KJWI-QA-27 大肠菌群计数方法作业指导书
大肠菌群计数方法作业指导书
文件制修订记录1.0目的规定大肠杆菌计数的方法。
2.0适用范围适用于凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。
3.0术语3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。
3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0职责4.1质检部：负责按此方法对来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠菌群进行计数。
5.0流程图见附录A、附录B。
6.0内容及要求6.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃6.1.2冰箱：2℃-5℃6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃6.1.4天平：感量0.1g6.1.5振荡器6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml6.1.8无菌试管：18×200ml6.1.9小导管6.1.10无菌培养皿：直径90mm6.1.11菌落计数器6.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.775%乙醇溶液6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。
b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
总大肠菌的测定实验作业指导书
作业指导书 页码：第 1页，共11页 文件编号：JLQX-03-022 版次：2022版，第0次修订 文件名称：水中总大肠菌群的测定 发布日期：2022 年1 月1 日水中总大肠菌群的测定1、方法依据水质 水中总大肠菌群的测定 多管发酵法2、合用范围总大肠菌群是指那些能在37℃48h之内发酵乳糖产酸气的、需氧及碱性厌氧的革兰式阴性的无芽胞杆菌。
主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。
总大肠菌群的检验方法中，多管发酵法可合用于各种水样（包括底泥），但操作较繁，需要时间较长；滤膜法主要是用于杂质较少的水样，操作简单快速。
如果是使用滤膜法，则总大肠菌群可重新定义为：所有能在含乳糖的远腾氏培养基上，于37℃24h之内生长出带有金属光泽暗色菌落的、需氧的和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
粪便中存在有大量的大肠菌群细菌，在水体中存活的时间和对氯的反抗力等于常道致病菌，如沙门氏菌、志贺氏菌等相似，因此将总大肠菌群作为水体受粪便污染的指示菌是合适的。
但在某些水质条件下，大肠菌群细菌在水中能自行繁殖，这是不利之处。
作业指导书 页码：第2页，共11页 文件编号：JLQX-03-022 版次：2022版，第0次修订 文件名称：水中总大肠菌群的测定 发布日期：2022 年1 月1 日3、测定原理3.1水中总大肠菌群的测定多管发酵是根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性、无芽孢、呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验，以求得水样中的总大肠菌群数。
多管发酵法是以最可能数简称MPN来表示实验结果的。
实际上它是根据统计学理论，估计水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种方法。
如果从理论上考虑，并且进行大量的重复检定，可以发现这种估计有大于实际数字的倾向。
无非只决于那些既显示阳性有显示阴性的稀释度试管重复数目增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，大部份取决于那些即显示阳性又显示阴性的稀释度。
大肠菌群检验作业指导书 (1)
有限公司生效日期：2014.01.01页码：第1页，共2页1 目的规定大肠菌群的检验方法，以按标准化进行操作。
2 适用范围适用于大肠菌群检验。
3 术语大肠菌群：在37℃、24h能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌,它主要来源于人畜粪便,通常可作为水体粪便污染的指标菌。
4 职责质检员负责按作业指导书进行检验。
5 流程图无6 作业内容6.1 设备和材料净化工作台、培养箱（36±1℃）、新飞展示柜（0-10℃）、刻度吸管（10mL）、试管（18×200mm）、酒精灯、镊子、放大镜、培养皿、三角瓶（500mL）、显微镜等、40孔口的试管架、洗耳球等实验器材6.2 培养基和试剂75%酒精、生理盐水（0.9%）、乳糖胆盐发酵管、乳糖发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液等培养基及试剂。
6.3 操作步骤6.3.1 样品处理一般情况下，产品没有受到污染，按照以下方法检验：取待检样品10mL接种于含10mL双料乳糖胆盐发酵管内,接种5管，置于36±1℃生化培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产酸产气，可报告为大肠菌群阴性，如有产酸产气者，按下列程序进行。
6.3.2 分离培养从产酸产气的发酵管中用接种环挑取样液，划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃生化培养箱内，培养18-24h。
取出观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。
6.3.3 证实试验有限公司生效日期：2014.01.01页码：第2页，共2页用接种环挑取疑似大肠菌群菌落（菌落呈黑紫色，表面有金属光泽），接种于乳糖发酵管内，置36±1℃生化培养箱内培养24±2h。
同时对上述可疑菌落进行革兰氏染色、镜检。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
6.3.4 MPN值计算及报告结果根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL样品中大肠菌群的最可能数。
