第7章 亲和层析共56页文档
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第七章亲和层析
特定抗原
酶 受体、结合蛋白 脱氢酶、激酶、干扰素、聚合酶、限制酶等 凝聚因子、脂酶、某些蛋白酶、DNA聚合酶 等 糖蛋白
对应单克隆或多克隆抗体
对应底物、辅酶、抑制剂 对应信号分子、效应物 染料配体 肝素 凝集素、苯基硼酸盐
高
高 高 低 低 低
凝集素、糖苷酶
核酸
对应糖
核酸结合蛋白、互补链
高
高
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
用于制备亲和吸附剂的配体应满足亲和性、特异性要 求;当偶联到载体上时,不妨碍其与目标分子的结合;在 将配体固定化时，应保证其与载体形成稳定的共价键， 不至于从载体上脱落下来.
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
亲和层析中的合适配体
待纯化的生物分子 特定抗体 抗体/免疫球蛋白 配体 对应抗原 蛋白质A/蛋白质G 特异性 高 低
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第七章 亲和层析 第二节 亲和层析配体
二、亲和配体的类型 亲和配体主要分为专一性小分子配体、基团特异性小 分子配体、专一性大分子配体和基团特异性大分子配 体。 专一性小分子配体包括固醇类激素、维生素和特定酶 抑制剂等 . 基团特异性小分子配体的种类最多，包括许多酶的辅 助因子及其类似物，以及仿生染料、硼酸衍生物和许 多氨基酸、维生素等
将配体固定化到载体上后，需检测一下配体的浓度， 以判断偶联过程成功与否。测定偶联上的配体的浓度 有这样几种方法： 1）差示分析法：用加入的配体量减去洗脱液中游离 配体量，即可得出偶联上的配体量。
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第七章 亲和层析 第三节 亲和吸附剂
2）直接测定法：直接测定制备好的亲和吸附剂上配 体的浓度。可以根据配体的性质用分光光度法、蛋白 质测定方法或特定基团测定方法来测定。 3）放射分析法：对于具有放射活性的配体，可以很 灵敏地测出固相化配体的浓度。 4）水解法：当配体的测定不受大量的载体水解产物 干扰时，可以用此法测定亲和吸附剂上配体的浓度。 水解的方法可视配体、载体的偶联情况而定，可以采 用酸水解或酶水解。
第7章亲和层析
结合能力的测定
06.05.2021
用溴化氰活化载体
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06.05.2021
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
06.05.2021
利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
06.05.2021
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第7章 亲和层析
Anhui University of Technology and Science
第七章 亲和层析
Teaching and Rese
arch Section ·
Department of
Biochemical
Engineering
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7.2.4 配体的选择
7.2.4.2 配体的类型 •通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某一类的 蛋白质等生物大分子结合的配体，
•如各种凝集素可以结合各种糖蛋白，核酸可以结合 RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分 子的专一性虽然不如特异性配体，但通过选择合适的 洗脱条件也可以得到很高的分辨率。
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第七章 亲和层析
Teaching and Rese
• 疏水性连接臂会对样品产生非特异性吸附，若非必 要，应尽量避免接入连接臂，或选择可自动引入连 接臂的活化方法，或选择接好连接臂的商品化载体 。
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第七章 亲和层析
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第七章 亲和层析
赵世光 生物化学工程系·生物技术教研室
第一节 概述
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第七章 亲和层析
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Biochemical
Engineering
层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定
第七章层析
tR′ = tR - t0 ⑥校正保留体积VR′ 扣除死体积后的保留体积称为校
正保留体积（或调整保留体积）；其定义式为：
VR′ = VR–V0
VR′与tR′之间的关系为：
VR′ = tR′ Fc
死体积V0反映了色谱柱的几何特性，它与被测物质的性
质无关。保留体积VR中扣除死体积V0后，即校正保留体积
VR′，将更合理地反映被测组分的保留特点。
第一节 层析的基本原理及分类
2．阻滞因数或比移值Rf
在色谱柱（纸、板）中，溶质的移动速度与流动相的移 动速度之比，称为阻滞因数或比移值Rf，其定义式可写为：
R f 溶 质 （ 流 浓 动 度 相 中 的 心 移 ） 动 的 速 移 度 动 速 度 在 同 溶 一 质 时 （ 间 浓 流 度 动 中 相 心 前 ） 沿 的 的 移 移 动 动 距 距 离 离 ( r ) ( R )
分离度R综合考虑了保留值的差值与峰宽两方面的因素
对柱效率的影响，可衡量色谱柱的总分离效能。
第一节 层析的基本原理及分类
根据分离度R的大小可 以判断被物质在色谱柱中
的分离情况；R值越大，两
色谱峰的距离越远，分离 效果就越好，如图7-5所示。 当R<1时，两峰有部分重叠； 当R = 1时，两峰有98%的 分离；当R = 1.5时，分离 程度可达99.7%；一般用R = 1.5作为相邻两峰完全分 离的标志。
第一节 层析的基本原理及分类
2．固定相的形状
根据固定相或层析装置形状的不同，液相层析法又分纸 层 析 法 ( Paper chromatography)、 薄 层 层 析 法 ( Thin—1ayer chromatography)和柱层析法(Column chromatography)。纸层 析和薄层层析多用于分析目的，而柱层析易于放大，适用于 大量制备分离，是主要的层析分离手段。
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
第七章亲和层析技术概论
• 增加亲和柱的长度来提高吸附率。 • 配基浓度太高使吸附力太强，洗脱
困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
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四、 载体的活化与偶联
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物
