蛋白质表达的常见问题及其解决办法

蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。

一、表达系统选择不当

在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。

解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。

二、蛋白质无法正确折叠

蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。

解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折

叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其

异常聚集。此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以

提供适合蛋白质折叠的环境。

三、蛋白质表达产量较低

蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进

行后续实验的研究。然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。

解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。首先，可以

优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能

力的宿主菌株。其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、

培养时间等。此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。

四、目标蛋白质的纯化困难

在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的

蛋白质进行后续实验。然而，很多时候目标蛋白质的纯化过程可能面

临一些问题，如低纯度、低产量、敏感性等。

解决办法：针对目标蛋白质的纯化困难，可以尝试使用不同的纯化

方法和策略。常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过

滤层析等。此外，可以优化纯化条件，如缓冲液的成分、pH值、温度等，来提高纯化效果。对于敏感性蛋白质，可以考虑使用特殊的纯化

方法，如冷冻保存、添加保护剂等。

结论

蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，但常常伴随着一些问题。本文介绍了蛋白质表达的常见问题及其解决办法，包括表达系统选择不当、蛋白质无法正确折叠、表达产量较低和目标蛋白质的纯化困难等。通过选择合适的表达系统、优化表达条件、使用分子伴侣和优化纯化方法等，可以有效解决蛋白质表达过程中的问题，为研究提供可靠的蛋白质样品。

蛋白质表达的常见问题及其解决办法

蛋白质表达的常见问题及其解决办法蛋白质表达是生物学研究中的一个关键步骤，它涉及到将基因信息转化为具有功能性蛋白质的过程。然而，在蛋白质表达的过程中，常常会遇到一些问题，这些问题可能会影响到研究的进展和结果。本文将介绍蛋白质表达中常见的问题，并提供相应的解决办法。一、表达系统选择不当在蛋白质表达过程中，选择合适的表达系统是至关重要的。不同的表达系统在表达效率、折叠状态和产量等方面存在差异。常见的表达系统包括大肠杆菌（E. coli）、酵母、哺乳动物细胞等。找到适合自己研究目的的表达系统是解决表达问题的第一步。解决办法：根据研究的目的和所需蛋白质的特性选择合适的表达系统。对于简单蛋白质，E. coli系统往往是一个不错的选择。对于复杂的蛋白质，可以考虑使用酵母或哺乳动物细胞系统。此外，还可以尝试使用不同的表达载体和宿主菌株，优化表达条件来提高表达效率和产量。二、蛋白质无法正确折叠蛋白质的折叠状态是其功能的基础，如果无法正确地折叠，可能导致蛋白质无法发挥预期的功能。在某些情况下，蛋白质可能会出现聚集、形成夹心态或夹杂体等异常折叠状态。解决办法：针对无法正确折叠的蛋白质，可以考虑使用分子伴侣（chaperone）辅助折叠。分子伴侣是一类在细胞中参与蛋白质正确折

叠的分子，通过与目标蛋白质相互作用，帮助其正确折叠，并防止其异常聚集。此外，还可以优化表达条件，如温度、培养基成分等，以提供适合蛋白质折叠的环境。三、蛋白质表达产量较低蛋白质表达的产量是一个关键指标，特别是对于需要大量蛋白质进行后续实验的研究。然而，很多时候表达产量较低，难以满足研究需求。解决办法：提高蛋白质表达产量可以从多个方面入手。首先，可以优化表达载体和宿主菌株的选择，采用高效表达载体和具有高表达能力的宿主菌株。其次，可以优化表达条件，如诱导条件、培养温度、培养时间等。此外，还可以使用辅助表达因子，如融合标签或信号肽，来提高表达产量。四、目标蛋白质的纯化困难在蛋白质表达之后，需要对目标蛋白质进行纯化，以获取高纯度的蛋白质进行后续实验。然而，很多时候目标蛋白质的纯化过程可能面临一些问题，如低纯度、低产量、敏感性等。解决办法：针对目标蛋白质的纯化困难，可以尝试使用不同的纯化方法和策略。常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。此外，可以优化纯化条件，如缓冲液的成分、pH值、温度等，来提高纯化效果。对于敏感性蛋白质，可以考虑使用特殊的纯化方法，如冷冻保存、添加保护剂等。

