(整理)分子生物学实验指导
实验1 大肠杆菌感受态细胞的制备
【实验目的】
掌握制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
【实验原理】
体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
CaCl
法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0℃、2
低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞CaCl
2
膜表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
处理受体菌使其处于感受态。
本实验以JM109菌珠为受体细胞，用CaCl
2
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。利用pBS-T质粒转
化制备的感受态菌，可用于所制备感受态菌的转化鉴定。pBS-T质粒携带有氨苄青霉素，
可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当
稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体
细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。
【实验内容与方法】
1．感受态细胞的制备
（1）．从新活化的JM109菌平板上挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中（不
含Amp），37℃振荡培养12h左右，至对数生长期，将该菌液以1:100～1:50转接于100ml
约0.2～0.4）。
LB培养基中，37℃振荡培养2～3h（OD
600
（2）．将菌液冰浴10min后，转入离心管中，于4℃离心4000rpm，10min，去上清，
收集菌体。
悬浮细胞，冰浴15～30min。
? （3）. 用10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl
2
（4）．0～4℃，离心4000rpm，10min。
溶液，小（5）．弃上清液，每50ml初始培养物加入2ml冰预冷的0.1mol/L CaCl
2
心悬浮细胞，冰上放置30min。
（6）．制备好的感受态细胞悬浮液可在冰上放置24h内直接用于转化实验，也可加
入1/10高压灭菌甘油, 置-70℃冻存。
2．感受态(JM109)转化鉴定(无菌操作)
1．取感受态细菌100μl，加入pUC18（或pBR322）质粒(0.3mg/ml)10ul混匀。
2．冰浴30min后,42℃水浴热休克2min，再于冰浴2min,加入LB液体培养基0.5ml, 37℃振荡培养40min。
3．分别取菌液30～100ul加到含Amp的LB固体培养基平皿上，用三角玻璃刮刀铺板室温放置2min，然后倒置放入37℃恒温培养箱培养过夜,观察是否有菌落。
4．结果分析：在培养基平板上应可以观察到转化子形成的菌落。
【实验准备】
1．LB培养基取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化钠2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0, 定容至200mL，高压灭菌。
2．固体培养基取胰蛋白胨2g, 酵母提取物1g, 氯化钠2g, 琼脂粉1.2g, 加水160mL溶解后用1mol/L氢氧化钠调pH至7.0, 定容至200mL，高压灭菌。临用前将固体培养基融化后倒入平皿中, 待凝固后备用。
3．0.1mol/L CaCl
2取CaCl
2
1.11克加双蒸水定溶至100mL，然后用0.22μm微孔滤膜
过滤除菌。
【注意事项】
1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。
2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。
3. 应收获对数生长期的细胞用于制备感受态，OD
600
不应高于0.6。
4. 制备感受态细胞所用试剂如CaCl
2
等的质量要好。
5. 整个实验一定要在冰浴条件下操作，温度时高时低会影响转化效率。
6．42℃热处理很关键，温度要准确，转移速度要快。
【思考题】
1．何谓感受态细胞？
2．制备感受态细胞时需注意什么？
实验2 DNA的转化及阳性克隆的筛选
【实验目的】
学习DNA体外重组技术及转化方法
了解蓝白斑实验筛选转化子的原理和方法。
【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA 在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5′端磷酸和3′端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
体外连接的重组DNA分子必须导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。本实验利用pUC18作为载体，经T4 DNA连接酶作用，将外源基因插入其多克隆位点，构建重组质粒，转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，利用蓝白斑实验筛选出转化子。
【实验内容与方法】
(1)将冻存的感受态细胞置于冰上，缓慢解冻；
(2)加入待转化的质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30 min；
(3)42 ℃热激90 s；
(4)立即置冰上5 min；
(5)加入无抗性的800 μl LB液体培养基，37 ℃缓慢震荡活化1 h到1.5h；
(6)活化好的菌体室温5 000 r/min，5 min离心；
(7)弃上清，用200 μl没有抗性的LB液体培养基吹打悬浮菌体，蓝白筛
选时，向悬浮的菌液中加入16 μl 50 mg/mL IPTG和40 μl 20 mg/mL
X-gal；然后将全部液体涂布于含有相应抗生素的LB固体培养基上；
超净工作台上，将培养皿口半开，等培养基表面的液体完全蒸发后再
