植物病毒的人工摩擦接种实验
物理农业实验基础植物病害的人工接种
物理农业实验基础植物病害的人工接种物理农业实验基础植物病害的人工接种现代物理农业是以理论做指导，并以实践为基础发展起来的装备型农业，其中的一个重要分支就是无毒农业，如何保障农作物在其全生育期内不使用农药是无毒农业需要解决的核心问题，从土传病虫害到气传病害、地上部分的虫害均需要相应的防治设备，而判定一个设备是否好用，需要进行验证试验。
物理农业常用的验证试验方法如下：植物病害的人工接种人工使病原物与寄主植物的易感病部位接触，并给予一定的发病条件，诱起病害的发生叫接种。
在证病过程中，分离所得的病原物必须通过接种才能确定它的致病性，接种是证病过程的重要环节。
在研究寄生现象、发病规律，鉴定品种的抗病性及进行药效测定等工作时，都需借助人工接种才能得出比较可靠的结论。
因此，接种是植病工作者必须掌握的基本技术，应该充分掌握它的原理和方法。
一、植物病害发生的条件充分掌握病害发生的条件，才能人工诱起病害的发生。
已知植物病害的发生是由寄主植物、病原物和环境条件三方面的因素决定。
要准确诱发病害，就要深入掌握这三方面的因素对接种的影响。
（一）寄主植物的感病性诱发病害必须有感病的寄主。
寄主的感病性受下列因素影响：1、作物的种类和品种不同的作物各类以及同一作物的不同品种对一定病害的感病性不同。
接种需要选择感病的作物和感病的品种。
但有时亦可选择感病性不同的作物或品种来作比较。
2、感病的阶段和部位寄主各个发育时期感病性不同，同一寄主对不同病害的感染阶段亦不一样，接种必须明确该病害的感染阶段。
有些病害在寄主的一定部位和一定的细胞生理年龄感染，因此必须注意感染部位和细胞的生理年龄问题。
如水稻对稻瘟病的感染阶段是苗期（四叶期）、分蘖盛期及抽穗初期。
前两期的感染部位是叶子，后一期的感染部位是穗部。
以叶片和穗子的生长年龄来说，以出叶当天和始穗期最感病。
因此接种不仅要选择感染阶段，并要选择感病的部位和组织细胞最感染的生理年龄。
3、生长状况一般来说，兼性寄生菌对生长衰弱的寄主容易侵染，专性寄生菌则需要生长发育比较正常的寄主。
烟草花叶病毒的检测方法研究进展
烟草花叶病毒的检测方法研究进展摘要烟草花叶病毒（TMV）的寄主范围相当广泛，给农业生产带来重大损失，加强对该病毒的检测具有重要意义。
在查阅近年来国内外文献的基础上，总结了对烟草花叶病毒的检测方法如直接观测法、电子显微镜检测法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等的研究进展。
随着植物种质资源的引进和生态条件的改变，对检测TMV方法提出了更高的要求，因此在实际应用中要综合运用各种检测方法提高检测的准确性。
关键词烟草花叶病毒；检测方法；研究进展烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）是一种RNA病毒，病毒粒体为棒状，长度为300～310 nm、直径18 nm；病毒基因组为单分子线形正义ssRNA，长6 300～6 600 nt；衣壳蛋白由一种多肽组成，分子质量为17～18 kDa。
TMV 的寄主范围非常广，可侵染的植物达150多个属，主要是一些草本双子叶植物，包括蔬菜、花卉和烟草等，导致烟草和番茄等作物的严重危害[1]。
烟草业在我国经济中占据着重要的地位，而烟草花叶病严重危害烟叶的产量和质量，成为优质烟叶生产的因子，是烟叶出口所面临的挑战，同时给我国造成巨大的经济损失。
不同条件下同种病毒的症表现状有很大差异，而不同病毒在烟叶上表现为相似的症状，烟草花叶病毒检测对于烟叶病毒的防治提供理论依据，同时也对进一步识别病毒病害和防止病毒传播危害具有重要的实际意义。
1 直接观测法直接检查植株叶子和茎有无可见的病毒症状。
烟草花叶病毒属中大多数病毒的寄主范围较广，对外界环境的抵抗力强，自然传播不需要介体生物，靠植株间的接触（或有时种子）传播。
如在烟草上自苗期至大田期可连续发生，早期发病烟株节间缩短、植株矮化、生长缓慢，幼苗被侵染后，新叶的叶脉颜色变浅，而后形成黄绿相间的花叶症；苗期侵染的植株发育缓慢。
大田期植株发病，除显示明脉、花叶症状以外，病叶上会形成疱斑，厚薄不匀；叶片出现各种畸形。