蛋白系列常见问题及解决方法

蛋白免疫学系列常见问题及解决方法 ECL 1)、膜上无目的条带 a)、目的蛋白未表达：可更换细胞重新表达。 b)、蛋白质被降解：提取蛋白时必需加入PMSF或其他蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性，并且提取过程应在冰上操作。 c)、转膜过程出现失误。 d)、抗体或酶失活：选择在有效期内的试剂。 e)、抗体不能识别目的蛋白：确认该抗体是否适用于western。 2)、目的条带很弱 a)、蛋白上样量低或目的蛋白在来源组织或细胞中的表达量并不丰富造成：可适当加大蛋白上样量。 b)、蛋白没有充分转移到膜上：转膜后可通过预染Marker判断转膜效率，也可用丽春红染膜、用考马斯亮蓝染胶，判断转膜效率。 c)、抗体效价不高，用量不足，孵育时间太短，或抗体反复使用保存不当而失活：可考虑更换效价更高的抗体，或提高抗体稀释度，延长抗体孵育时间；若怀疑抗体失活，可用斑点杂交实验确定抗体活性。 d)、曝光时间太短：可适当延长曝光时间。 3)、目的条带很浓 a)、可减少蛋白上样量。 b)、降低一抗二抗稀释度，减少抗体孵育时间。 c)、如果背景深的话，则要把发光液沥干些再压片；如果背景不深则需减少发光时间和显影时间。 4)、有非特异性条带 a)、蛋白上样量过大：降低蛋白上样量。 b)、一抗是多克隆抗体，或一抗、二抗浓度太高：可更换成单克隆抗体，或降低抗体浓度，缩短抗体孵育时间，优化一抗和二抗的使用浓度。 c)、洗膜不充分：可增加洗膜次数和Buffer用量，延长洗膜时间，或在Wash Buffer 中添加终浓度0.05%的Tween-20。 d)、目的蛋白在体内存在多种修饰形式，如乙酰化，甲基化，磷酸化，糖基化等：可查阅文献，用合适的方法去除蛋白的修饰，或选择合适的抗体。 e)、目的蛋白降解：重新准备蛋白样品，并加入足够的蛋白酶抑制剂。 5)、高背景 a)、膜没有均匀浸湿：转膜前应用100%甲醇将PVDF膜完全浸湿10秒，快速激活。 b)、膜或缓冲液污染：拿取膜与吸水纸时要戴手套，及时更换新鲜转膜缓冲液。 c)、封闭不充分：延长封闭时间。

蛋白质纯化常见问题及解决方案

蛋白质纯化常见问题及解决方案蛋白质纯化是生物化学研究中非常重要且常见的实验技术。纯化蛋白质可以帮助科学家深入理解蛋白质的结构和功能，从而推动相关领域的研究进展。然而，在进行蛋白质纯化的过程中，科学家们常常会遇到各种问题。本文将介绍一些常见的问题，并提供解决方案，以帮助研究人员顺利进行蛋白质纯化实验。常见问题一：蛋白质表达量太低在蛋白质纯化中，蛋白质的表达量是一个非常关键的因素。然而，有时候我们会发现蛋白质的表达量过低，难以获得足够纯度的样品。这可能有以下几个原因： 1. 载体选择不当：选择适合的表达载体对蛋白质表达量有很大影响。可以尝试使用高效表达载体，如pET系列载体，来提高蛋白质的表达量。 2. 菌株选择不当：不同菌株对蛋白质表达量有差异。常用的菌株包括大肠杆菌（E.coli）和酵母菌等。可以尝试不同菌株进行表达，找到最适合的菌株。 3. 条件优化不足：包括温度、培养基和诱导条件等。合理优化这些条件有助于提高蛋白质的表达量。

解决方案：针对上述问题，可以尝试优化表达载体、菌株和条件，并进行系统的优化实验。此外，还可以尝试使用其他表达系统，如哺乳动物细胞和昆虫细胞等。常见问题二：蛋白质不稳定或易聚集蛋白质在纯化过程中可能会失去稳定性，因而导致降解、聚集或失活。这种情况可能是由于多种因素造成的，例如温度、pH值、盐浓度和氧气等。解决方案：对于易聚集和不稳定的蛋白质，可以采取以下一些措施： 1. 降低温度：将温度降低到4℃以下，可以减缓蛋白质的降解和聚集速度。 2. 优化缓冲液：选择合适的缓冲液，并进行pH和离子强度的优化。有时候添加一些辅助物质，如甘油、蔗糖或胰蛋白酶抑制剂，可以提高蛋白质的稳定性。 3. 使用小分子化合物：有时候可以加入一些小分子化合物，如 L-辅酶A和聚氧乙烯醇等，来增强蛋白质的稳定性。常见问题三：蛋白质纯化的污染

