℃温箱一台，直径9cm的无菌平皿10个，记号笔一支，50ml的灭菌量筒量一个，5ml的无菌吸管十支，锥形瓶一个，2L烧杯一个。
4.分离培养用一支用酒精灯火焰充分消毒并凉至室温的接种针取一个平皿的增菌培养物划线接种至血平板和Baird-Parker平板（注意接种下一个平皿中的增菌培养物时要用酒精灯火焰消毒接种针）在平板底部用记号笔标记其所来自样本的编号，将其置于37℃温箱培养24h取可疑菌落（金黄色葡萄球菌在血平板上菌落为金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。
在Baird- Parker平板上的菌落较小，圆形、光滑突起、湿润，直径2~3mm，灰黑到黑色，边缘为淡色，周围为一圈浑浊带，在其外层有一透明圈。
用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无浑浊带和透明圈）作革兰染色镜检，金葡菌为革兰阳性球菌，葡萄状排列，无芽孢，无荚膜，根据此特性，将可疑菌落同法接种于琼脂斜面及普通肉汤中，分别相应标记为1~10号，37℃培养24h，作进一步鉴定。
小结：这一过程需要的仪器试剂有酒精灯一个，火柴一盒，接种针一支，37℃温箱一台，血平板和Baird-Parker平板各十个，显微镜一台，琼脂斜面及普通肉汤管各10个,1L烧杯2个。
5.血浆凝固酶试验（1）玻片法：取干净玻片一块，用记号笔将玻片划成两格，背面标记为1，用两支吸管分别滴加新鲜兔血浆及生理盐水各一滴，用两支用酒精灯火焰充分消毒并凉至室温的接种针挑取步骤4中1号琼脂斜面的待检菌落分别于血浆和生理盐水混合，立即观察结果，同法处理其余九个样品。
每挑取一次待检菌后均需要对接种针在酒精灯火焰上消毒并凉至室温。
如血浆中有明显颗粒出现，而生理盐水中无自凝现象即为阳性。
小结：这一过程需要的仪器试剂有干净玻片十块，记号笔一支，新鲜兔血浆15ml，生理盐水100ml，100ml、200ml烧杯各一个，酒精灯一个，接种针一个。
（2）试管法:用一支10ml的吸管吸取新鲜兔血浆10ml置于一个100ml的烧杯中，用一个50ml的量筒量取40ml生理盐水倒入盛有新鲜兔血浆的烧杯中，轻振混匀，此即1：4血浆，用一支1ml的吸管吸取0.5ml混合液放入标记为1号的小试管中，再用一支1ml的吸管吸取培养24h的1号待检菌株肉汤培养物0.5ml，同法处理其余九个样品，编号，将十个试管轻振混匀后放入37℃温箱中，同法处理其余九个个样品，试管外壁相应编号为1~10。
每半小时观察一次，观察6h同时分别在已知阴性和阳性葡萄球菌肉汤培养物及肉汤培养基中加入1：4血浆0.5ml，分别标记为a、b、c，作为对照，分别用记号笔按下表编号为1~4（表1）表一金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验（试管法）试管血浆（1：4）细菌培养液肉汤a0.5ml已知阳性菌0.5ml__b0.5ml已知阴性菌0.5ml__c0.5ml__ __0.5ml1~100.5ml待检菌0.5ml__通常在3~4h出现血浆凝固。
观察时将试管倾斜或倒置，如呈现凝块者被认为是阳性。
多数情况下玻片法与试管法二者结果平行，符合率通常在90%。
偶有玻片法阴性而试管法阳性，此时应用试管法证实。
小结：这一过程需要的仪器试剂有10ml吸管一支，50ml量筒一个，100ml烧杯一个，生理盐水100ml，100ml烧杯两个，1ml吸管十一支，小试管十三个，试管架一个，37℃温箱一台，记号笔一支。
6.肠毒素测定液体透析培养法：用一个100ml的无菌量筒量取60ml产毒培养基装入一个宽2.5cm、长80cm的透析袋中，两端用棉线扎紧，将透析袋放入250ml三角烧瓶内，用一个50ml量筒量取15ml灭菌生理盐水加入三角烧瓶内，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高压灭菌30min。
用一支5ml吸管吸取5ml生理盐水置于步骤4中已培养24小时的待测菌琼脂斜面培养物上洗下菌落，倾入上述培养瓶中，每个菌种一瓶，共十瓶标记为1~10号，37℃振荡培养48h，振速为100r/min。
用十支灭菌吸管吸出菌液于十个灭菌离心管中，对应标记为1~10，800r/min离心30min，用十支灭菌滴管吸取上清液做双向琼脂扩散，在抗血清和提取物之间有明显沉淀线为阳性，如为阴性，再装入透析袋内，用电风扇吹，再做琼脂扩散。
小结：这一过程需要的仪器试剂有产毒培养基1L，500ml,2L灭菌烧杯各一个，100ml、50ml灭菌量筒各一个，宽2.5cm、长80cm的透析袋十个，棉线2m，剪刀一把，250ml三角烧瓶十个，生理盐水300ml，高压灭菌锅一台，5ml灭菌吸管一支，37℃温箱一台，离心机一台，灭菌离心管十个，灭菌滴管十支，记号笔一支。