植物病毒
病毒在生物中的地位
原核生物 细胞生物
原核生物界
动物界
真核生物
植物界 菌物界 原生生物界 真病毒
生 物
分子生物 病毒界？
类病毒 亚病毒 拟病毒 朊病毒
按它们寄主的不同，病毒分为:
寄生植物的植物病毒(PIant virus)、 寄生动物的动物病毒(Animal virus) 寄生细菌的噬菌体(Phage)等。
4 卫星RNA
在某些多分体病毒中发现了小分子量的RNA，其与 病毒RNA没有同源性，单独不能侵染，要依赖病毒 的核酸才能侵染和增殖，这种核酸称为卫星RNA （satellite RNA，sRNA），其依赖的病毒称为辅 助病毒。 卫星 RNA与辅助病毒包被在同一衣壳内，并能够 抑制辅助病毒的复制，降低其浓度并改变其致病 力，利用 sRNA与病毒的关系，可进行生物防治及 基因工程育种研究。
1 植物病毒的核酸类型： 植物病毒的核酸只有 RNA或DNA两种，按核酸的种 类和其在复制过程中的功能，可分为5种类型病毒， 其中3种为 RNA病毒，2种为DNA病毒。 (l)正单链 RNA (positive single strand RNA， 十ssRNA) 病毒 (2)负单链 RNA (negative single strand RNA， -- ssRNA) 病毒 (3)双链 RNA (double strand RNA，dsRNA) 病毒 (4)单链 DNA (ssDNA) 病毒 (5)双链 DNA (dsDNA) 病毒
真菌
已发现7种真菌传播19种病毒， 油壶菌属、粘菌属系植物的非致病菌， 为主要的真菌介体； 集壶菌、粉痂菌及腐霉菌除为植物本身 病原菌外，还能传播多种病毒。 病毒与真菌介体的关系除少数芸苔油壶 菌为游动孢子体外带毒外，大多数为孢子内带 毒，属持久性传毒。
磨擦接种的操作流程
实验一植物病毒的机械接种
实验目的：了解植物病毒机械接种的原理和方法
实验内容：以带有TMV病毒的病叶为材料进行机械接种，1周后观察接种植物叶片等形态与生理的变化
实验材料：研钵、TMV或其他病叶、金刚砂（600目）、普通烟或本氏烟苗、灭菌蒸馏水或磷酸缓冲液（pH7.0）、花盆、营养土
实验方法：机械传染是指病毒从植物表面的机械损伤侵入，引起植物的发病，机械传染病毒的接种方法，一般是将病株汁液在叶面摩擦，所以又称“汁液传染”或“汁液摩擦传染”。
但这种传染只限于大部分引起花叶型症状的病毒，因为这些病毒在寄主细胞中的浓度较高同时在寄主体外的存活力也较长，通过汁液接种便可证实病毒是由机械传染的。
具体操作步骤如下：先用肥皂将手彻底洗净，取病毒病的病叶，用清水洗净，放入研钵中，磨碎挤出汁液，接种于无病烟草，选择生长健壮具有4—5个叶片的烟草植株，作为接种寄主，每株接2—3个叶片，接种时先用清水冲洗待接种的叶片，晾干后再撒上少许金刚砂(600目)或硅藻土，以左手托着叶片，用右手食指蘸取少量病毒汁液。
在接种叶片上轻轻摩擦，要求仅使叶片表皮细胞造成微伤口而不死亡，接种后用清水洗去接种叶片上的残留汁液，在标签纸上写出接种日期、班级及姓名并贴于花盆上。
将接种的植株放在防虫的温室或纱笼中，在
20—25℃条件下培养，
7—14日内随时注意观察其发病情况。
附图：。
实时荧光定量PCR (2)
PCR方法：
每管加入DDW 8.5ul反转录产物2ul，引物各1ul，2XTaq Mix 12.5ul，每管中加入10ul石蜡油，放入PCR仪。运行 程序94℃变性3分钟，然后进入循环；94℃ 30秒，50℃ 30 秒；72℃ 1分钟，共30个循环。
植物病毒的RT-PCR试验 四、注意事项：
反转录： 1.操作者要戴口罩； 2. 尽量避免空气流动； 3.快速操作，避免造成RNA降解。 PCR： 1.加样要准确，不同试剂要换枪头，避免污染； 2.退火温度要根据引物的退火温度设定，变性以 及延伸时间，要根据片段大小确定； 3.反应结束时，最后一步设置10℃ forever；
植物病毒RNA的提取试验 四、注意事项：
1．前两步中不要剧烈震荡：氯仿对蛋白有变性作用，剧烈的 震荡，很容易使得DNA的亲水基团，与水相接触，从而使 DNA污染RNA； 2．RNA提取的操作过程要在冰上进行； 3. 操作者要戴口罩； 4. 尽量避免空气流动。 5. 提取用所有枪头与离心管都要进行无RNA酶处理。