原核蛋白表达常见问题解析

原核蛋白表达常见问题解析原核蛋白表达常见问题解析 1、为什么目的蛋白总是以包涵体的形式出现？在原核蛋白表达纯化中目的蛋白经常发生错误的折叠，并聚集成为包涵体。经过诱导，目的蛋白通常可达细胞总蛋白的50%以上。虽然有一定比例的蛋白以可溶的单体形式存在，而多达95%（甚至更多）的蛋白则在包涵体中。实验过程中，可以采取降低诱导温度，例如25–30°C，或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间，还有采用特别的培养基等方法获得更多的可溶蛋白。 2、跨膜蛋白为什么很难表达？跨膜蛋白的表达成功率相对较低是一个实验结果，究其原理，目前众说纷纭很多种理论。以我们浅薄的理解层面来看，主要有以下几个原因：跨膜蛋白一般都是强疏水性的氨基酸分子和亲水性的分子跳跃式的连接，形成的亲水疏水的一个最简单的跨膜化学结构，这种结构与信号肽结构相似，对于原核细胞来说，简单的细胞器很难像真核细胞一样完成信号肽识别及切除、引导内质网、高尔基体重新包装及分泌这一复杂过程，有些蛋白是多次跨膜，对于原核细胞来说几乎是不可能完成的任务。另外，对于疏水性的片段，在原核细胞中极易形成包涵体，疏水性多肽会抑制翻译过程，甚至与原核膜结构融合形成毒性，出于

自我保护的本能，所有的细胞器都会停止合成蛋白的过程。 3、如何选择蛋白表达宿主菌？ 4、我们有哪些原核蛋白纯化方式？如何选择不同的纯化方式？答：我们公司的蛋白纯化方法大致分为亲和纯化、离子交换、切

回收三类。 1、常规情况下，一般携带融合标签（His标签，GST标签，sumo标签，Fc标签），我们可以通过Ni柱、GST柱、Protein A等进行亲和纯化获得融合蛋白，用亲和纯化的方法一般可以获得85%以上纯度的蛋白，亲和纯化的方便快捷。 2、如果需要目的蛋白不含有任何标签，怎么选择纯化方式？。（1）可表达融合蛋白，用蛋白工具酶切割融合蛋白，再进行纯化除去工具酶。此方法能快速得到蛋白。（2）可表达不含标签的蛋白，进行离子、分子筛、疏水等纯化，通过AKATA纯化设备获得蛋白。 3、如果需要获得蛋白作为抗原，可以直接通过切胶回收的方式，此方法获得蛋白纯度较高，进行免疫动物后得到的抗体进行WB反应，灵敏度较高。 5、表达得到的蛋白是有活性的么？答：需要让蛋白有活性的条件很复杂，合适的缓冲液体系、盐浓度、蛋白的折叠状态甚至检测活性的方法的细微差别都可能导致活性的强弱有无，一般情况下，上清表达的蛋白要比包涵体经过变复性纯化后得到的蛋白活性要好，我们尽量从上清中获得蛋白，期许蛋白形成的折叠最接近活性状态，这也是我们擅长的。但是在实际实验条件下，我们无法承诺表达纯化的蛋白一定具有客户期望的生理活性。 6、是否所有的位点特异性蛋白酶都有一样的酶切特性，只是识别位点不同？

蛋白不表达

蛋白不表达引言蛋白质是生物体中最基本的组成部分之一，它们在生物体内发挥着重要的功能。然而，在某些情况下，蛋白质的表达可能会出现问题，导致一系列的生物学和医学问题。本文将探讨蛋白质不表达的原因、影响以及可能的解决方法。为什么蛋白不表达蛋白质的表达受到多种因素的调控，包括基因转录、蛋白翻译、蛋白质修饰等。蛋白质不表达的原因可以是多方面的。 1. 基因转录问题基因转录是蛋白质表达的第一步，如果基因没有被正确地转录成mRNA，则无法进行后续的蛋白质翻译过程。基因转录问题可能包括基因突变、转录因子缺失、启动子区域的变异等。 2. 蛋白翻译问题蛋白翻译是将mRNA转化为蛋白质的过程。如果翻译过程中出现错误，或者翻译过程被抑制，都会导致蛋白质不表达。蛋白翻译问题可能包括启动子序列的变异、翻译起始子的缺失、翻译因子的不足等。 3. 蛋白修饰问题蛋白修饰是调控蛋白质功能和活性的重要过程。如果蛋白修饰过程出现问题，也会导致蛋白质不表达。常见的蛋白修饰问题包括磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰方式的缺失或错误。蛋白不表达的影响蛋白质不表达可能会对生物体的正常功能产生重大影响。

