高速逆流色谱法的概况及应用

高速逆流色谱法的概况及应用高速逆流色谱( High-Speed Countercurrent Chromatography，HSCCC) 是Yoichiro Ito 博士于二十世纪八十年代首先研发、应用并发展起来的一种新型液-液分配色谱技术；HSCCC运用同步多层螺旋管进行行星式离心运动，使得在互不相溶的两相溶剂系统中可以实现样品在短时间内的高效分离，从而制备样品[1,2]。

高速逆流色谱技术不需要固体支撑物，主要根据样品在两相中所具有的不同分配系数进而对样品进行分离，相对于其他色谱技术如高效液相色谱、柱色谱等来说，具有高回收率、无吸附损耗、无峰拖尾等优点。

1、HSCCC法概况1.1 HSCCC法的基本原理HSCCC属于液 -液分配色谱，所以其基本分离原理与其他同类色谱技术相同，即利用物质在两相间分配系数的差别进行分配。

而 HSCCC将两溶剂的分配体系置于高速旋转的螺旋管内 ,建立起一种单向性流体动力平衡体系。

螺旋管的运动形式，是在自身自转的基础上，同时绕一公转轴旋转，成行星运动[3]。

这样 ,加在分配体系上的离心力场不断发生变化，使两相溶剂充分的混合和分配，从而达到洗脱分离目的。

HSCCC技术已经广泛应用于天然产物的分离。

1.2 溶剂系统的选择利用 HSCCC分离物质的关键是溶剂系统的选择。

经查阅多篇文献，总结要点如下。

对用于 HSCCC分离的溶剂体系，应该满足这几方面的要求：1)不造成样品的分解与变性；2)足够高的样品溶解度；3)样品在系统中有合适的分配系数值；4)固定相能实现足够高的保留[4]。

而对于溶剂体系选择的原则，Ito博士本人总结的几个要点是这样描的：1)待分析组分应易溶于溶剂系统 ,并不与之发生反应；2)溶剂体系的各组分应分成体积比例适合的两相，以免浪费溶剂；3)组分在溶剂系统中的分配系数 K应为适当的定值 (0.5≤K≤1)；4)固定相的保留值要满足一定要求 (保留值越大峰形越好 )。

溶剂系统的一般选择方法：HSCCC是利用溶质在不同溶剂中的分配进行分离的，所以在溶剂选择时要重点考虑溶质在两溶剂中的分配系数。

因而准确测定待分离组分在两相中的分配系数，即可选择出合适的溶剂系统[5]。

常见的溶剂体系有以下几种：1)弱极性溶剂体系；2)中等极性溶剂体系；3)强极性溶剂体系。

这三种溶剂体系分别可以用于分离相应性质的天然产物。

而测定组分的分配系数，常采用高效液相色谱法、薄层色谱法等方法，都能够较为准确地测定特定组分的分配系数值。

HPLC法即将适量的样品分别溶于已平衡的两相溶剂，待分配平衡后，进行 HPLC测定，通过得到的色谱峰面积可精确计算出样品在两相间的分配系数[6]。

程杰[7]等从红车轴草提取物中分离芒柄花素和鹰嘴豆芽素A时,采用 HPLC测定 K值的方法最终确定了溶剂体系为正己烷 -乙酸乙酯 -甲醇 -水 (2∶1.5∶1.5∶2)。

薄层色谱法则是利用样品在等体积上下相中分配平衡后用薄层色谱展开,通过薄层色谱得到的斑点判断组分的分配情况[8]。

1.3 HSCCC法的优点及发展情况HSCCC所有的优点都源于其不用固体固定相，有广泛的溶剂体系可供选择，它独特的优点概括起来为：1)HSCCC不用固体支撑体，避免了由于样品与固定相发生作用而导致的不可逆吸附、污染、变性等缺点；2)分离过程不是吸附与淋洗的过程，而是对流穿透的过程，所以能节省昂贵的填料费用，节约溶剂的消耗；3)由于可选的溶剂系统非常多，故其可以分离各种不同极性范围的物质，适用范围广。

而其缺点在于溶剂系统选择没有一个完整的、有指导意义的理论体系。

近年来，由于此项技术具有很多独特的优点，国内外对 HSCCC的研究越来越多，应用也越来越广。

就天然产物分离而言，曹学丽[9]在其著作中列举了如下几个方面:天然药用植物活性成分分离及标准品制备、快速分离和重要指纹图谱分析、天然新药的研发和筛选。

可见，HSCCC技术在天然产物分离中有着广泛的应用。

2、HSCCC法的应用。

2.1 在天然药物活性成分研究中的应用2.1.1 生物碱类生物碱广泛分布于植物界，对疾病治疗和药物开发等具有重要意义。

近年来，用 HSCCC 已成功分离了多种生物碱。

Li 等[10]用 HSCCC 分离辣椒粗提物中的辣椒碱，以四氯甲烷-甲醇-水（4 ：3 ：2）为溶剂系统，下相为流动相。

得到二氢辣椒碱、辣椒碱的纯度分别为 97.4%和99.0%。

吴三桥等[11]用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（22 ：25 ：23 ：17）为溶剂体系，从延胡索总碱中一步纯化得到原阿片碱和延胡索乙素，纯度分别为99.3% 和 98.8%，可作为延胡索乙素、原阿片碱化学对照品的制备分离方法。