活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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• 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （1）配基固定化：配基
与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸
• 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配
困难。 • 理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）、配基偶联的位置
• 配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
• AMP-Sepharose亲和柱 • 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 • 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
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四、 载体的活化与偶联
• 糖类载体的活化与偶联 • 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物
活化与偶联 • 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）、糖类载体活化与偶联
• 溴化氰活化法 • 高碘酸氧化法 • 环氧化法 • 甲苯磺酰氯法 • 双功能试剂法
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• 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
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亲和吸附剂：载体—配基
• 在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
• 与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
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一、亲和层析的原理
• （1）配基固定化：配基
与载体偶联，结合成具有 特异亲和性的分离介质。
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）、配基分子的大小
• 选用大分子配基。
• 甘氨酸
• 小分子物质作为配基， 载体和配基间插入一 个“手臂”以消除空 间障碍。
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（五）、配基的类型
• 较小的有机分子或天然生物活性物质。 • 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配
第7章 亲和层析
2.基质种类
纤维素 聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺－琼脂糖凝胶（ACA,Ultrogel） 交联葡聚糖 琼脂糖 交联琼脂糖 应用最多Sepharose 4B 多孔玻璃珠（CPG，Bio-Glass） 其它新型载体
二、配体（基）(ligand）的选择
1、纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力 2、亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的 条件就要强烈，这样可能使生物分子变性 3、配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生 物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响 配基与生物分子之间的亲和力
第一节 基本原理
欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质 L(配体)以次级键结合，能生成一种可解离 的络合物L—S，其中的L又能与活化的基质M 之间能可逆地结合与解离的原理发 展起来的层析法。
亲和层析的特点：
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大 分子
3、特殊性洗脱
亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载 体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。
实际上特殊性洗脱法也是一种非特异性洗脱方法
六、亲和层析柱的再生
七、应用实例
上样
平衡
洗脱
亲和层析分离GST示意图
3、纯化倍数大，产物纯度高
4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析 条件，因此应用范围受到一定的限制
具有特异性亲和作用的生物分子
抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA) 酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子 激素或药物与其受体
维生素与其特异性结合蛋白
糖蛋白与其相应的植物凝集素
2、专一性洗脱
7 亲和层析
②根据配体的特性进行测定 首先用适当的方法将配体和基质分离开， 首先用适当的方法将配体和基质分离开，然后根据各 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 种配体的特性，用相应的方法测定（在相同的条件下， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照， 用一定量的配体和未活化的基质混合液作标准对照，计 算出配体的含量） 算出配体的含量）
四、特异性吸附
当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时， 当样品加入到已知的具有一定浓度的亲和层析柱时，欲分离的大分子物 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入， 质就会逐步进入层析柱中，和配体结合成复合物；随着样品的加入，复合物 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在， 的浓度越来越大，呈恒定增加。由于配体的存在，使样品中有效成分的移动 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带， 受到阻碍，从而形成紧密的复合物带，由于不同组分与吸附剂的结合能力不 同，所以可得到分离和纯化 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 样品中有效成分在亲和吸附剂上的吸附量，除与它们之间的亲合力有关 亲合力 还与样品的pH值 离子强度和反应时间有关 外，还与样品的 值、离子强度和反应时间有关 例1 图7-6，Sepharose-έ氨基乙酰 色氨酸甲酯亲和层析研究发现 ， 氨基乙酰-D色氨酸甲酯亲和层析研究发现 氨基乙酰 条件下， ①在高pH条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量大 在高 条件下 吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量大 ②在高离子强度条件下，吸附剂对α-胰凝乳蛋白酶的吸附量小 在高离子强度条件下，吸附剂对 胰凝乳蛋白酶的吸附量小 亲和层析柱分离γ-球蛋白时 例2 用Con.A-Sepharose亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应 比3h 亲和层析柱分离 球蛋白时，上样后反应1h比 得率高