1. 细胞功能受损蛋白质作为细胞内重要的功能分子，参与了细胞的各种生物学过程。如果某些关键的蛋白质不表达，细胞的正常功能将受到严重的影响，可能导致细胞死亡、代谢紊乱等现象。 2. 器官和组织功能受损蛋白质的功能不仅限于细胞内部，还可以参与组织和器官的正常功能调控。如果某些关键的蛋白质不表达，可能导致器官和组织的功能受损，进而影响整个生物体的生理活动。 3. 疾病的发生和发展蛋白质的不表达也可能与一些疾病的发生和发展密切相关。例如，某些肿瘤细胞中特定的肿瘤抑制因子蛋白质不表达，导致异常的细胞增殖和分化，从而促进肿瘤的发展。解决蛋白不表达的方法针对蛋白质不表达的问题，科学家们提出了一系列的解决方法。 1. 基因治疗基因治疗是利用基因传递手段将正常的基因传递给患者，从而恢复蛋白质的表达。其中常用的方式包括载体介导的基因转导、基因编辑等。这些方法可以通过修复基因上的突变位点、引入缺失的基因片段等方式来实现蛋白质的表达。 2. 蛋白替代治疗蛋白替代治疗是将外源性的蛋白质或其类似物注入患者体内，以弥补蛋白质的不表达。这种方法常用于缺失某一种特定蛋白质导致的遗传病或疾病治疗。例如，胰岛素注射治疗就是一种常见的蛋白替代治疗方法。

外源蛋白表达失败或不表达的原因和解决方法

外源蛋白表达失败或不表达的原因和解决方法外源蛋白表达的定义和意义外源蛋白表达是指在一个生物体（如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物等）中表达另一个生物体（如植物、动物、病毒等）的蛋白质的技术，它是生物技术的重要手段和工具。外源蛋白表达可以用于研究蛋白质的结构和功能，开发新型的药物和疫苗，生产工业用途的酶和激素等。外源蛋白表达失败或不表达的原因外源蛋白表达失败或不表达的原因很多，可以分为上游和下游两类。上游原因上游原因是指与外源基因本身特性或重组蛋白细胞毒性等相关的原因，它们只能通过上游的合理设计来解决。上游原因包括以下几种：•外源基因与宿主细胞的密码子用法不匹配，导致翻译效率低或错误。 •外源基因含有宿主细胞不能识别或不能正确加工的信号序列，导致转运或定位异常。 •外源基因含有宿主细胞不能识别或不能正确剪切的内含子，导致转录或翻译中断。

•外源基因含有宿主细胞不能识别或不能正确修饰的位点，导致糖基化、磷酸化等后期修饰缺失或异常。 •外源基因含有宿主细胞不能兼容或不能稳定保存的序列，导致重组质粒不稳定或降解。 •重组蛋白对宿主细胞产生毒性或抑制作用，导致细胞生长受阻或死亡。下游原因下游原因是指与下游的操作不当或失误等相关的原因，它们可以通过下游的规范操作和优化条件来避免。下游原因包括以下几种：•重组菌甘油管保存时间过长，导致质粒丢失或突变。 •诱导剂加错或用量不当，导致重组蛋白表达水平低或无法诱导。 •表达条件选择不合适，导致重组蛋白表达效率低或形成包涵体。 •蛋白纯化步骤操作不规范，导致重组蛋白损失或污染。 •SDS-PAGE或WB检测操作不当或试剂失效，导致重组蛋白检测失败或假阴性。外源蛋白表达失败或不表达的解决方法外源蛋白表达失败或不表达的解决方法需要根据具体的原因和情况进行选择和调整。一般来说，可以从以下几个方面进行优化：