完全盖好培养皿；
(8)37 ℃倒置培养至菌体适当大小时，大约12-16 h，再进行下一步实验。【实验准备】
1．载体DNA，外源DNA
2．T4 DNA连接酶
3．10×T4 DNA连接酶缓冲液
4．感受态细菌
5．LB液体培养基
6．LB固体培养基平皿（含amp）
7．X-gal
8．IPTG
【注意事项】
1．根据具体情况调节酶的用量。平端连接效率比粘端连接低得多，因而应加大酶的用量。
2．正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。一般外源DNA的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。
实验3 DNA的限制性酶切反应
【实验目的】
掌握DNA限制性内切酶酶切的基本原理。
【实验原理】
限制性内切酶能特异地识别、结合于一段被称为限制性酶序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。它可分为三类，其中Ⅱ类限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA技术的基本工具酶。绝大多数Ⅱ类限制酶可识别长度为4至6个核苷酸的回文序列，其切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割双链DNA, 产生平末端的DNA片段; 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端。
【实验内容与方法】
1）以鉴定为目的的酶切
在无菌的1.5 mL Eppendorf 管中加入：
10 × buffer 1 μl
质粒DNA 1 μl
限制性内切酶0.2 μl（10 U/μl）
加入dd H2O至总体积10 μl
37 ℃温育2-4 h，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，注意：质粒是以1.5 mL
菌液所提质粒用10 μl ddH2O溶解所得的。
2）以回收酶切产物为目的的酶切
在无菌的1.5 mL Eppendorf管中加入：
10 × buffer 5 μl
质粒DNA 3-10 μl
限制性内切酶1-2 μl（10 U/μl）
加入ddH2O至总体积50 μl
37 ℃温育过夜，通过琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
【实验准备】
1．pBS-T质粒
2．Hin d Ⅲ酶及其酶切缓冲液
3．Eco R I 酶及其酶切缓冲液
【注意事项】
(1) 限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。
(2) 在酶切反应中，应最后加入酶，尽量减少室温接触机会。
(3) 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，加酶时吸头深入不可过深。每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。(4) 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积的10%，以避免酶液中甘油干扰反应。酶量过大时，有产生星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。
(5)酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。
【思考题】
1．酶切时应注意什么？
2. 如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切动,可能是什么原因？
蓝白筛选的原理
实验材料介绍
1）载体质粒和转化受体菌株：
实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。
E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。
载体质粒DNA pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端14 6个氨基酸的编码序列。(这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。)
在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pB S和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。
这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。
2）实验用显色方法
实验中使用X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)而非直接使用β-半乳糖。
X-gal 以及β-半乳糖均为β-半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能诱导β-半乳糖苷酶操纵子。
实验中使用IPTG以诱导β-半乳糖苷酶操纵子。
X-gal在β-半乳糖苷酶作用下生成深蓝色产物。
实验原理
1）初步筛选
载体质粒DNA pBS上带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
2）蓝白筛选
当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生α-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。
实验干扰
在实际操作中,蓝白筛选出现是浅蓝色重组子的原因是：插入小片段时，质粒仍可以表达有缺陷N-末端a肽与B连互补形成活力有缺陷的半乳糖苷酶重组子形成浅蓝斑。即而出现假阴性。
实验4 植物基因组DNA的提取
一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要试剂配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1.植物基因组DNA的提取