【实验步骤中所需仪器试剂】仪器设备：精度0.1g的分析天平一台，电炉一台，37℃温箱一台，显微镜一台，高压灭菌锅一台，离心机一台，300ml装有玻璃珠的三角烧瓶十个，250ml灭菌三角烧瓶十个，200ml灭菌量筒一个，100ml灭菌量筒一个，50ml灭菌量筒四个，2L灭菌烧杯三个，1L灭菌烧杯四个，500ml灭菌烧杯一个，200ml灭菌烧杯一个，100ml 灭菌烧杯四个，10ml灭菌吸管一支，5ml的无菌吸管十一支，1ml灭菌吸管十一支，灭菌离心管十个，灭菌滴管十支，灭菌小试管十三个，锥形瓶一个，酒精灯一个，火柴一盒，接种针一支，试管架一个。
材料：75%酒精棉球一包，消毒手套一双，无菌刀十个，无菌杓十个，无菌硫酸纸20张，记号笔一支，灭菌生理盐水10L，新鲜兔血浆15ml，产毒培养基 1L，直径9cm的无菌平皿10个，血平板和Baird-Parker平板各十个，琼脂斜面及普通肉汤管各10个,干净玻片十块，宽2.5cm、长 80cm的透析袋十个，棉线2m，剪刀一把。
二、【培养基配制】1.Baird-Parker培养基(PH7.5)制法：用两个50ml量筒分别量取30%卵黄盐水50ml和除菌过滤的1%亚硫酸钾溶液10ml 加入到一个100ml的锥形瓶内，加盖在冰箱中保存。
在一个2L的烧杯中加入950ml蒸馏水，用精度0.1g的分析天平分别秤取胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏1.0g，丙酮酸钠10.0g，甘氨酸12g，氯化锂(含6个结晶水)5.0g，琼脂20.0g，注意药品用不锈钢药杓取，每更换一个药品需更换一个新的药杓。
药品称好后均加入到此2L烧杯中，用玻璃棒搅拌，置于电炉上加热煮沸至完全溶解。
冷却至25℃，用滴管吸取氢氧化钠溶液及稀盐酸来调节培养基的PH，与精密PH试纸对比至PH为7.5。
用一个100ml量筒量取95ml，分装入十个100ml 的锥形瓶中，每瓶95ml，121℃（103.4kPa）高压灭菌15min。
临用时加热融化琼脂，冷至50℃，用一支5ml的吸管吸取预热至50℃的卵黄亚硫酸钾增菌剂5ml十次，在每个锥形瓶中均加入该增菌剂5ml，摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在并向储存不得超过48h。
小结：这一过程需要的仪器试剂有高压灭菌锅一台，精度0.1g的分析天平一台，冰箱一台，电炉一台，不锈钢药杓八个，等大硫酸纸二十张，玻璃棒一个，精密PH试纸五条，直径9cm的无菌平皿十个，50ml量筒两个，100ml量筒一个，30%卵黄盐水 50ml，除菌过滤的1%亚硫酸钾溶液10ml，100ml的锥形瓶十一个，2L烧杯一个，500ml烧杯两个，滴管两个，5ml吸管一支，蒸馏水1L，氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏1.0g，丙酮酸钠10.0g，甘氨酸12g，氯化锂(含6个结晶水)5.0g，琼脂20.0g。
2.7.5%氯化钠肉汤（PH7.4）制法：在一个2L的烧杯中加入1L蒸馏水待用，用精度为0.1g的分析天平分别秤取蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠75.0g加入到刚才的2L 烧杯中，注意药品用不锈钢药杓取，每更换一个药品需更换一个新的药杓。
用玻璃棒搅拌，用电炉加热煮沸至完全溶解，冷至25℃，与Baird-Parker培养基同法校正PH值至7.4，分装入十个试管，121℃（103.4kPa）高压灭菌15min，待用。
小结：这一过程需要的仪器试剂有高压灭菌锅一台，精度0.1g的分析天平一台，电炉一台，不锈钢药杓三个，等大硫酸纸十张，玻璃棒一个，精密PH试纸五条，大试管十个，2L烧杯一个，500ml烧杯两个，滴管两个，蒸馏水1L，氢氧化钠溶液及稀盐酸各 200ml，蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠75.0g。
【制备培养基中所需仪器试剂】仪器设备：这一过程需要的仪器试剂有高压灭菌锅一台，精度0.1g的分析天平一台，冰箱一台，电炉一台，玻璃棒一个，100ml量筒一个，50ml量筒两个，2L烧杯两个，500ml烧杯两个，100ml的锥形瓶十一个，滴管两个，5ml吸管一支，大试管十个。
材料：不锈钢药杓十一个，等大硫酸纸三十张，精密PH试纸五条，直径9cm的无菌平皿十个，30%卵黄盐水50ml，除菌过滤的1%亚硫酸钾溶液10ml，蒸馏水2L，氢氧化钠溶液及稀盐酸各200ml，胰蛋白胨10.0g，牛肉膏5.0g，酵母膏 1.0g，丙酮酸钠10.0g，甘氨酸12g，氯化锂(含6个结晶水)5.0g，琼脂20.0g。
乳粉中金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果分析
乳粉中金黄色葡萄球菌定量检测能力验证结果分析
这项能力验证试验是根据ISO7218：2024《食品和饲料微生物学总则》的要求进行的。
试验中使用了一系列的乳粉样品，其中一部分样品是事先
确定金黄色葡萄球菌菌落形成单位（CFU）浓度的标准样品，另一部分样
品是未知浓度的待测样品。
试验中通过培养基和平板计数法对金黄色葡萄
球菌进行定量检测。
试验者将标准样品和待测样品分别接种到培养基上，