蛋白不表达：常见原因及分析

蛋白不表达：常见原因及分析根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。 1.载体构建错误。这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。 2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。见下图 3.密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤

10、转录终止子。转录终止子的存在可以促进蛋白表达；但是缺少时就会造成“通读”，没完没了地读下去。这在pET系统里不成问题，因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。如果没有的话，它们会竞争得天昏地暗，抢着生成mRNA和蛋白质。 11、mRNA的不稳定性。靶基因的mRNA常聚集于细胞内。但是大肠菌的mRNA及其不稳定。如果在mRNA的5'-非翻译区和3‘-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列，可以促进mRNA的稳定性。尤其是5'末端要是有个不带突出的发夹结构，能让mRNA 在胞浆内无生命之虞。 12、检测方法的可行性。有时候，蛋白的确表达了，只是表达量特别低，或者和杂带靠得特别近，致使你错误地以为蛋白没有表达。这时候，你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则：对照和重复。说到对照，有很多层意思。最基本的意思是，要设立空载体对照。在真核系统表达的蛋白，常常量特别低。因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。这时候，你必须多看文献，另辟蹊径，从文献中找找看这个蛋白有米有很特别的性质----比如说如果它具有酶活性，那简直就是便宜你了。还比如说，某些蛋白具有异样性

蛋白质表达与纯化常见问题解答

蛋白质表达与纯化常见问题解答蛋白质表达与纯化是生物科学研究中常见的实验技术，用于研究蛋白质的结构、功能和相互作用等。然而，在进行蛋白质表达与纯化实验时，常常会遇到一些问题。本文将针对蛋白质表达与纯化过程中的常见问题进行解答，帮助读者更好地进行实验和解决实验中可能遇到的困难。一、蛋白质表达问题解答 1. 为什么我的目的蛋白质在大肠杆菌中表达得不好？蛋白质表达的成功与多种因素相关，包括宿主菌的选择、启动子的选择、表达载体的构建等。首先，确认宿主菌是否合适，某些蛋白质可能需要使用其他细菌或真核细胞进行表达。其次，选择合适的启动子和表达载体，确保表达水平能够满足需求。另外，光照条件、温度、培养基的选择等也会对表达效果产生影响。 2. 我应该选择哪种表达载体？选择表达载体应根据实验需求来定。一般来说，常用的表达载体有质粒和病毒载体。质粒表达系统适用于小规模表达和纯化，而病毒载体表达系统适用于大规模表达和高效表达。另

外，如果需要对蛋白质进行特定修饰，如标记或融合蛋白表达，可选择相应的表达载体。 3. 如何对表达后的蛋白质进行检测？常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE、Western blot和质谱分析等。SDS-PAGE能够分析蛋白质的分子量和纯度，Western blot可以检测特定蛋白质的表达水平，质谱则可以确定蛋白质的分子量和结构。根据实验需求选择合适的方法进行检测。二、蛋白质纯化问题解答 1. 我应该选择哪种纯化方法？选择纯化方法取决于蛋白质的性质和需求。常见的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。亲和层析适用于具有特异结合能力的配体，离子交换层析适用于根据蛋白质电荷差异进行分离，凝胶过滤层析适用于根据蛋白质的分子量进行分离。根据蛋白质的特性选择合适的纯化方法。 2. 如何确定纯化效果？纯化效果可通过测定蛋白质的比活性、比强度和纯度来确定。比活性和比强度分别指的是单位反应物质的相应活性或强

蛋白不表达：常见原因及分析

其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。 4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。 5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或 Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met 时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。

蛋白质不表达：常见原因及分析

喜欢转贴的，请注明来自中国生命科学第一网：丁香园。根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢迎大家拍砖。 1.载体构建错误。这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比如Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。 2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择合适的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。见下图 3.密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用（确认有表达，以此来提高表达量），而不能雪中送炭（没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效）。 4、质粒不稳定或者质粒丢失。pET系统通常比较稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丢失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丢失。这种情况多见于真核表达系统。

