亲和层析名词解释
亲和层析的原理和应用
亲和层析的原理和应用1. 什么是亲和层析亲和层析（Affinity Chromatography）是一种分离和纯化生物分子的方法，利用分子间的亲和性相互作用进行分离。
亲和性相互作用是指生物分子之间的特定相互作用，如抗原与抗体、受体与配体、酶与底物等。
亲和层析常用于蛋白质、核酸和其他生物分子的富集、纯化和研究中。
2. 亲和层析的原理亲和层析的原理基于生物分子之间的亲和性相互作用。
在亲和层析中，通常将目标分子与具有亲和基团的小分子（称为配体）结合，然后将该配体固定在固定相上。
通过将样品溶液通过固定相，目标分子与配体之间的亲和性相互作用被利用，使目标分子与配体结合并留下，其他分子则通过固定相进行洗脱。
亲和层析的固定相可以选择多种形式，如亲和基团被共价结合在聚合物基质上，或者将亲和基团直接结合在固定相表面。
这样一来，亲和基团上的特定化学团可以与目标分子中的互补化学结构相互作用，从而实现目标分子的选择性捕获。
3. 亲和层析的应用3.1 蛋白质分离和纯化亲和层析广泛应用于蛋白质的富集和纯化过程。
通过将特定亲和基团固定在固定相上，可以实现特定蛋白质的选择性捕获。
例如，可以使用具有亲和基团的树脂对特定的酶、抗体或标签蛋白进行富集和纯化。
亲和层析可以通过调节洗脱条件来实现蛋白质的纯化，从而得到高纯度的蛋白质样品。
3.2 生物分子相互作用研究亲和层析可以用于研究生物分子之间的相互作用。
例如，可以使用亲和层析技术来探索蛋白质与配体之间的互作用机制，或者使用具有亲和基团的固定相来研究蛋白质与DNA或RNA之间的结合方式。
通过研究生物分子之间的相互作用，可以深入理解生物体内各种生物过程的机制。
3.3 药物筛选和研发亲和层析在药物筛选和研发过程中也有广泛应用。
通过使用亲和层析技术，可以筛选出与目标蛋白质特异性结合的小分子药物。
这种选择性结合可以用于评估药物与目标蛋白质之间的亲和性，从而帮助选择更有效的潜在药物候选物。
3.4 DNA/RNA纯化亲和层析也可以应用于DNA/RNA的纯化。
亲和层析_精品文档
利于酸性蛋白的偶联。
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5、CM-生物胶A、亲和胶202和亲和胶102 CM Bio-Gel A，无“手臂” 的羧基衍生物； Affi-Gel 102具有6个原子“手臂”，未端为氨基。 Affi-Gel202具有10个原子的“手臂”，未端具有羧基；
（二）、空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小分
子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相连 配基的活动度，减轻载体的 立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）、配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基 须控制偶联反应条件，使它以最少的功能基
团与载体连接。 保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂
（2）当ESI稳定性与EI相同时，I的存在并不 影响E对S的结合，非竞争性效应。
（3）反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与 S结合更紧密（负洗脱） 。
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反竞争性效应
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亲和层析中配基的选择和洗脱条件
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（三）、亲和吸附剂的再生
用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由
联。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体 通过醚链形成的衍生物。