梁镇然等[12]用 HSCCC 与硅胶柱层析联用分离岩黄连中的 2 种原小檗碱型季胺生物碱，选定正己烷-乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水-氨水（0.4：1.5：4 ：0.4 ：5 ：0.11）为两相溶剂系统，下相为固定相，上相为流动相，通过 1 次高速逆流色谱，即可得到纯度为97.0% 的去氢碎叶紫堇碱。

HSCCC 还成功分离了长春花中的长春新碱[13]、红豆杉中的三尖杉宁碱[14]、附子中的苯甲酰新乌头碱[15]、白鲜皮中的白鲜皮碱[16]、钩吻中的钩吻碱[17]、蓖麻籽中的蓖麻碱[18]等。

2.1.2 黄酮及其苷类黄酮类化合物多存在于高等植物和蕨类植物中，常以游离或苷的形式存在，生理活性多种多样。

传统的制备方法是柱层析或薄层层析，操作繁琐，收率较低。

改用HSCCC法后，目标组分的分离效率增加，纯度也得到相应提高。

袁媛等[19]利用HSCCC分离纯化木蝴蝶中的黄酮类活性成分，以氯仿-甲醇- 水（9.5：10：5）为溶剂系统，从木蝴蝶乙酸乙酯粗提物中得到 5 种化合物，分别为白杨素、黄芩素、黄芩素-7-O-葡萄糖苷、黄芩素-7-O-双葡萄糖苷和一种新的白杨素双葡萄糖苷，各成分的纯度均＞97%。

孙印石等[20]用HSCCC分离制备陈皮中的黄酮类化合物，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（2 ：4 ：3 ：3）为两相溶剂系统，从陈皮粗提物中一步分离制备得到橙皮苷、桔皮素和5-羟基-6，7，8，3，4-五甲氧基黄酮，纯度均＞97.0%。

2.1.3 木脂素和香豆素类香豆素类成分广泛分布于高等植物的根、茎、叶、花、果实、种子等各部位。

木脂素是 2 个苯丙烷骨架结构通过其中的β，β或 8，8'-碳相连的一类天然产物，其结构多样。

这两类化合物的分离纯化难度较大，但HSCCC法的使用解决了这一难点。

Cazal等[20]以环己烷-乙醇-乙腈-水（10 ：8 ：1 ：1）为溶剂系统，上相为流动相，下相为固定相，利用HSCCC从橙树根中分离出花椒内酯，纯度＞99%。

Shi等[21]采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水（2 ：5 ：7），下相为流动相，用HSCCC从蒲公英中分离纯化木脂素，从蒲公英提取物中一步获得蒙古蒲公英素A 和 rufescidride，纯度分别为98.7% 和98.5%。

此外，HSCCC还可以用于分离纯化续随子中的七叶内酯[22]、连翘中连翘苷[23]、五味子中的五味子酚[24]、望春花中的木兰脂素[25]等。

2.2建立指纹图谱[26] :鉴于HSCCC 有很好的分辨率和重现性，一般分离物有2 ～ 3以上的组分峰,不仅可定性定量分析，还可以制定出某一天然产物的特征峰和指纹图谱，进而制定标准图谱用于天然药物的质量控制，并且通过调节溶剂系统可以对非极性、极性等任何极性范围的物质进行分离鉴定，应用较为广泛；另一方面，HSCCC具有分离时间短、快速、方法简单的特点，且仪器本身廉价易于推广，具有良好前景。

顾铭等[27]选用正己烷、乙醇、水体系，采用分步洗脱，分离纯化 3 个不同产地丹参提取物，各分离得到 12 个洗脱组分，经高效液相色谱仪和紫外光谱仪检测证明3张HSCCC洗脱图谱中对应洗脱峰为同一组分。

HSCCC 洗脱图谱不包含非共有峰，并且对应洗脱峰保留时间的相对标准偏差<3 %，符合国家标准关于制订指纹图谱方法学考察资料的技术参数。

因此，HSCCC 作为制订指纹图谱的方法之一具有可行性。

3、展望HSCCC 其分离度和重现性与 HPLC 相似，但仪器价格低廉、性能可靠、分析成本低、易于操作，是一种适用于中药和天然产物研究的现代化仪器。

对于天然药物的提取分离非常适用。

在质控方面，可用于中药和天然产物的定性定量分析，若能进一步研究，整理出中药材一系列的特征和色谱指纹图谱，用于中药材、中药饮片的质量控制，将能提供一种快速、简便、价廉的新方法和新标准。

现在 HSCCC 在国外已经广泛应用，但在国内还非常有限，深度和广度均不够，仅在天然药物的提取分离中略有应用，在中药的质量分析和控制中应用还很少，鉴于HSCCC本身所具有的优点，相信在以后应用会越来越广泛。

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