蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测-酶抑制率法(分光光度法)
蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测
实验十三、蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测（GB/T 5009.199-2003 蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测）方法一快速卡法一、目的要求：学习快速卡法测定有机磷农残快速检验法及熟悉检验结果评定。
二、实验原理：胆碱脂酶可催化靛酚乙酸脂（红色）水解为乙酸与靛酚（蓝色），有机磷或氨基甲酸脂类农药对胆碱脂酶有抑制作用，使催化、水解、变色的过程发生改变，由此可判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸脂类农药的存在。
三、实验试剂：1、固化有胆碱脂酶和靛酚乙酸脂试纸卡片；2、pH 7.5 磷酸盐缓冲液：分别称取15.0g磷酸氢二钠[Na2HPO4•12H2O]与1.59g无水磷酸二氢钾[KH2PO4]，用500 mL蒸馏水溶解。
四、实验步骤：1、整体测定法（1）选取具有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，剪成1cm左右方形碎片,取5g防入带盖瓶中，加入10 mL缓冲溶液，振摇50次，静置2min以上.(2) 取一片快速卡，用白色药片沾取提取液，放置10min以上进行预反应，有条件时在37 ℃恒温装置中放置10min。
预反应后的药片表面必须保持湿润。
（3）将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。
注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照。
2、表面测定法（粗筛法）（1）擦去蔬菜表面泥土，滴2~3滴缓冲液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液处轻轻摩擦。
（2）取一速片测卡，将蔬菜上的液滴滴在白色药片上。
（3）放置10 min以上进行预反应，有条件时在37 ℃恒温装置中放置10 min。
预反应10 min，预反应后的药片表面必须保持湿润。
（4）将快速卡对折，用手捏3min或用恒温装置恒温3min，使红色药片与白色药片叠合发生反应。
注意：每批测定应设一个缓冲液的空白对照。
五、检测结果判断：1、结果判断结果以酶被有机磷或氨基甲酸脂类农药抑制（为阳性）、未抑制（阴性）表示。
蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测-酶抑制率法(分光光度法)
有色溶液对某一波长光吸收的强度与有色物质的浓度c及吸 光溶液的液层厚度b成正比,称为光吸收定律或朗伯－比尔定 律,其数学表达式为
A=εbc
1.0
T
A
式中： b为液层厚度,单位为cm；c为浓度,单位 为mol.L-1；ε为摩尔吸光系数,单位为.
100
0.5
50
A T%
0
0
C
分光光电光比度色法法〔紫外-可见分光光度法〕 Ultraviolet Visual
示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农 药存在,样品为阳性结果. 阳性结果的样品需要重复检验2次以上.
试剂 pH8.0缓冲溶液 分别取11.9g无水磷酸氢二钾与３. ２g磷酸二氢钾,用1000mL蒸馏水溶解. 显色剂 分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸〔DTNB〕 和15.6mg碳酸氢钠,用20mL缓冲溶液溶解,4℃冰箱中 保存. 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱,加3.0mL蒸馏水溶解, 摇匀后置4℃冰箱中保存备用. 乙酰胆碱酯酶 根据酶的活性情况,用缓冲溶液溶 解,3min的吸光度变化ΔA0值应控制在0.3以上.摇匀 后置4℃冰箱中保存备用.