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电荷，有
择性。
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（二）、亲和层析的洗脱
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法亲和层析是一种分析方法，通过利用物质之间的亲和性来分离和分析目标物质。
它基于物质之间的特异性亲和作用，通过将目标物质与具有亲和性的固相材料结合，实现目标物质的富集和分离。
亲和层析的原理是基于生物分子之间的亲和性。
在生物体内，许多分子之间存在着特定的亲和性相互作用。
例如，抗体与抗原之间的结合就是一种典型的亲和性相互作用。
利用这种亲和性原理，可以将含有特定抗原的样品与具有相应抗体的固相材料结合，然后通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析的方法包括亲和层析柱和亲和层析片。
亲和层析柱是将具有亲和性的固相材料填充在柱子中，样品通过柱子时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则通过柱子。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从固相材料上分离出来。
亲和层析片则是将具有亲和性的固相材料固定在薄膜上，样品与薄膜接触时，目标物质会与固相材料结合，非目标物质则被排除。
然后可以通过洗脱的方式将目标物质从薄膜上分离出来。
亲和层析方法具有许多优点。
首先，亲和层析可以选择性地富集目标物质，从而降低了样品中其他干扰物质的影响。
其次，亲和层析具有高灵敏度和高分辨率的特点，可以检测到低浓度的目标物质。
此外，亲和层析还具有快速、简单和可重复性的优点，适用于大规模的样品分析。
亲和层析在许多领域中得到了广泛的应用。
在生物医学领域，亲和层析可以用于分离和富集特定蛋白质或生物分子，以便进行后续的分析和研究。
在药物研发中，亲和层析可以用于筛选和分离具有特定药物靶点亲和性的化合物。
在环境监测和食品安全领域，亲和层析可以用于检测和分离目标污染物或有害物质。
亲和层析是一种基于亲和性相互作用的分析方法，通过选择性地富集和分离目标物质，实现了样品的准确分析。
亲和层析方法具有许多优点，并在各个领域中得到了广泛应用。
未来随着技术的不断发展，亲和层析方法将进一步完善和应用于更多的领域，为科学研究和工业生产提供更多的可能性。
亲和层析
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释
亲和层析是一种蛋白质分离技术，是将亲水性聚合物——聚丙烯酰胺按预先设计的程序加入到样品溶液中，以胶束为架桥剂。
当待测蛋白质在一定浓度梯度的聚合物溶液中通过胶束时，吸附在胶束上并随之进入疏水相中的待测蛋白质就会被高度保留在胶束周围，然后用洗脱缓冲液洗脱，最后将得到的疏水性高聚物的清液在超声波场作用下去除。
由于蛋白质和聚丙烯酰胺之间的特异性吸附，使蛋白质在层析液中移动形成特征的拖尾现象。
亲和层析是利用层析介质表面上所固有的吸附力，将物质分配到具有不同吸附能力的两相之间，形成彼此分离的各个分子层。
亲和层析的种类很多，常见的有：亲和柱层析、疏水膜层析、液膜层析等。
亲和层析技术由英国纽卡斯尔大学与美国加州大学伯克利分校
共同开发的一种新型的蛋白质分离技术，它可以直接分离纯化蛋白质。
亲和层析技术的原理基于吸附与解吸附的机理，当待分离物质从层析柱移动时，由于受到吸附介质的吸附，使得该物质的分子量下降，经分离后达到分子量高的蛋白质的峰展宽，而分子量低的蛋白质的峰缩窄甚至消失。
这样就把峰位展宽或展宽消失的蛋白质区分开来，分别采集收集它们的蛋白质样品。
这种方法对层析介质的选择十分重要。
常用的层析介质有以下几种。
1、固相支持物质； 2、疏水固体颗粒；
3、多孔介质。
亲和层析亲和层析技术是在疏水性载体上，借助于疏水性基团对蛋白质的选择性吸附而进行分离纯化的。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析是研究样品中的各组分与某些对生物大分子有专一性吸附能力的特殊分子或离子相互作用，并利用这种相互作用选择和富集待测组分。