经过一定的培养时间后，对培养基上的菌落进行计数，从而得出金黄色葡
萄球菌的浓度值。
试验的结果显示，定量检测能力验证试验的数据符合预期结果。
通过
对标准样品的定量检测，试验者能够准确地获得金黄色葡萄球菌的浓度值，与事先确定的浓度值非常接近。
这表明试验者具备了准确测定乳粉中金黄
色葡萄球菌的能力。
另外，对待测样品的定量检测结果也能够反映出样品
中金黄色葡萄球菌的浓度情况。
通过与标准样品的比较，可以判断待测样
品中金黄色葡萄球菌的浓度是否符合安全标准。
总结起来，乳粉中金黄色葡萄球菌定量检测能力验证的结果分析显示，试验者具备了准确测定金黄色葡萄球菌浓度的能力。
这将有助于保障乳粉
的质量和安全性。
然而，在进行乳粉生产过程中，仍需加强对金黄色葡萄
球菌的检测和控制，以确保产品的质量和安全达到最佳水平。
食品中金黄色葡萄球菌检测方法（依据GB4789）
食品中金黄色葡萄球菌检测方法（依据GB4789）食品中金黄色葡萄球菌的检测方法1.范围本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检测方法。
本标准第一法适用于金黄色葡萄球菌的定性检测；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
2.设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃±1℃。
2.2冰箱：2℃～5℃。
2.3恒温水浴箱：37℃～65℃。
2.4天平：感量0.1g。
2.5均质器。
2.6振荡器。
2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器。
2.8无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。
2.9无菌培养皿：直径90mm。
2.10 注射器：0.5mL。
2.11 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.12 全自动微生物生化鉴定系统。
（BD Crystal或Phoenix）。
2.13 比浊仪。
（BD Phoenix比浊仪，货号440910）。
2.14 比浊仪定标盒。
（BD Phoenix定标盒，货号440911）。
3.培养基和试剂3.110 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤。
3.27.5 %氯化钠肉汤。
3.3血琼脂平板。
（BD 货号脑心浸液琼脂241830胰蛋白大豆琼脂236950作为基础加兔血浆）3.4Baird-Parker 琼脂平板。
（BD 货号276840）3.5脑心浸出液肉汤(BHI)。
（BD 货号237400）3.6 稀释液：磷酸盐缓冲液。
(BD 货号211544)3.7 营养琼脂小斜面。
（BD 货号212000）3.8 革兰氏染色液。
（BD 货号212539）3.9 无菌生理盐水。
第一法金黄色葡萄球菌的定性检验4. 检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1：36℃±1℃ 18h ～24h 36℃±1℃ 血平板18h ～24hBaird-Parker 平板18h ～24h 或45h ～48h 36℃±1℃ 18h ～24h 图1 金黄色葡萄球菌检验程序5. 操作步骤5.1 样品的处理称取25g 样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min ，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min ～2min 。
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方法Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT金黄色葡萄球菌检测方法1.纸片法目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。
采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。
技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。
技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。
此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。
但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。
使目视效果下降，导致计数偏低。
2.免疫学方法各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。
抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。