提取缓冲液（CTAB Buffer）：
CTAB 2％（w/v）
Tris-HCl（pH 8.0）100 mM
EDTA（pH 8.0）20 mM
NaCl 1.4 M
提取步骤：
(1)将CTAB Buffer放于65 ℃水浴中预热，（大量提取则是同时将50 mL离心管置于
冰上预冷）；
(2)将新鲜的叶片，无菌水洗后剪成小段，约0.15 g，放到1.5 mL EP管中，EP管
再开口放到液氮中，迅速用烧过的1 mL枪头捣碎（大量提取则是取1 g叶片在液氮中迅速研磨成粉末）；
(3)向EP管中加入2%的预热的CTAB缓冲液600 μl，再加入巯基乙醇10 μl至终浓
度1%（v/v），迅速置于65 ℃水浴1h，每隔5 min颠倒混匀；（大量提取则用在液氮中预冷过的药匙迅速把磨碎的样品转移至预冷的50 mL离心管，立即加入10 mL预热的CTAB Buffer；同时加入巯基乙醇至终浓度1%（v/v），在65 ℃水浴中轻轻摇动1 h）；
(4)加入等体积的氯仿:异戊醇（24:1，v/v），室温下颠倒离心管约100次（气体过
多时开盖放气），保证样品与溶液充分作用；室温12 000 r/min，15 min（大提则是6 000 r/min离心15 min）；
(5)将上清转移至另一个1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后静置10
min。（大提则是加入至少2/3体积的异丙醇，同时加入NaAc至终浓度为0.1 M （每10 mL上清中加入7 mL异丙醇，580 μl 3 M NaAc），轻轻旋转混匀，-20 ℃沉淀1-2 h）；
(6)用弯曲的Tip头挑出团状DNA并转移至1.5 mL Eppendorf管中，6 000 r/min离
心10 min，除去残余液体；若无絮状物质出现或者絮状物质不易挑出则可以5 000 r/min 离心5 min；
(7)用预冷的70%乙醇（900 μl）和0.1 M KAc/HAc pH 6.0（100 μl）洗涤2次，低
速离心（6 000 r/min，10 min或13 000 r/min，5-10 min）除去残余液体；(8)用预冷的无水乙醇浸泡DNA沉淀5 min，12 000 r/min离心5-10 min，除去上清，
吸除管壁上残余的乙醇，于37 ℃干燥约15 min；
(9)用TE溶解干燥的DNA，加入RNase A至终浓度20 μg/mL，37 ℃过夜；若大
提基因组则继续以下步骤，小提基因组则到此步就结束；
(10)将DNA悬浮液转移到15 mL具盖离心管中，加入2 mL TE、1 mL 10 M NH4Ac
和8 mL预冷的无水乙醇，轻轻混匀（如果此时管中小气泡不够多，说明提取的DNA量不多，需离心沉淀DNA）；
(11)用弯曲的Tip头挑出团状DNA并转移至1.5 mL EP管中，用预冷的无水乙醇浸
泡，于1 2 000 r/min离心5 min；
(12)尽可能除去管中多余液体，37 ℃干燥5-10 min；用ddH2O重新溶解干燥的
DNA；
(13)用紫外分光光度计测量DNA的浓度，用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质
量，-20 ℃保存备用。
2. DNA质量检测
琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。
六、注意事项
（1）叶片磨得越细越好。
（2）移液器的使用。
（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。
思考题：
1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什么?
CTAB, 氯仿, 异丙醇, 75%乙醇, EDTA
2．提取基因组DNA的方法有哪些？各有何优缺点？
实验5 多聚酶链式反应( polymerase chain reaction, PCR) 基因扩
增及琼脂糖凝胶电泳检测
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。
二、实验原理
PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：
PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。
1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成
两条单链，即变性阶段。
2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。
3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。
、两典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl
2
条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。
琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
三、实验材料及相关试剂
基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等
四、实验步骤
1．模板DNA的抽提：实验一所得的水稻基因组DNA。
2．PCR操作(在冰上操作)：
（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25 μL, 在无菌的0.2 mL离心管中按下列操作程序加样：
以质粒或提取的基因组为模板，按顺序加入以下试剂，建立20μl PCR反应体系：
试剂（Reagent）体积（V olume，μl）
ddH2O 13.0
10 × PCR buffer 2
dNTP Mix (2.5 mmol/L each) 2
cDNA 2
上游引物（10 μM）1
下游引物(10 μM)1
Taq DNA polymerase (5 U/μl) 0.5
Total 20
（2）将反应混合液混匀, 然后每个PCR管中分装24 μL反应混合液，再加1 μL模板DNA，最后加1滴石蜡油，防止水分蒸发, 然后稍离心。