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细胞表面特异性蛋白、外源凝集素
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蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原
待纯化的蛋白质
特定单克隆抗体或多 克隆抗体
单克隆抗体
特定抗原
蛋白质A/蛋 白质G
蛋白酶抑制剂
免疫球蛋白 蛋白酶
磷酸
磷酸酶
三嗪染料 脱氢酶、激酶、聚合 酶、限制酶、干扰素
抗生物素蛋白 含生物素的酶
配体 肝素
胆固醇
条件可提高层析的 分辨率
29.05.2020
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三、亲和层析具备的三要素
介质(基质)—具有活化基团
间隔臂— 连接介质与配体的分子
配体— 具有识别能力 反配体（分离物）— 与配体进行可逆结合
29.05.2020
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■ 四、亲和层析法的四要点
配体 Ligand (L)
复合物带
29.05.2020
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样品中有效成分 在亲和吸附剂上的 吸附量，除了与它 们之间的亲和力有 密切关系外，还与 样品的pH值和离子 强度有关系。
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五、层析步骤
样品制备
选择配体
结合步骤 装柱操作
凝胶与配体偶联
流速控制 洗脱方法 淋洗
结合能力的测定
29.05.2020
用溴化氰活化载体
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
29.05.2020
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
偶合反应 (3) Coupling Reaction
(1) Solid Matrix
杂质
29.05.2020
S
(2)
Specific
S
Binding
Substance (S)
S
溶解 Elution
(4)
S
S
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五、亲和层析的特点
条件温和：不影响样品的生物活性，适合生物大 分子的操作。
技术背景
各种大分子物质之间理化特性的差异性。 但如果这种差异性较小，纯化较麻烦，最终收得
率很低。
29.05.2020
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作 第三节 提高吸附剂的操作容量 第四节 应用实例
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第一节 基本原理
M
L
蛋白质2与配体无
S
生物学特异性
1
2
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一、亲和层析的概念
亲和力
根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子 特异识别和可逆结合的特征，将生物分子间的这种结合 能力称为亲和力。
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亲和层析法
利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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*
Elution volume
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五、亲和层析的特点
柱层析柱小 Vt＝1～1.5ml。上样量大,达 1/2Vt体积并对样品的浓度与纯度要求不高。
操作简单，时间快速。 柱子填充载体昂贵，配体的特异性，有时找不
到适宜的配体，不适合所有生物大分子样品。
PriboFast ®黄曲霉毒 素B1免疫 层析亲和柱
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内容提要
第一节 基本原理 第二节 操作 第三节 提高吸附剂的操作容量 第四节 应用实例
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第二节 操作
一、理想基质的性质
二、配基（配体）的选择 优良的配体必须具备两个条件： 配体与生物大分子具有合适的亲和力； 配体具有与载体牢固地结合，又不影响与生
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■ 二、亲和层析法的作用机理
(1) X
B A
Sample
(2)
Washing
A
B
亲和基团 配体
固相载体
X
29.05.2020
脂肪酸
核苷酸
苯基硼酸 盐
凝集素
待纯化的蛋白质
凝聚因子、脂酶、结缔 组织蛋白酶、DNA聚
合酶 胆固醇受体、胆固醇结
合蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋
白 核苷酸结合蛋白、需核
苷酸的酶 糖蛋白
糖蛋白
糖
凝集素、糖苷酶
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三、亲和吸附剂的制备
载体的活化（CNBr）
配体的偶联
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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(3)
Elution
A
B
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29.05.2020
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特异性配体亲和层析法和通用性配体亲和层
析法：
方法
配体
性能
特异性配体亲和 层析法
通用性配体亲和 层析法
复杂的生命大分子 具有较强的吸附选 物质（如抗体、受 择性和较大的结合 体和酶的类似底物 力 等）
简单的小分子物质 成本低廉，具有较 （如金属、染料、 高的吸附容量，通 以及氨基酸等） 柱子再生
29.05.2020
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洗脱方法
29.05.2020
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纯化效率高：一步法分离和纯化混合物中的样品， 提纯达几千倍,得到高纯度样品。
选择性强：依据生物学特异性，而非物理化学性 质分离原理。故特异的层析图为2个峰，第1个为 杂峰，第2峰为纯品。
29.05.2020
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■ 典型的亲和层析操作：
Protein
pH 2.05
Activity