所谓亲和层析是根据生物大分子具有可解离或与配体结合成牢固的结合态，因而它们与蛋白质、核酸、糖类及脂质等生物大分子形成复杂的亲和力。
这些生物大分子不仅能与不同的蛋白质、核酸以及糖类等结合，而且还能与多种其他分子结合。
这种结合的专一性使它在吸附分离生物大分子时比一般选择性薄层色谱更加灵敏、迅速。
所以根据生物大分子的可解离性以及由此产生的不同的亲和力，在某些生物大分子上就能达到高度的分离，获得纯化的生物大分子。
这是亲和层析技术应用的理论基础。
8-nm亲和层析与氨基酸、核酸的亲和层析一样，属于离子交换层析法的一种。
它是用2。
5-5。
0尼龙的电极，以连续可变的电压通过被洗脱组分，从而将它带出来的。
亲和层析也可以用阴离子型缓冲溶液（如Ca(2+)， Mg(2+)等）进行，然后再用等电点沉淀或分子筛效应进行分离。
在亲和层析时，要使用电极活性较低的阴离子，并要用与样品等电点接近的缓冲溶液洗脱，避免电解质引起的组分沉淀。
9。
11。
12。
13。
16。
大多数氨基酸、核酸等生物大分子都有亲和性。
氨基酸中的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等的羧基部分都有强亲和性，例如氨基酸的D-COOH-COO NH2与亲和层析的AgNO3等阴离子或阳离子生成稳定的Ag，而氨基则保持游离状态。
相反，许多游离胺基酸如丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等都具有亲和性。
氨基酸中的尿素、天冬酰胺、谷酰胺等碱性氨基酸都不具有亲和性，它们的亲和性与相应的羧酸有关。
游离的蛋白质多数也具有亲和性。
在亲和层析时，电极活性越低，对生物大分子的亲和性越小，则洗脱时的迁移率越快，即层析的分辨率越高。
蛋白质的氨基虽然能以N-NH2基形式存在，但多数只有N-NH2的形式才具有亲和性，所以通常称为弱亲和蛋白质。
通常用于分离蛋白质的有氨基苯甲酸盐、咪唑啉酮、大豆苷、天冬酰胺等。
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亲和层析名词解释
亲和层析的基本原理是通过层析柱使吸附剂对某种物质的结合
能力增强，或者改变其分子形状使它更易于与其他组分进行亲和层析。
简言之就是把组分放在亲和层析柱上，让吸附剂对某个组分的吸附作用增强，因此减弱或避免了它对其他组分的吸附作用。
亲和层析技术具有一些特殊性：①亲和层析反应体系属于多组
分反应体系，具有相当大的范围可以选择；②利用亲和层析方法可
以将含量低的同类型物质，甚至许多非亲和性组分结合在一起；③
由于亲和层析不但具有显著的选择性，而且还能同时对两种或两种以上的不同物质进行层析，因此对这类化合物的分离和鉴定具有独特的优越性；④对混合物中不同类型的化合物都能进行层析，即使物质
间的亲和性很差，如异构体之间也能被分离。
亲和层析技术已经广泛地用于天然产物化学成分的分离和鉴定、药物分子的筛选和结构改造、环境污染物的检测、生物活性物质的研究以及疾病的诊断等领域。
目前，该技术已经成功地应用于维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、蛋氨酸、生物碱、三尖杉酯碱、芦荟
大黄素、葛根素、万寿菊素、番茄红素、菠菜素、辣椒素、藏红花素、皂苷元、蛋白质、酶、雌性激素、黄酮类化合物、动物激素、血清和细胞培养液中多种微量元素等物质的分离和鉴定。
在植物化学、药学、分子生物学、生命科学等领域，亲和层析方法也得到了广泛应用。
自1960年第一次用亲和层析方法对一些水果蔬菜和草药中的几十种成
分进行了分离后，亲和层析方法就受到各国科学家的重视，并获得了
飞速发展。
亲和层析是基于极性分子吸附剂上的疏水部分和亲和性化合物中的亲水部分互相吸引而实现的。
不同的亲和层析方法常采用不同的吸附剂，如水合物(或疏水性吸附剂)和氧化物(或亲水性吸附剂)。
根据吸附剂与待分离化合物的亲和程度，常用四级亲和度(级别越高
说明与化合物的亲和性越强)：(1)较弱亲和，用氧化物吸附剂；(2)
中等亲和，用水合物吸附剂；(3)较强亲和，用亲水性吸附剂；(4)
极强亲和，用强水合物吸附剂。
目前广泛应用的吸附剂主要有氧化铝、硅胶、蒙脱土、沸石、分子筛等。
一般认为亲和层析法适合分离脂溶性物质和水溶性物质。