➢ 样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液,其它操作 与对照溶液测试相同,记录反应3min的吸光度变化值ΔAt
结果计算
抑制率<%>=[<ΔA0-ΔAt>/ ΔA0]×100 式中：
ΔA0对照溶液反应3min吸光度的变化值； ΔAt样品溶液反应3min吸光度的变化值；
结果判定
结果以酶被抑制的程度〔抑制率〕表示. 当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时,表
当一束强度为I0的平行单色光通过一均匀的吸收介质时, 由于吸光物质分子与光子的作用,一部分光子被吸收,一部 分光子透过介质.设透过的光强度为It,则透光率T定义为 T=It /I0,而－lgT称为吸光度A,即
331蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测
水解性
因有机磷农药属酯 类，故在一定条件 下能水解,在碱性介 质、高温、水分含 量高等环境中，更 易水解。 如敌百虫在碱性溶 液中易水解为毒性 较大的敌敌畏。
四、性质
溶解性
氧化性
由于各种有机磷农 药的极性强弱不同 ，故对水及各种有 机溶剂的溶解性能 也不一样， 但多数有机磷农难 溶于水，可溶于脂 肪及各种有机溶剂 。
剂。摇匀后于35 ℃放置10 min以上。 于“检测”状态下选择“农药残留”项目，按“确认”键，选择样品
种类中的“蔬菜”项，按“确认”键。 将放置10min的样液倒入比色皿中，加入0.1 mL低物摇匀，吹吸混匀 马上放入仪器中，按“检测”键，进行空白检测，记录反应3 min，
过程中请勿打开盖子。 样品测试结束后仪器显示值为样品的农药残留抑制率。
速测卡法（ 纸片法） 原理
胆碱酯酶可催化靛酚乙 酸酯（ 红色）水解为乙酸 与靛酚（ 蓝色），有机磷 或氨基甲酸酯类农药对胆碱 酯酶有抑制作用， 使催化 、水解、变色的过程发生改 变， 由此可判断出样品中 是否有高剂量有机磷或氨基 甲酸酯类农药的存在。
酶抑制率法（ 分光光度法） 原理
在一定条件下， 有机磷和氨基甲酸酯 类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，
上海农林职业技术学院
实验：蔬菜农药残留快速检测技术-仪器法
1、样品处理
选取有代表性的蔬菜样品，擦去表面泥土，去掉不可食
部分后称取蔬菜试样，剪成1 cm左右碎片。取样品2g，放入
烧杯或提取瓶中，加入10mL缓冲液，超声波振荡3 min，静
置3~5 min，待用。
样品不可用水冲洗，取不同植株叶片的叶尖部样品。
有机磷农药中，硫 代磷酸酯农药在溴 作用下或在紫外线 照射下， 分子中S易被O取代 ，生成毒性较大的 磷酸酯。
酶抑制率法快速检测蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药的残留量
·50·试 验 研 究农业开发与装备 2013年第4期于人类健康。
因此，该“液肥”系列产品对环境、土壤和人类健康的影响，是无法用增产增收效果来衡量的。
3.3 操作简单、容易掌握该“液肥”系列产品应用操作简单，使用方便、针对性强，见效快，通过四年来的推广应用，深受广大农民群众欢迎，成为在发展绿色生态农业中起着不可忽视的作用。
3.4 增强植株抗性，达到健身栽培效果明显该“液肥”系列产品应用后，作物生长健壮，减轻了自然灾害，减少农药和化肥用量，保证农产品的无公害、绿色、安全生产，促进了干旱地区的农业生产向着高产、高效、优质、绿色农产品方向发展的转变，促进了社会健康和文明发展，实现了农业的可持续发展。
摘要：介绍了采用酶抑制率法快速测定有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的技术，酶抑制率法即分光光度法，是根据在一定条件下，有机磷及氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关，进而通过抑制率来判断蔬菜中是否含有有机磷及氨基甲酸酯类农药的存在。
因其快速、简便、经济等特点，应用范围涵盖较广，保证有问题的蔬菜及时的排除。
关键词：酶抑制率法；快速检测；蔬菜；有机磷及氨基甲酸酯类；农药残留量；乙酰胆碱酯酶；分光光度法食品安全是民生工程，关系国计民生的头等大事。
农产品安全是食品安全工作中的重中之重，也是未来社会的发展趋势。
农产品质量安全是人民群众生存的基本要求，因此，农产品质量安全有保障，人民群众的身体健康和生命安全才有保障。
目前，各级政府和各级农业行政主管部门对蔬菜生产与流通环节中的监管措施和频次在不断强化。
这就需要我们开发出用时少、成本低，易操作的快速检测方法应用于蔬菜生产基地、蔬菜批发市场等地。