（3）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：
94℃ 4 min (预变性) 94℃ 30 sec, 60℃ 30 sec, 72℃ 2 min 72℃ 7 min
35个循环
（4）注意事项
由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取措施以防反应混合物受痕量DNA的污染。
a. 所有与PCR有关的试剂，只作PCR实验用，而不挪作它用。
b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管头等都只能一次性使用。
c. 每加一种反应物，应换新的枪头。
3．PCR产物的检测：
琼脂糖浓度（1.2%）；EB浓度（5 μl / 100 ml TBE）
（1）制胶（以150 mL为例）
a. 称取1.8 g 琼脂糖，加入150 ml 的TBE缓冲液（pH 8.0），摇匀，用电子天
平称三角瓶的总重量。
b. 电炉上加热，至琼脂糖完全溶解；然后在天平上加蒸馏水至原重量;
c. 用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），
倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝
固(约30~ 45 min)；
d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。（2）点样
a. 将2.0 μl 溴酚蓝加入到PCR产物中，然后稍微离心；
b. 每孔点样10.0 μl，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。
（3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约1小时后即可观察。
（4）染色
将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中, 染色15-20分钟。
（5）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。
（6）注意事项
a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。
b. 煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。
c. 倒胶注意厚度（4-6 mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10多分钟，以加速胶的凝固。
d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。
e. 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样品。凝胶中含有EB，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。
思考题：
1．PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？
2．为什么在PCR反应过程中，使用三个不同的温度变化？
3．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？
实验6 RT-PCR（设计性实验）
实验设计目的：①掌握RT-PCR的基本原理；
②了解利用RT-PCR分析目的基因表达的方法。
RT-PCR原理：
1、提取RNA，进行反转录，然后以cDNA为模板进行PCR；
2、在一定范围内，PCR产物的亮度与cDNA为模板的浓度成正比；
3、根据PCR产物的亮度变化，可推测目的基因在mRNA水平上的表达量的变化趋势。
研究课题：在研究烟草抗花叶病毒（TMV）过程中，从烟草叶片中克隆到一个cDNA片段，已完成DNA序列的测定。现提供烟草种子、TMV及相关的RT-PCR试剂，拟利用RT-PCR技术分析该基因在TMV侵染烟草过程中的表达模式，从而推测该基因在烟草抗TMV过程中可能具有的功能。实验设计要求：要求给出比较详细周全的实验方案，可以是技术路线的形式，但不要求一一列出具体的实验步骤。
重要提示：
1、如何处理相关的实验材料以分析目的基因在时间维度上的表达模式？
2、如何保证RT-PCR产物形成量与模板浓度成正比？
3、如何保证RT-PCR的模板用量以致？
思考题：
1、什么是RT-PCR？有何应用价值？
2、与Northern杂交相比，RT-PCR分析基因的表达模式时有何优缺点？
实验7 RT-PCR扩增目的基因
【实验目的】
1．掌握真核生物细胞基因组RNA制备和定量的基本方法。
2．掌握反转录PCR的原理及实验方法。
3．掌握PCR技术原理和基本实验步骤。
【实验原理】
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是利用两已知序列的寡核苷酸作为上、下游引物,在耐热性DNA聚合酶(Taq酶)作用下将位于模板DNA上两引物间特定DNA片段进行一种指数级增长的复制过程。PCR反应体系由模板DNA、引物、耐热性DNA聚合酶、底物(四种dNTP)、缓冲液和Mg2+等组成。其操作过程为变性、退火、延伸等三个步骤循环进行。其中变性是加热条件下模板DNA双链间的解离,退火是降低温度使模板DNA与高浓度引物间的互补结合,延伸是在耐热性DNA聚合酶和Mg2+等存在下扩增特定的DNA片段。每次循环扩增产物又可作为下一循环的模板,
因此理论上每经过一轮变性、退火、延伸三个步骤,特定DNA片段的分子数目增加一倍。耐热性DNA聚合酶的应用使PCR循环反应可自动进行,提高了反应的特异性和效率。引物设计是PCR技术的关键步骤，直接影响扩增的效率和特异性。同时，通过适当改变引物的设计可实现多种PCR 技术，现在利用计算机软件可辅助设计某一己知序列基因的特定引物。
PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术,具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在医学、分子生物学领域得到广泛应用，如应用于DNA克隆、突变分析、基因融合、基因半定量、遗传性疾病的诊断等方面。PCR技术还可与其它分子生物学技术相结合发展产生新的技术，如反转录PCR(RT-PCR)、反向PCR(IPCR)、不对称PCR等,使PCR在科研及临床上的应用得到更大发展。