时即可用于蚜虫繁殖。 b.无毒蚜虫繁殖：将无毒蚜虫用毛笔转接到已准备好的生长 旺盛的健康小麦上，平均每株小麦转接5-15头。转接后将小麦 置于20℃饲毒72h，使其充分带毒。
大麦黄矮病毒的蚜虫传毒试验
三、实验方法：
3.传毒 将带毒蚜虫用毛笔转接到长至两叶期的健康小麦上取食，然
植物病毒的RT-PCR试验 三、仪器和试剂：
水浴锅或金属浴、PCR仪、小型低速离心机等。 反转录酶、dNTPs、引物、DEPC处理水等。
植物病毒的RT-PCR试验 四、实验方法：
反转录方法：
1. 取2 µ L 病毒RNA溶液，分别加入0.5 µ L 下游引物，2.5 µ L DEPC处理水，充分混匀。 2. 70℃处理5min，冰置5min。 3. 加入2 .5µ L 5X M-MLV buffer，1.75 µ L DEPC处理水，2 .5µ L 10 mM dNTPs ，加入0.25 µ L RNase，0.5µ L M-MLV 酶。 4. 42℃反应1h，70℃ 5min，即得cDNA。
植物病毒的人工摩擦接种实验
番木瓜环斑病毒（PRSV）人工摩擦接种西葫芦
一实验目的
通过人工摩擦接种方法，将番木瓜环斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV）接种到健康的西葫芦幼苗。
学习常规的汁液接种技术。
二实验方法
植物病毒不同于真菌和细菌，属于被动侵入寄主的类型。
在自然界里大多依靠机械摩擦或生物介体完成传播。
故在实验室中常用病株汁液作为人工接种的材料，将其有效地接种到试验材料上。
三实验材料
材料：侵染了PRSV的表现症状明显的番木瓜叶片；生长健康的3-4叶期的西葫芦幼苗。
研钵与研棒、纱布、洗瓶、金刚砂、0.05 mol/L pH7.2 的磷酸缓冲液（PBS）、标签、记号笔等。
四实验过程
（1）剪取小块含病毒的叶片（1 g）放在研钵中并加入适量磷酸缓冲液（10 mL），研磨成糊状。
（2）在植物幼嫩的叶面上洒少许金刚砂。
（3）用纱布蘸取少量病样汁液在洒了金刚砂的叶面上轻抹2-3次，之后用洗瓶内的水清洗叶面。
另外在花盆中要插入标签，注明病毒样品代号、寄主、接种日期和接种人等
（4）管理和记载：有专人负责植物的日常管理，每2-3天记载一次发病情况，注意接种叶和新叶上的症状是否一致。
五实验要点
（1）供试植物材料的叶面和每个人的手指都要在实验前洗净以保证成功率。
（2）摩擦接种的动作要轻，不要弄破叶片，单方向进行；接种后用洗瓶将叶面冲洗干净以免影响以后的观察。
植物病毒病检测及防治的研究进展
植物病毒病检测及防治的研究进展摘要：植物病毒病又称植物癌，给农作物及经济作物带来了严重危害，降低了农作物产量和质量，每年仅在我国因病毒感染农作物造成的损失就可达200亿美元，植物病毒病造成的损失是世界人口生存的威胁之一。
关键词：植物病毒病；检测；防治一、植物病毒病的检测技术病毒有两种，以DNA为遗传物质的病毒称为DNA病毒，以RNA为遗传物质的病毒称为RNA病毒，90%的植物病毒是RNA病毒。
早期RNA植物病毒病的检测一般采用传统的生物学方法(指示植物检测法)，即通过汁液摩擦接种或嫁接传染方式，将待测带毒植株汁液接种到一株或多株指示植物上，从而观察其在指示植物上的症状。
指示植物是对某一种或某几种病毒和类病毒敏感的植物，感染后可迅速出现明显症状。
传统生物学方法鉴定谱广，操作简单，但需培育大量指示植物，检测速度慢，易受外界环境影响。
随着电子显微镜的出现，病毒的真实形态才得以展现。
电子显微镜观察结果直观、准确，还能观察病毒引起的寄主细胞病变及内含体特征，是深入研究病毒病机理的重要手段之一。
但仪器设备昂贵，制片及操作技术复杂，难以掌握，对操作人员技术水平要求高。
由于每一种植物病毒产生的抗血清各有特性，人们研发一种利用抗原抗体外特异性免疫反应检测植物病毒的方法。
酶联免疫吸附法(ELISA)是通过酶催化颜色反应将抗原抗体结合起来的一种方法，其具有灵敏、快速、特异性强、分析率高、成本低等优点，可用于大规模样品检测，是血清学中应用最广泛的方法，已成为检测植物病毒的关键技术。