金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。
在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。
目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。
免疫学方法包括下面两个部分：（1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。
奶粉中金黄色葡萄球菌的检测
奶粉中金黄色葡萄球菌的检测一、【实验步骤】1.样品的采集和送检采取10包小型包装的奶粉，注意要采取整件包装及包装的完整性。
2.检样处理用75%酒精棉球擦拭消毒袋口后，手戴消毒手套，以无菌刀打开袋口，无菌杓对10个包装进行取样，注意每取一个样品时更换新的无菌刀，杓。
在铺有等大无菌硫酸纸的精度为0.1g的分析天平上分别秤取10个样品各25g并放入10个装有玻璃珠的三角烧瓶内，每秤取一个新样品时更换新的无菌硫酸纸，用记号笔在烧瓶底部分别编号为1~10，用1个200ml 的灭菌量筒和1个50ml灭菌的量筒分别量取200ml和25ml已用电炉温热的灭菌生理盐水共225m l徐徐加入1号三角烧瓶内（先加少许使奶粉调成糊状，再全部加入，以免奶粉结块），振摇均匀，使充分溶解后即为1：10稀释液。
2~10号烧瓶操作与1号相同。
小结：这一过程需要的仪器试剂有75%酒精棉球一包，消毒手套一双，无菌刀十个，无菌杓十个，无菌硫酸纸20张，精度0.1g的分析天平一台，300ml装有玻璃珠的三角烧瓶十个，记号笔一支，200ml灭菌量筒一个，50ml灭菌量筒一个，灭菌生理盐水10L，1L大烧杯2个。
3.增菌培养用电炉将7.5%NaCl肉汤培养基加热至融化，取10个直径9cm的无菌平皿用记号笔在平皿底部分别编号为1~10，用一个 50ml的灭菌量筒量取45ml融化的培养基倒入1号平皿中，用一支5ml的无菌吸管吸取一号烧瓶中的稀释液5ml加入1号平皿中，2~10号样品按同法制成相应的2~10号平皿，注意每吸取一个样品需要更换一支新的5ml灭菌吸管。
将这十个平皿置于37℃温箱培养24h。
看到样品在肉汤中呈浑浊生长。
小结：这一过程需要的仪器试剂有电炉一台，37℃温箱一台，直径9cm的无菌平皿10个，记号笔一支，50ml的灭菌量筒量一个，5ml的无菌吸管十支，锥形瓶一个，2L烧杯一个。
乳与乳制品病原微生物检验方法金黄色葡萄球菌肠毒素的检验
乳与乳制品病原微生物检验方法金黄色葡萄球菌肠毒素的检验 YLNB4.21. 仪器及器材1.1德国必发葡萄球菌肠毒素试剂盒 （套）1.2酶标仪1.3移液器 Termo Labsystems 50 μL 、100μL 、300μL （多道）1.4低温离心机及离心管：3500转/分1.5灭菌吸管：1ml （具0.01ml 刻度）、10ml （具0.1ml 刻度）1.6 NaH2PO4。
H2O 、 Na2HPO4。
2H2O 、NaCI 、 n--庚烷2. 检验程序：室温 ，1 h样品前处理加入100 µL 样品(A---G 孔)在H 孔中，加100 µL反复洗板（至少３次）将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架加100 µL酶共轭化合物室温， 1 h反复洗板（至少３次）加５0 µL的培养基和５0 µL色液体室温， 0.5 h加100 µL终止液60min内测量吸光度值分析结果出报告3. 方法3.1样品前处理3.1.1 牛奶：取10ml样品于离心管内进行低温离心（10min/3500转/10℃）后去除上层油脂层，取上清液1ml，按1：20的比例用蒸馏水稀释后无菌过滤。
3.1.2 面、米、肉、奶油及其他脂肪含量低于40%的食品：取10g样品切碎（最好进行均质），添加15mL缓冲液，调节PH值至7.4，摇匀15min后进行离心（10min/3500转/15℃），如必要去除上层油脂层，过滤。
3.1.3 脂肪含量超过40%的食品：取10g样品切碎（最好进行均质），添加15mL缓冲液，调节PH值至7.4，摇匀15min 后进行离心（10min/3500转/15℃），取5mL上层液转移到另一个离心管内，加5mL的n—庚烷，充分混匀后再离心（5min/3500转/15℃），去除上层庚烷层，过滤。
3.2测试操作3.2.1 把所有试剂在使用之前均放至室温（20—25℃）。
食品中金黄色葡萄球菌检验 GBT4789.10-2010
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定性方法
2003版
结 果 判 定
划线Baird-Parker平板：
§菌落直径为2mm～3mm ； §颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外 层有一透明圈； §用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非 脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈；