而传统的检测技术使用大型仪器设备，由于其检测时间长、成本高、对检测人员专业性要求高等不利因素而无法马上对有问题的农产品进行应急处理。
1 实验原理酶抑制率法是在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酶的活性，造成神经传导介质乙酰胆碱的积累，影响正常传导，使昆虫中毒致死，根据这一昆虫毒理学原理，用在对农药残留的快速检测中。
蔬菜中残留农药的提取方法
《农产品质量检测》作业2009年7月1号蔬菜中残留农药的测定方法蔬菜中的残留农药一般有四大类，即有机磷农药、有机氯农药、拟除虫菊酯类农药和氨基甲酸酯类农药。
一、常规仪器测定法1. 蔬菜中有机磷农药的多残留测定⑴原理：含有机磷的试样在富氢焰上燃烧，以HPO碎片的形式，放射出波长526nm 的特征光；这种光通过滤光片选择后，由光电倍增管接收，转换成电信号，经微电流放大器放大后被记录下来。
试样的峰面积或峰高与标准品的峰面积或峰高进行比较定量。
⑵试剂：丙酮、二氯甲烷、氯化钠、无水硫酸钠、助滤剂硅藻土545农药标准溶液的配制：分别准确称取各标准品，用二氯甲烷为溶剂，分别配制成1.0mg/ml 的标准储备液，储存于4℃冰箱中，使用时根据各农药品种的仪器响应情况，吸取不同量的标准储备液，用二氯甲烷稀释成混合标准使用液。
⑶仪器：组织捣碎机、粉碎机、旋转蒸发仪、气相色谱仪（附有火焰光度检测器）⑷分析步骤：a 提取：称取500g试样，置于300ml烧杯中，加入50ml水和100ml 丙酮，用组织捣碎机匀浆1-2min。
匀浆液经铺有两层滤纸和约10g硅藻土545的布氏漏斗减压过滤。
取滤液100ml移至500ml分液漏斗中。
b 净化：向滤液中加入10-15gNaCl使溶液处于饱和状态。
猛烈振摇2-3min，静置10min，使丙酮与水相分层，分离出水相后，水相用50ml二氯甲烷振摇2min，再静置分层。
将丙酮与二氯甲烷提取液合并经装有20-30g无水硫酸钠的玻璃漏斗脱水滤入25ml圆底烧瓶中，再以约40ml二氯甲烷分次洗涤容器和装有无水硫酸钠的漏斗。
洗涤液也并入烧瓶中，用旋转蒸发仪浓缩至约2ml，浓缩液转移至5-25ml容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。
c 气相色谱测定：气体速度：氮气50ml/min、氢气100 ml/min、空气50 ml/min 温度：柱箱240℃、气化室260℃、检测器270℃测定：吸取2-5uL混合标准液及试样净化液注入色谱仪内，以保留时间定性，以试样的峰高或峰面积与标准比较定量。
蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测
蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测
随着工业的发展和农业的现代化，化学农药的广泛应用成为农业生产中的常见现象。
因此，农产品中农药残留已成为一个普遍的问题。
为了确保消费者的健康和安全，需要对
农产品中的农药残留进行检测。
其中，有机磷类及氨基甲酸酯类农药是最常见的农药残留
物之一。
本文将介绍如何快速检测蔬菜中的有机磷类及氨基甲酸酯类农药残留量。
有机磷类农药是一类广泛使用的农药，它的主要成分是磷酸酯化合物。
这种农药可以
杀死害虫、杂草和真菌，从而保护作物的生长。
但是，它往往会对环境和人体产生有害影响，因此需要对其进行检测。
在蔬菜中，有机磷类农药的常见成分包括马拉硫磷、甲胺磷、乐果等。
针对这些残留物的检测方法主要有色谱法、荧光法和电化学法等。
其中，色谱法
是最常见的检测方法之一。
该方法可以快速和准确地检测出有机磷类农药在蔬菜中的残留量。
除了现有的检测方法之外，近年来还出现了一种新型的检测技术——基于光纤传感器
的检测技术。
这种技术利用光纤的传导性能和敏感度来检测蔬菜中的农药残留。
与传统的
检测方法相比，基于光纤传感器的检测技术具有响应快、准确、灵敏度高等特点，可以快
速地检测出蔬菜中的农药残留，同时可节省检测成本和时间。
总之，在蔬菜中确定有机磷类及氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测对保障农产品质
量和消费者的健康至关重要。
通过创新技术和不断的研究，我们可以期望未来的检测方法
会更加成熟、高效和安全。
蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法标准
蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法标准蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法标准1. 范围本标准规定了由酶抑制法测定蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检验方法。