5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规则。N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电荷的，则不易被降解。 6、二级翻译起始位点。这种情况见于你的序列里正好含有和核糖体结合位点完全一致的序列。那就怪不得人家了，核糖体会很高兴地找到这个位点，然后开始翻译，致使你的蛋白被截短，在电泳时看不到预期大小的片段。 7、SD序列。这个不陌生吧？考研时老师喜欢出名词解释，也难怪人家老是拿这个出题----SD序列和起始密码子序列（80%是AUG，也有GUG的）之间的距离，对蛋白表达的效率也有着非常重要的影响。SD序列本身的组成对翻译效率也有影响。有时为了减少包涵体的产生，还特别对SD序列进行修饰呢！ 8、mRNA的二级结构。在克隆之前，你得看看你的序列里是否有和核糖体结合位点和/或翻译起始位点互补的序列。如然，你最好进行同义密码子替换。否则由此形成的mRNA二级结构，会让翻译嘎然而止的。 9、意外终止。这种情况见于PCR扩增序列时，会和你开个不大不小的玩笑。比如它会将序列中间TAC突变为TAA，让你的蛋白翻译刹车。所以在进行表达之前，一定要进行测序，避免这种情况的发生。 10、转录终止子。转录终止子的存在可以促进蛋白表达；但是缺少时就会造成“通读”，没完没了地读下去。这在pET系统里不成问题，因为它在靶基因的相反方向有个选择性的标记基因。如果你的靶基因正好和这个标记基因方向一致，那么你得看看你的靶基因后是否有个转录终止子。如果没有的话，它们会竞争得天昏地暗，抢着生成mRNA和蛋白质。 11、mRNA的不稳定性。靶基因的mRNA常聚集于细胞内。但是大肠菌的mRNA及其不稳定。如果在mRNA的5'-非翻译区和3…-rho非依赖性终止子处插入稳定结构序列，可以促进mRNA的稳定性。尤其是5'末端要是有个不带突出的发夹结构，能让mRNA在胞浆内无生命之虞。 12、检测方法的可行性。有时候，蛋白的确表达了，只是表达量特别低，或者和杂带靠得特别近，致使你错误地以为蛋白没有表达。这时候，你可千万别忘记了生物学实验的两大黄金准则：对照和重复。说到对照，有很多层意思。最基本的意思是，要设立空载体对照。在真核系统表达的蛋白，常常量特别低。因此你不要老是想着WB和SDS-PAGE去检测。这时候，你必须多看文献，另辟蹊径，从文献中找找看这个蛋白有米有很特别的性质----比如说如果它具有酶活性，那简直就是便宜你了。还比如说，某些蛋白具有异样性质，比如说流感病毒的HA，你拿表达的不同梯度稀释的蛋白做个血凝。如果发生血凝，并且呈现一定的梯度关系，那简直就是板上钉钉的事情了。总结起来，套用一句很经典的电影台词：能表达出来的蛋白，其原因都是一致的；表达不出来的蛋白，各有各的原因。我这个小帖子，就是给你一点启示：从哪里找原因。希望能抛砖引玉，得到更多有价值的建议。

蛋白不表达：常见原因及分析

蛋白不表达：常见原因及分析 LT

蛋白不表达：常见原因及分析根据自己体会和蛋白版的既往精华帖子，总结了没有发现蛋白质表达的原因，或者蛋白质不表达的原因，欢送大家拍砖。 1.载体构建错误。这个屡见不鲜，很多克隆新人经常弄错读码框。比方Qiagen的pQE系列载体，其克隆位点常有一两个碱基的区别；另外有些酶产生粘端有些酶产生平端，这些都容易导致读码框错误，从而表达不出来。 2.宿主菌选择不当。不同的宿主菌其基因型是不一样的。有些经过特殊修饰的载体，或者特殊用途的载体，或者有特殊启动子的载体，必须选择适宜的宿主菌进行表达。因此，当你的蛋白没有表达出来时，可以考虑更换宿主菌。见下列图 3.密码子的使用频率低。有些基因其本身含有许多稀有密码子，尤