§长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产 生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥；
方法的注意事项
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使用前，如Baird－Parker平板表面有水珠，可放 在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的 水珠消失。 如样液不易吸收，可将平板放在36℃±1℃孵育 1 h；等样液吸收后反转平皿， 再培养。
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Baird-Parker法
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计算
统一了样品的处理程序 增加了计数要求 选择20—200cfu菌数的平板
ml 无 加 10 10ml 菌水溶解
于37°C 下进行孵育 24小时
Baird Parker 琼脂 + RPF 与平板表面计数法的比較
g样品 + 225 ml 稀释液 25 25g 225ml
第一天
第二天
BPA+RPF BPA
阅读結果 ) (无需确认 无需确认)
挑可疑菌落 酶试验 进行凝固 行凝固酶试验
第三天
确认结果
MPN法
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依据
AOAC 987.09 FDA BAM 2001 德国 DIN EN ISO 6888-3:2003 SN0172-92标准 台湾检验方法 欧美国的一些产品的卫生标准要求
图 1 Baird －Parker 平板法检验程序 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌Baird Baird－ Parker平板法检验程序
婴幼儿食品中金黄色葡萄球菌污染情况及其耐药基因和新型肠毒素基因的检测
婴幼儿食品中金黄色葡萄球菌污染情况及其耐药基因和新型肠毒素基因的检测张阳，乔明宇，王新（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100）摘要：本文调查了婴幼儿奶粉和米粉中金黄色葡萄球菌的污染状况，并且检测其耐药基因和新型肠毒素基因。
采集陕西省2010年和2012年间不同品牌的婴幼儿奶粉和米粉692份，进行金黄色葡萄球菌污染检验，采用PCR对分离菌株进行31种耐药基因和9种新型肠毒素基因的检测。
692份样品中金黄色葡萄球菌的检出率为7.80%，其中2010年所采样品的检出率为8.17%，2012年所采样品的检出率为7.38%。
分离的75株菌最终检测出12种耐药基因和2种新型肠毒素基因，检出率最高的耐药基因是tetK (72.00%)，其次是blaZ (36.00%)，ermC (29.33%)，tet(K)F (21.33%)，linA/linA’ (12.00%)，dfrG (8.00%)，tetL (6.67%)和acc(6') (5.33%)，最少的为ermB，msrA、msrB和drfK (均为1.33%)。
新型肠毒素基因仅检测出sen（44.00%）和ser（4.00%）。
不同采样年份、生产季节和货架期的样品中金黄色葡萄球菌的污染率不存在显著差异。
并且这些菌株主要携带四环素、青霉素和大环内酯类抗生素的耐药基因，以及新型毒素基因sen。
关键词：婴幼儿食品；金黄色葡萄球菌；污染；耐药基因；新型肠毒素基因文章篇号：1673-9078(2016)11-280-285 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.11.042 Prevalence of Staphylococcus aureus Contamination in Infant Foods and the Detection of Antibiotic Resistance Genes and New Enterotoxin GenesZHANG Y ang, QIAO Ming-yu, W ANG Xin(School of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Y angling 712100, China) Abstract: The prevalence of S. aureus contamination in infant formula milk powder (PIF) and infant rice cereal (IRC) was investigated in this study, and the corresponding antibiotic resistance genes and