本标准适用于蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速筛选测定。
测试方法酶抑制率法2. 原理在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。
正常情况下，酶催化神经传导代谢产物（乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产生黄色物质，用分光光度计在410nm处测定吸光度随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农药的存在。
3.试剂3.1 pH8.0缓冲溶液：分别取43.5g无水磷酸氢二钾与2.2g磷酸二氢钾，用510mL蒸馏水溶解。
3.2 显色剂：分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg 碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4°C冰箱中保存。
3.3 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.1mL蒸馏水溶解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。
保存期不超过十天。
3.4 乙酰胆碱酯酶：根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶解，3 min 的吸光度变化D A0值应控制在0. 3以上。
摇匀后置4℃冰箱中保存备用，保存期不超十天。
3.5 可选用由以上试剂制备的试剂盒。
乙酰胆碱酯酶的ΔA0值应控制在0.3以上。
4 仪器4.1 分光光度计或相应测定仪。
4.2常量天平。
4.3 恒温水浴或恒温箱5 分析步骤5.1 样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加入5mL 缓冲溶液，静制十五分钟，之间需振荡几次，待用。
5.2 对照溶液测试：先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，依次加入0.lmL酶液、0.1mL显色剂、0.lmL底物摇匀，此时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应3 min的吸光度变化值ΔA0。
关于农残快速检测中假阳性问题及对所谓对比数据库
关于农残快速检测中假阳性问题及对所谓“对比数据库”的说明一、酶抑制率法检测原理我们生产的LDSJ-RM10型10通道农药残留速测仪,是采用国家标准GB/T 5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量的快速检测》规定的分析方法。
该方法采用酶抑制率法(分光光度法),分析原理是基于一种生物化学反应,即:在正常情况下乙酰胆碱(底物)在乙酰胆碱酯酶的作用下发生水解反应,生成胆碱和乙酸,生成的胆碱与二硫双对硝基苯甲酸(显色剂)产生显色反应,使反应液呈黄色。
如果样品中带有有机磷和氨基甲酸酯类农药,由于农药的存在能抑制酶的活性,使上述生物化学反应速度减慢,从而使水解反应生成的胆碱减少,使显色反应产生的黄色变浅。
通过测量一段反应时间内(国家标准规定为3min)溶液颜色的变化率(吸光度随时间的变化值),即表示为农药抑制酶活性的抑制率。
通过测量抑制率的大小,可以判断出样品中是否有高剂量农药的存在。
二、酶抑制率法产生假阳性问题的原因酶抑制率法测定某些蔬菜中农药残留量存在假阳性,这一点在国家标准GB/T 5009.199-2003的说明中就明确指出:“15.1葱、蒜、萝卜、韭菜、芹菜、香菜、茭白、蘑菇及番茄汁液中,含有对酶有影响的植物次生物质,容易产生假阳性”。
综合文献资料和我们的研究,产生假阳性的原因如下:1.某些蔬菜样品中含有对酶有抑制作用的植物次生物质,它同样也能起到农药抑制酶活性的作用,故会使测定结果偏高,即产生假阳性,严重时使酶完全失去活性,导致无法测量(如蒜)。
2.另一类蔬菜色素含量高(如韭菜含叶绿素高),汁液多(如番茄等),经样品处理后会使测试溶液带色或发浑,而这些带色或发浑的溶液在测试时容易发生变化,从而影响光度法的测定。
三、关于“农药残留果蔬对比数据库”是否科学有效的问题所谓的“对比数据库”实际上是2004年上海某研究所和上海某公司共同研究出来的一个对付假阳性的数据库参照对比软件。