其是起始密码之后的15个碱基之内的稀有密码子，对蛋白表达有着很重要的影响。优化密码子对原核表达似乎效果很好，对真核表达系统未见得有很好的效果。曾经有某人在毕赤酵母表达某蛋白两年未果，试图将密码子优化进行表达，结果还是没有表达。一气之下将该优化的基因序列克隆到原核表达载体，表达量居然出奇地高！这是一个辛酸的笑话，但是一个真实的故事。但是有一点我可以有很大把握的说：对于真核表达，密码子优化只能起锦上添花的作用〔确认有表达，以此来提高表达量〕，而不能雪中送炭〔没有表达出来，通过密码子优化极有可能不奏效〕。 4、质粒不稳定或者质粒丧失。pET系统通常比拟稳定。但是你选用带氨苄青霉素抗性的载体时，也许有可能产生β-lactamase降解了抗生素，使质粒丧失。还有一种情况是表达重组的毒素蛋白，对宿主细胞也有毒性，造成质粒丧失。这种情况多见于真核表达系统。 5、蛋白酶将蛋白降解了。这种情况常由重组蛋白本身的N-或C-端序列引起的。当蛋白N-端是Arg, Leu, Lys, Phe, Trp,或Tyr 这些氨基酸时，容易遭受蛋白酶降解，此即N-末端规那么。N-端是Met时，大肠杆菌可以悄悄地把这个Met偷走，特别是Met 后紧跟着一个带小侧链的氨基酸时。C-末端存在非极性氨基酸时，也容易导致蛋白被降解。C末端最后5个氨基酸是极性的或者带电

蛋白不表达常见原因及分析

蛋白不表达常见原因及分析蛋白质是生物体内最基本的结构单位，它们在细胞的生物化学功能中起着至关重要的作用。然而，在某些情况下，蛋白质的表达可能会受到抑制或受到其他因素的干扰，导致其无法正常表达。本文将探讨蛋白不表达的常见原因及其分析。 1. 基因突变基因突变是导致蛋白质不表达的主要原因之一。突变可能引起 DNA序列的改变，进而使正常的转录和翻译过程受到影响。例如，点突变可能会导致氨基酸序列发生变化，从而影响蛋白质的结构和功能。这种突变可能会导致蛋白质在转录或翻译过程中发生错误，并最终导致其无法正常表达。 2. 转录调控异常蛋白质的表达通常受到转录的调控。转录调控是指在基因转录过程中通过启动子和调控因子来控制基因表达水平的调节机制。如果转录调控过程中发生异常，例如调控因子缺失或突变，将导致蛋白质无法正常表达。此外，DNA甲基化也是一种常见的转录调控机制，它可以通过甲基化基因组区域来静默基因的表达。 3. 翻译后修饰异常翻译后修饰是蛋白质合成后的重要过程，它可以调节蛋白质的结构和功能。然而，某些异常情况下，翻译后修饰可能无法正确进行，导

致蛋白质无法正常表达。例如，翻译后修饰酶的缺失或突变可能会导致磷酸化、甲基化、乙酰化等修饰无法进行，从而影响蛋白质的功能。 4. 细胞环境影响蛋白质的表达还受到细胞环境的影响。细胞内环境的改变可能会影响蛋白质的产生和稳定性。例如，异常的细胞应激反应、病毒感染、细胞内局部代谢物浓度的变化等都可能导致蛋白质无法正常表达。 5. 蛋白质降解异常蛋白质的降解也是影响蛋白质表达的重要因素。异常的蛋白降解过程可能导致蛋白质无法稳定存在。例如，异常的泛素化和蛋白酶体功能可能导致蛋白质的过早降解，从而影响其表达。综上所述，蛋白质不表达的原因多种多样，包括基因突变、转录调控异常、翻译后修饰异常、细胞环境影响以及蛋白质降解异常等。了解这些原因并分析其影响是研究蛋白质功能和相关疾病的重要基础。未来的研究应该继续深入探索这些问题，以促进我们对蛋白质表达机制的理解，并开发出新的疾病治疗策略。最后，我们应该关注蛋白质表达问题的研究，以推动生命科学的进一步发展。

蛋白质表达的异常可能会导致多种疾病

蛋白质表达的异常可能会导致多种疾病蛋白质是组成生物体的基本单位，对于维持机体正常功能发挥着重要作用。然而，蛋白质的异常表达会导致多种疾病的发生和发展。本文将从蛋白质异常表达的机制、常见疾病以及相关的治疗方法等方面进行讨论。一、蛋白质异常表达的机制蛋白质的正常表达受到基因的调控。在正常情况下，基因会转录成RNA，然后通过翻译过程生成蛋白质。然而，在某些情况下，由于基因的突变、染色体异常、环境因素等原因，蛋白质的表达可能会发生异常。最常见的蛋白质异常表达机制是突变。蛋白质编码基因的突变会导致蛋白质结构的改变，从而影响其功能。比如，突变可能导致蛋白质的折叠异常、稳定性降低或者功能丧失，进而导致一系列疾病的发生。此外，染色体异常也是蛋白质异常表达的原因之一。例如，染色体上的缺失、重复、倒位等变异会影响蛋白质编码基因的表达水平或者结构，从而导致疾病的发生。二、与蛋白质异常表达相关的疾病 1. 遗传性疾病：蛋白质异常表达是许多遗传性疾病的重要原因。比如，先天性心脏病、囊性纤维化、天疱疮等都与蛋白质的异常表达相关。这些疾病的发生与特定基因突变导致的蛋白质异常有密切关系。