novel enterotoxin genes were detected. A total of692 PIF and IRC samples of different brands were collected in the Shaanxi province of China in 2010 and 2012 and screened for S. aureus. Polymerase chain reaction (PCR) was employed to detect 31 antibiotic resistance genes and nine novel enterotoxin genes among the isolates. The overall positive rate for S. aureus in 692 samples was 7.80%, including 8.17% among the samples collected in 2010 and 7.38% among the samples collected in 2012. Among the 75 isolated strains of S. aureus, 12 types of antibiotic resistance genes and two novel enterotoxin gene profiles were detected. The resistance gene with the highest detection rate was tetK (72.00%), followed by blaZ (36.00%), ermC (29.33%), tet(K)F (21.33%), linA/linA (12.00%), dfrG (8.00%), tetL (6.67%), and acc(6') (5.33%), and the genes with the lowest detection rate were ermB, msrA, msrB, and drfK (all at 1.33%). Among the novel enterotoxin genes, only sen (44.00%) and ser (4.00%) were detected. No significant difference was found in the contamination rate of S. aureus among the samples from different sampling years and production months and with different shelf lives. Additionally, the primary antibiotic resistance genes that these strains carried conferred resistance to penicillin, tetracycline, and macrolide, and the main virulence gene was sen.Key words: infant foods; Staphylococcus aureus; antibiotic resistance genes; novel enterotoxin genes金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.收稿日期：2015-12-10基金项目：国家自然科学基金项目（31271858）；博士后基金项目（2015M582711）作者简介：张阳（1992-），女，硕士，研究方向：食品安全通讯作者：王新(1973-)，男，博士，副教授，研究方向：食源性病原及分子生物学和食品安全研究 aureus）是一种重要的食源性致病菌，它可以引起人呕吐、腹泻、肺炎等食物中毒症状[1]，在我国也有相关报道[2]。
牛奶中金黄色葡萄球菌的检测
食品科学技术学院
综合设计性实验立项申请书
课题名称：牛奶中金黄色葡萄球菌的检测
申请者：
专业年级：
通信地址：
联系电话：
E-mail：
申请日期：年月日
糖发酵试验：能分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖
色素产生情况：能产生金黄色色素
5毒力试验
将上述经过生化试验鉴定的细菌悬液用灭菌生理盐水作适当稀释，对随机分组的小鼠进行腹腔注射接种，接种量为0.5mL／只（家兔皮下接种1.0mL或者静脉接种0.1～0.5mL），能够致死动物或者内脏出现脓肿可以确定有毒力。
6病原菌的重分离试验
对接种后发病、死亡小鼠（家兔）的肝脏进行病原菌重分离。
进行菌落涂片、革兰氏染色、显微镜检查，观察所分离菌株是否为原接种菌。
如果是则进一步确定病原菌为金黄色葡萄球菌。
第一，金黄色葡萄球菌的检验
样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成10-1稀释液。