反转录（reverse transcription）也称为逆转录，是依赖RNA的DNA合成作用，以RNA为模版，由dNTP聚合成DNA分子。反应过程先以单链RNA的基因组为模板，催化合成一条单链DNA。产物与模板生成RNA:DNA杂化双链，杂化双链中的RNA被RNA酶水解后，再以新合成的单链DNA为模板，催化合成第二链的DNA。催化此反应的酶称为逆转录酶，也称反转录酶。
反转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)是PCR 技术的一种广泛应用的形式，原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA 高效转录系统。
本实验通过提取培养细胞的总RNA，以反转录酶进行反转录反应获得cDNA，作为PCR的模板扩增人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因中一段300bp的DNA片段，两个引物的5'末端分别引入EcoR I和BamH I的酶切位点，为DNA重组实验做准备。
【实验内容与方法】
1．反转录反应
1）于冰上将3μl总RNA，2 μl oligo18T (0.5 μg/μl)和7 μl ddH2O按总体积12 μl混匀，瞬时离心收集液体；
2）70 ℃加热变性5min，置于冰浴中迅速冷却，瞬时离心收集液体；
3）在冰上按顺序加入下列组分：
试剂（Reagent）体积（V olume，μl）
5 × reaction buffer 5
dNTP mix (2.5 mmol/L each) 5
RNase inhibitor(40U/μl) 0.4
4）轻轻混匀离心；
5）加入M-MuLV逆转录酶（200U/μl）1 μl，补水至25 μl；
6）42 ℃温育1 h；
7）70 ℃加热10min以终止反应，冰上冷却。产物保存于-20 ℃备用。
2.2.7.4PCR
以cDNA为模板，按顺序加入以下试剂，建立20μl PCR反应体系：
试剂（Reagent）
体积（V olume，μl）
13.0
ddH2O
2
10 × PCR buffer
dNTP Mix (2.5 mmol/L each)
2
cDNA 2
1
上游引物（10 μM）
下游引物(10 μM) 1
0.5
Taq DNA polymerase (5 U/μl)
Total 20
混合均匀后按下列条件进行反应：
Stage1：94 ℃5min1cycle
Stage2：94 ℃30s
53 ℃40s
72 ℃1min35cycles
Stage3：72 ℃7min1cycle
Stage4 4 ℃∞
（6）结果分析：1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取10μL PCR产物加入6×上样缓冲液2μL混匀,同时以DNA分子量标准为对照，分别上样后在0.5×TBE电泳缓冲液中于15V/cm电压下电泳1h, 用紫外检测仪检查，与DNA分子量标准对照分析。在相当于PCR产物大小的位置应出现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带。
【实验准备】
1．材料：培养细胞，或组织
2．试剂：Trizol，异丙醇，氯仿，70%乙醇，反转录酶，dNTPmix , PCR buffer, Oligo （dT）或随机引物，Ribonuclease inhibitor，10×Taq DNA酶缓冲液，Taq DNA聚合酶(5U/μl)
3．DEPC水100ml双蒸水中加入DEPC 0.1ml，充分振荡, 37℃孵育过夜。15磅高压灭菌,4℃保存备用。
4．对应目的基因的特异上下游引物
5．溴化乙绽(EB):0.5mg/ml
6．5×TBE(pH8.3电泳缓冲液):Tris 5.4g、硼酸2.25g、EDTA 0.46g、双蒸水定容至l00mL
7．6×上样缓冲液0.25% 溴盼蓝、0.25%二甲苯青,40%(W/V)蔗糖水溶液
9. 1%琼脂糖
8仪器等：PCR仪，ep管，微量移液器，枪头，冰盒，离心机
【注意事项】
2．防止RNA酶污染的措施
(1) 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h以上。
(2) 塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡。
(3) 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3%H 2O 2中室温10min ，然后用0.1%DEPC 水冲洗，晾干。
(4) 配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC 在37℃处理12h 以上。然后高压灭菌除去残留DEPC 。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经m 22.0滤膜过滤除菌。
(5) 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套, 实验过程中手套要勤换。
(6) 设置RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。
3．常用的RNA 酶抑制剂
(1) 焦磷酸二乙酯(DEPC) 是一种强烈但不彻底的RNA 酶抑制剂。它通过和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。
(2) 异硫氰酸胍 目前最有效的RNA 酶抑制剂,它在裂解组织细胞的同时也使RNA 酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA 酶有强烈的变性作用。
(3) 氧钒核糖核苷复合物 由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA 酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA 酶的活性。