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吸光光度法: 基于物质对光的选择 性吸收而建立的分析方法, 包括比 色法和分光光度法。 不同物质由于结构不同,所吸收光 的波长及吸收程度不同,这就是物质 对光的选择性吸收
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当一束强度为I0的平行单色光通过一均匀的吸收介质时， 由于吸光物质分子与光子的作用，一部分光子被吸收， 一部分光子透过介质。设透过的光强度为It，则透光率T 定义为 T=It /I0，而－lgT称为吸光度A，即 Ａ＝－lgT=lgI0/It
入射光 I0
透射光 It
测量某物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长（）为横 坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制吸光度随波长的变化可得 一曲线，此曲线即为吸收光谱。 不同浓度的同一物质，它的最大吸收波长是不变的，但吸光 度随浓度增大而增大。 在最大吸收波长处测量吸光度，其灵敏度最高。
It
原理
在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对胆碱 酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率与农药的浓度 呈正比。正常情况下，酶催化神经传导代谢产物 （乙酰胆碱）水解，其水解产物与显色剂反应，产 生黄色物质，用分光光度计在412nm处测定吸光度 随时间的变化值，计算出抑制率，通过抑制率可以 判断出样品中是否有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类 农药的存在。
试剂 pH8.0缓冲溶液 分别取11.9g无水磷酸氢二钾与３. ２g磷酸二氢钾，用1000mL蒸馏水溶解。 显色剂 分别取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB） 和15.6mg碳酸氢钠，用20mL缓冲溶液溶解，4℃冰箱 中保存。 底物：取25.0mg硫代乙酰胆碱，加3.0mL蒸馏水溶 解，摇匀后置4℃冰箱中保存备用。 乙酰胆碱酯酶 根据酶的活性情况，用缓冲溶液溶 解，3min的吸光度变化ΔA0值应控制在0.3以上。摇 匀后置4℃冰箱中保存备用。 主要仪器 分光光度计,常量天平
分析步骤
样品处理：选取有代表性的蔬菜样品，冲洗掉表面泥土，剪 成1cm左右见方碎片，取样品1g，放入烧杯或提取瓶中，加 入5mL缓冲溶液，振荡1~2min，倒出提取液,静置3~5min,待 用。 对照溶液测试： 先于试管中加入2.5mL缓冲溶液，再加入 0.lmL酶液、0.1mL显色剂，摇匀后于37° C放置15min以上 （每批样品的控制时间应一致）。加入0.lmL底物摇匀，此 时检液开始显色反应，应立即放入仪器比色池中，记录反应 3 min的吸光度变化值Δ A0 样品溶液测试：先于试管中加入2.5mL样品提取液，其它操 作与对照溶液测试相同，记录反应3min的吸光度变化值Δ At
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结果计算
抑制率(%)=[(ΔA0-ΔAt)/ ΔA0]×100 式中： ΔA0对照溶液反应3min吸光度的变化值； ΔAt样品溶液反应3min吸光度的变化值；
结果判定
结果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。 当蔬菜样品提取液对酶的抑制率≥50%时,表 示蔬菜中有高剂量有机磷或氨基甲酸酯类农 药存在，样品为阳性结果。 阳性结果的样品需要重复检验2次以上。
1.0
T
100
50
A
0.5
0
0
C
T%
分光光度法（紫外 -可见分光光度法） 光电比色法 UV-VIS
Ultraviolet Visual Spectroscopy
0.575
光源 参比 I0
单色器
吸收池
检测器
显示
It A lg lg T bC I0
入射光 I0 透射光 It
样品
蔬菜中
有机磷和氨基甲酸酯类
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分光光度法的原理简介 酶抑制率法(分光光度法)
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有色溶液对某一波长光吸收的强度与有色物质的浓度c及吸 光溶液的液层厚度b成正比，称为光吸收定律或朗伯－比尔 定律，其数学表达式为 A=εbc 式中： b为液层厚度，单位为cm； c为浓度，单位为mol.L-1； ε为摩尔吸光系数，单位为 L.mol-1.cm-1。