2. 肿瘤：蛋白质异常表达在肿瘤的发生和发展中起着重要作用。癌症是由于细胞基因异常所致，其中包括一些蛋白质的异常表达。例如，肿瘤抑制基因的突变会导致抑癌基因蛋白质表达水平下降或丧失，从而促使癌细胞的异常增殖和扩散。 3. 神经系统疾病：蛋白质异常表达与许多神经系统疾病有关。例如，阿尔茨海默病、帕金森病等神经系统退行性疾病的发生与蛋白质的异常聚集和沉积有关。三、蛋白质异常表达的治疗方法针对蛋白质异常表达导致的疾病，科学家们积极探索新的治疗方法。以下是一些常见的治疗策略： 1. 基因治疗：基因治疗通过改变患者体内存在异常表达的基因来恢复蛋白质的正常表达。这包括基因替代疗法、基因编辑等技术。 2. 药物疗法：药物疗法是目前最常用的治疗方法之一。科学家们通过研发特定的药物来恢复或调节蛋白质的正常表达水平。这些药物可以通过靶向基因、蛋白质的表达调控机制来发挥疗效。 3. 细胞治疗：细胞治疗是一种新兴的治疗策略，其通过改变患者体内细胞的表达模式来治疗疾病。例如，利用基因编辑技术将正常的基因导入患者体内，从而恢复蛋白质的正常表达。四、结语蛋白质异常表达作为多种疾病的关键因素，对于疾病的发生和发展起着重要作用。科学家们不断探索蛋白质异常表达的机制，并积极寻

蛋白表达常见问题分析

蛋白表达常见问题分析影响蛋白表达有许多因素，如目的蛋白自身的特点，表达载体、表达菌株的组合，诱导表达的条件，培养基的选择等，都有可能对蛋白的表达产生影响。针对蛋白表达中的一些常见问题，可尝试用如下方法加以解决。一、蛋白不表达或表达量很低 1．选择正确的表达载体与表达菌株基于T7 启动子的载体（如pET 系列载体）应选用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株不是基于T7 启动子的表达载体（如带有tac 启动子的pGEX、pMal 系列表达载体）应选用BL21 表达菌株。对细胞有毒性的蛋白，应该选用背景表达低、严紧调控诱导的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。对于带有稀有密码子的蛋白或来源于真核基因的蛋白，应该选用Rosetta(DE3) 等菌株。 2．尝试不同的表达系统与菌株不同的蛋白，对不同载体与菌株的偏好不同，如果某一表达系统无法通过优化诱导表达条件得到明显改善，可以更换其它的菌株或表达载体。 3．表达条件的优化选择不同的培养基。对于某些蛋白，在培养基中加入适量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明显提高表达量。较高的温度、较高的诱导物浓度、较长的表达时间，一般可以加快表达的速度，促进目的蛋白的积累，从而提高表达量。但是可能会降低可溶蛋白的表达量，形成包涵体。菌体的生长状态对蛋白表达有很大的影响，可以通过测量菌液的OD 值监测生长状态。对于大部分蛋白，应在菌液的对数生长期（OD ≈ 0.5）进行诱导。二、目的蛋白不可溶，形成包涵体首先确认目的蛋白是否有表达。裂解菌体并离心后，通过对全菌、上清、沉淀的检测，确认目的蛋白是否表达，还是形成了包涵体。包涵体的形成与蛋白自身结构、表达系统、诱导表达条件等因素有着密切关系。在无法改变蛋白自身结构的情况下，可以尝试不同的表达系统与菌株，增强其溶解能力，优化出适合特定蛋白的表达系统。目前认为包涵体的形成是基于蛋白在菌体内积累速度过快，没有正确折叠而聚集沉淀。可以通过优化诱导表达条件，减缓蛋白的积累。如：降低诱导温度、降低诱导物浓度、缩短表达时间、降低诱导时菌液的OD 值。