增菌培养：将10-1稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C 培养24小时。
分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24~48小时。
金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。
在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2~3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。
染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列的芽孢、荚膜，直径0.5~1μm。
检测牛奶中是否感染有金黄色葡萄球菌并鉴定
实验检测牛奶中是否感染有金黄色葡萄球菌并鉴定实验目的1、认识金黄色葡萄球菌；2、学习运用PCR方法检测金黄色葡萄球菌。
实验原理金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)属于葡萄球菌属（Staphylococcus），无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。
在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。
平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。
微生物学方法是鉴定牛奶中病原菌的“金标准”，传统方法是进行细菌分类培养，通过生化试验、血清型、各种酶试验分析细菌的表型特点。
对牛奶中病原微生物培养需要很长时间用生化试验的方法进行种属特异性的鉴定至少需要48h以上传统的鉴定技术时间较长，从国外进口诊断试剂费用相对较高。
因此，本文建立了直接从牛奶中鉴别病原菌的PCR检测技术，这种快速、准确、有效、直接从牛奶中检测致病菌的方法将为检验检疫、食品安全质检系统以及兽医检疫提供技术支撑，从而为乳制品病原菌的检测提供一定的帮助。
建立一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法。
方法是根据已发表的金黄色葡萄球菌16-23SrRNA特异性序列设计并合成一对引物，通过优化反应条件建立从牛奶中直接检测金黄色葡萄球菌的PCR方法。
结果是与细菌的常规分离方法相比，PCR 法敏感性高与其它型葡萄球菌无交叉反应，特异性达100%，检测细菌基因组DNA最低浓度为35ng/L（纳克每升），能在5h内对送检的牛奶样品直接进行金黄色葡萄球菌的测定，可用于乳制品中金黄色葡萄球菌的检测。
所以，建立了一种直接从牛奶中检测金黄色葡萄球菌的PCR快速诊断方法。
实验仪器、试剂与材料仪器：冰箱、摇床、显微镜、PCR反应管、PCR仪、微量加样器、高速离心官、水平电泳槽、恒压电泳仪和凝胶自动成像系统、紫外检测仪、电热恒温水浴槽。
PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌
实验结果
实验中分别对含金黄色葡萄球菌的乳品样本和不含该菌的样本进行了PCR检 测。结果显示，含有金黄色葡萄球菌的样本在凝胶电泳中出现了明显的目标条带， 而不含该菌的样本则没有目标条带。这表明该PCR方法可以准确检测乳品中的金 黄色葡萄球菌。
实验评估
实验灵敏度
通过对比不同浓度的金黄色葡萄球菌悬液进行PCR检测，发现该方法可以检 测到低至10 CFU/mL的金黄色葡萄球菌。因此，该PCR方法具有较高的灵敏度。
文献综述：
金黄色葡萄球菌广泛存在于自然界和人类环境中，肉类及肉制品是其主要污 染源之一。近年来，由于抗生素滥用和耐药性的增加，金黄色葡萄球菌引起的食 物中毒事件时有发生。因此，建立一种准确、快速的检测方法对于预防和控制金 黄色葡萄球菌的传播具有重要意义。
研究方法：
本研究采用PCR技术，设计特异性引物和探针，对肉及肉制品中的金黄色葡 萄球菌进行检测。同时，采用优化后的采样和洗涤方法，以提高检测的灵敏度和 准确度。具体实验步骤包括样品处理、DNA提取、PCR扩增和产物检测。
参考内容
摘要：
本研究旨在建立一种高效、特异的PCR方法，用于检测肉及肉制品中的金黄 色葡萄球菌。通过优化采样和洗涤方法，提高了检测的灵敏度和准确度。结果表 明，该方法具有较高的实用性和推广价值，对于保障食品安全具有重要意义。
引言：
金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性致病菌，可引起食物中毒、烫伤样皮肤 综合征、毒性休克综合征等多种疾病。在肉类及肉制品中，金黄色葡萄球菌的污 染较为普遍，因此建立一种快速、准确的检测方法对于保障食品安全至关重要。 本研究采用PCR技术，针对金黄色葡萄球菌的特异性基因片段进行扩增，以提高 检测的灵敏度和准确度。
PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