(4) RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin) 从大鼠肝或人胎盘中提取的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA 酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA 酶结合,使其失活。
(5) 其他 SDS 、尿素、硅藻土等对RNA 酶也有一定抑制作用。
4．要避免沉淀完全干燥,否则RNA 难以溶解。
5．PCR 反应应该在一个没有DNA 污染的干净环境中进行。
6．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。
7．PCR 试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm 滤膜过滤除菌或高压灭菌。
8．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
9．所有操作应在冰上完成。
【思考题】
1．简述RT-PCR 的基本实验步骤。
3．经30轮PCR循环后，琼脂糖凝胶电泳并未发现有扩增产物，原因可能是什么？
分子生物学实验指导(精)
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
建立一个分子生物学实验室所需的仪器
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
分子生物学实验报告
分子生物学实验 院系：生命科学与技术学院 专业：生物科学（基地） 班级： 201101班 学号： 姓名： 分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具
有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColE Ⅰ衍生的质粒。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA 缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。 质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。 二、实验目的 1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。 2．了解制备原理及各种试剂的作用。 三、实验材料和试剂
最新分子生物学实验指导
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
分子生物学实验复习题附答案(最新整理)
分子生物学复习题 实验一DNA的制备 （1）为什么分子生物学实施时要担心EB？ 溴化乙锭（Ethidium bromide）是DNA诱变剂，溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。具有高致癌性(接触致癌) （2）DNA加样缓冲液的用途是什么？ 由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。 线状DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1 （4）琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是什么 DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子可片段的相对分子质量不同，移动速度也不同，所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分离。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （5）琼脂糖凝胶电泳时胶中DNA是靠什么发出荧光的？为什么？ 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂,可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA 含量。 （6）制备基因组DNA时用到的以下试剂分别起什么作用？ CTAB等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来 氯仿有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 无水乙醇上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。75%乙醇,乙醇轻轻洗涤管壁 实验二RNA的制备 1.制备RNA时通常要注意些什么？为什么？ 应该要注意(1)不要徒手操作,必须带手套;(2)加样时不能够大声说话,防止唾液等进入; 由于RNA分子的结构特点，容易受RNA酶的攻击反应而降解，加上RNA酶极为稳定且广泛存在，因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成败的关键。 2.制备的RNA通常有哪些用途？制备的DNA通常又有哪些用途？ 研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。 质粒DNA构建克隆载体,分离目的基因 3.RNA制备好后是通过什么方法检测其有没有降解的？从胶上检测什么指标来判断RNA质量好坏？为什么？
分子生物学实验-心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。 一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感分子生物学实验的"试炼"。 分子生物学实验心得体会 东强（生科01级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA的制备、PCR技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值。
分子生物学实验课件..