随着生物体遗传物质研究的逐步深入，人们发现通过核酸能准确、快速地鉴定植物、动物和微生物的物种和种群。
基于核酸检测的分子生物学方法比血清学方法具有更宽的检测范围、更高的灵敏度、更强的特异性，适用于大批量样本检测，在植物病毒检测中得到了迅速而广泛的应用。
包括核酸杂交技术(Nucleic acid hybridiza-tion)、反转录PCR技术(RT-PCR)、荧光定量PCR技术(real-timePCR)、DNA微阵列技术(DNA microarray)。
关于“烟草花叶病毒的感染和重建实验”的几个疑惑点探析
关于“烟草花叶病毒的感染和重建实验”的几个疑惑点探析作者：盛国跃来源：《中学生物学》2020年第04期摘要：主要以Fraenkel-Conrat H，Williams R C于1955年发表的《Reconstitution of active tobacco mo-saic virus from Its inactive protein and nucleic acid components》（《活性烟草花叶病毒活性蛋白及核酸成分的重组》）Fraenkel-Conrat H，Singer B于1957年发表的《Virus reconstitution：Ⅱ.Combination ofpro-tein and nucleic acidfrom different strains》（《病毒重组：Ⅱ来自不同品系的蛋白质与核酸的结合》）两篇论文为依据，对学生在学习烟草花叶病毒的感染和重建实验过程中经常产生的三个疑惑点进行探析。
关键词：烟草花叶病毒病毒感染病毒重建中图分类号：Q-49 文献标志码：E烟草花叶病毒的感染和重建实验是证明核酸是遗传物质的证据链中关键的一环。
学生在学习时，经常h会对该实验中的几个操作产生疑惑。
其原因有：①在经全国中小学教材审定委员会2004年及2019年初审通过的各个版本高中生物学教材中对这一实验的介绍都很少，如人教版只是简单地说明了实验的结论，苏教版只以“知识海洋”的方式做了简介，浙科版对这一实验的着墨相对较多，但也基本没有提及具体的操作过程。
②与生物学教学相关的杂志中，这方面的相关论文也极少，在中国知网上以烟草花叶病毒为关键词，以生物学通报为文献来源进行检索，只搜到3篇论文。
下面以浙科版教材为例，对学生经常产生的三个疑惑点进行探析。
1使烟草花叶病毒感染烟草的操作方法1.1疑惑：如何进行烟草花叶病毒感染烟草的操作在浙科版高中生物学教材中多次提及“感染”操作，如“用RNA和蛋白质分别去感染烟草”“分别来自不同病毒株系的RNA和蛋白质混合后感染烟草”等。
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番木瓜环斑病毒（PRSV）人工摩擦接种西葫芦
一实验目的
通过人工摩擦接种方法，将番木瓜环斑病毒（papaya ring spot virus，PRSV）接种到健康的西葫芦幼苗。
学习常规的汁液接种技术。
二实验方法
植物病毒不同于真菌和细菌，属于被动侵入寄主的类型。
在自然界里大多依靠机械摩擦或生物介体完成传播。
故在实验室中常用病株汁液作为人工接种的材料，将其有效地接种到试验材料上。
三实验材料
材料：侵染了PRSV的表现症状明显的番木瓜叶片；生长健康的3-4叶期的西葫芦幼苗。
研钵与研棒、纱布、洗瓶、金刚砂、0.05 mol/L pH7.2 的磷酸缓冲液（PBS）、标签、记号笔等。
四实验过程
（1）剪取小块含病毒的叶片（1 g）放在研钵中并加入适量磷酸缓冲液（10 mL），研磨成糊状。
（2）在植物幼嫩的叶面上洒少许金刚砂。
（3）用纱布蘸取少量病样汁液在洒了金刚砂的叶面上轻抹2-3次，之后用洗瓶内的水清洗叶面。
另外在花盆中要插入标签，注明病毒样品代号、寄主、接种日期和接种人等
（4）管理和记载：有专人负责植物的日常管理，每2-3天记载一次发病情况，注意接种叶和新叶上的症状是否一致。
五实验要点
（1）供试植物材料的叶面和每个人的手指都要在实验前洗净以保证成功率。
（2）摩擦接种的动作要轻，不要弄破叶片，单方向进行；接种后用洗瓶将叶面冲洗干净以免影响以后的观察。