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取 一、实验目的 学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。 二、实验材料、设备及试剂 1、实验材料 大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp- 2、实验设备 恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅 3、试剂 酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素 三、实验步骤 液体LB（Luria-Bertain）培养基配方： 蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml） 酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml） 氯化钠 1.0% （1 g/100 ml） PH 7.0 固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉 请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！ (1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。 (2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容 至100ml。 (3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。 (4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。 (5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培 养基。 (6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。 (7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加
热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。 (8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。 (9)取其中的一瓶直接倒培养皿，每皿倒入的量以刚好能在培养皿底铺展成薄薄的一层即可。 每组倒1块培养皿，在皿盖上用记号笔写上“LB”及各组的标记。 (10)另外一瓶培养基待温度降低至60℃左右时（刚能感觉不烫手），向培养基中加入0.1ml 50mg/ml的氨苄青霉素（Amp）溶液，使培养基中Amp的终浓度为50mg/L。快速充分混匀后每组倒1块培养皿，在皿盖上标注“LB+”及各组的标记。 (11)接种环蘸取菌液，密密划线。 (12)倒置于37℃恒温培养箱中进行培养。 (13)一天后观察菌落。 四、思考题 (1)在说明本实验所用的菌种时用到这样的符号：“R-，M-，Amp-”，这告诉我们关于该菌 种的什么信息？ (2)在步骤7中，为何须待连续的白色水蒸气从排气阀排出时才能关闭排气阀？当灭菌完 毕，为何又须待高压锅指示器指示压力降为0时才能打开高压锅，而且操作次序必须是先打开排气阀然后才能打开高压锅盖？ (3)在步骤12中，为何需将涂有菌的培养皿倒置于37℃恒温培养箱中进行菌的培养？为什 么不是正放呢？ (4)你预计该实验结果是什么，即两种培养基上菌的生长情况如何？ 实验二碱裂解法小量提取质粒DNA 一实验目的 了解少量质粒制备方法与原理，掌握碱法小量提取质粒DNA的操作步骤。 二实验原理 本实验利用NaOH破坏菌体细胞使核酸物质从细胞中释放出来，因此称为碱裂解法抽提。十二烷基磺酸钠(SDS)能裂解细菌细胞膜，但更重要的作用在于其与钾离子反应后所引起的溶液中绝大部分蛋白质以及基因组DNA共沉淀。由于还有很多蛋白质不能被共沉淀掉，因此要进一步用酚、氯仿对溶液进行抽提。最后加入2倍体积的无水乙醇或0.7倍体积的异丙醇沉淀就能得到质量稳定的质粒DNA。从细菌中分离质粒DNA
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
分子生物学实验
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
分子生物学实验方法与步骤
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。 4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。 5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。 7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。 9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
分子生物学试验基础知识
分子生物学实验基础知识 分子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能等生命本质的学科，在核酸、蛋白质分子水平研究发病、诊断、治疗和预后的机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基因治疗的方法。转化（trans formation）、转染、转导、转位等是自然界基因重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解为以一分子基因为模板扩增得到的与模板分子结构完全相同的基因。使需要分析研究的微量、混杂的目的基因易于纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体（噬菌体或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition），这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体（Vector）是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。载体有质粒（plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质粒（粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的遗传标记；有供外源DNA插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体（核）以外的独立遗传因子，由双链环状DNA组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严紧型由DNA多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制1-5个质粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成，使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区（复制原点Ori），便于复制扩增；抗抗生素标记（抗氨芐青霉素Ap r、抗四环素Tc r等）或大肠埃希菌部分乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp等）和转录终止序列，便于插入的外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶
分子生物学常用实验指南
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验指导-3
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
分子生物学实验方法
实验1 植物总DNA的提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB 法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管 10、细玻棒 11、小烧杯（50ml） 12、离心管（50ml） 13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇
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分子生物学实验文档
分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
分子生物学实验步骤总结超全
一目的基因的获得 细菌基因组DNA的提取 （一）仪器 1）台式高速离心机 2）恒温水浴箱 3）枪式移液器 4）灭菌的EP管和Tip头 （二）试剂 1）溶液1: 25% 蔗糖 50mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 50mmol/L EDTA，pH8.0 500ug/ml 溶菌酶（现用现配） 100ug/ml RNase 2)溶液Ⅱ：100mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1% SDS 400ug/ml 蛋白酶K 3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 4）氯仿：异戊醇（24：1） 5）3mol/L NaAc(pH5.2) 6）异丙醇或无水乙醇 7）70%乙醇 8) TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl，pH8.0 1mmol/L EDTA，pH8.0 (三)实验步骤 1) 5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。 2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。 3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。 4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。 5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10
分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。 6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/L NaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。 7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。 8）将DNA沉淀溶解于15ul TE缓冲液中，-20°C保存。 9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。 植物DNA的SDS提取法： （一）试验试剂： 1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。 2）10 SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3）1 SSC溶液：用10 SSC溶液稀释10倍。 4）0.1 SSC溶液：用1 SSC溶液稀释10倍。 5）Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml 的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。 6）氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。 7）5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O 70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。 8) SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。 9) 1mol／LHCl。 10) 0.2mol/LNaOH。 11) 二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml 浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）］。 12) 1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。 13) 0.05mol/LNaOH。 14) DNA标准液：取标准DNA25mg 溶于少量0.05mol/L NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。 （二）实验步骤：