014大肠菌群计数作业指导书
陕西威水饮品有限公司质量管理文件1目的：规定了公司产品检验大肠菌群（Coliforms）的计数方法.2适用范围：适用于本公司成品中大肠菌群的计数。
3编写依据：GB4789.3-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》. 4术语和定义:4.1 大肠菌群coliforms在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰阴性无芽胞杆菌。
4.2 最可能数most probable number，MPN基于泊松分布的一种间接计数方法。
5.设备和材料：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：5.1 恒温培养箱：36℃±1℃5.2 冰箱：2℃～5℃5.3 恒温水浴箱：46℃±1℃5.4 天平：感量0.1g5.5 均质器5.6 振荡器5.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL 刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头5.8 无菌锥形瓶：容量500 mL5.9 无菌培养皿：直径90 mm5.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸5.11 菌落计数器6.培养基和试剂：6.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1 6.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2 6.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.36.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.46.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.56.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.66.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7第一法大肠菌群MPN 计数法7检验程序：大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。
图1 大肠菌群MPN计数法检验程序8操作步骤：8.1 样品的稀释8.1.1 固体和半固体样品：称取25g样品,放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000r/min～10000r/min 均质1min～2 min,或放入盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。
肉制品中大肠菌群的检验—第二法大肠菌群平板计数法
平 板
无菌磷酸盐缓冲液
计
数
无菌生理盐水
法
1mol/LNaOH 溶液
1mol/LHCl溶液
四、大肠菌群平板计数检样程序
选择15~150平板计数 典型和可疑菌落
36℃±1℃培 养18h~24h
典型菌落为紫红色 周围有红色胆盐沉 淀环，直径为0.5mm
挑选10个典型菌 落接种到BGLB
五、大肠菌群平板计数检样操作步骤
大肠菌群平板计数法
目录页
样品的采集和处理 设备和材料 培养基和试剂
大肠菌群平板计数检样程序 大肠菌群平板计数检样操作步骤
一、样品的采集和处理
大
1. 样品的采样原则和采样方案
肠
菌 群
样品的采样原则和采样方案和大肠菌群MPN计数法一样，都
平 板
按照国家食品微生物学检验总则GB4789.1—2016中的相关规定
计 数
去实施。
法
2. 样品的采集和处理
样品的采集和处理方式与大肠菌群MPN计数法一样，都按
照国家食品微生物学检验肉与肉制品检验GB/T 4789.17—2003
中的相关规定去实施。
二、设备和材料
备和材
菌
群
料如下：
平
板 计
➢ 恒温培养箱、恒温水浴箱、 均质器、振荡器、无菌
数 法
吸管或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶、天平、菌落
计数器、无菌培养皿、菌落计数器、pH 计或pH 比
色管或精密pH 试纸等。
三、培养基和试剂
大 肠
煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉汤
菌 群
结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,VRBA)
大肠菌群检测(平板计数法)
平板菌落数的选择
选择菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
什么样的菌落必须要做证实试验
一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。 另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本
36℃±1 ℃ 18h ~24h
挑选10个菌落分别 接种到BGLB
VRBA琼脂
配方(g/L): 蛋白胨:7.0; 酵母粉:3.0;乳糖:10.0;3号胆盐:1.5;中性红:0.03;结晶紫:0.002;氯化 钠:5.0; 琼脂:15.0;pH 7.4±0.1,25℃ 其中蛋白胨提供氮源；酵母粉提供生长促进因子和Ｂ族维生素；乳糖提供碳源， 大肠菌群发酵乳糖，产生酸性物质；３号胆盐是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏 阳性菌；结晶紫也是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏阳性菌和一部分革兰氏阴性 菌；中性红是一种指示剂，在酸性条件显红色，碱性条件下显无色。氯化钠维持 细菌生长时的渗透压。琼脂是一种凝固剂。
10倍系列稀释
选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板
36℃±1℃
18~24h
计数典型和可疑菌落
注：VRBA(结晶紫中性红胆盐 琼脂)又称为：VRB或VRBL
BGh
报告结果
平板计数法操作
菌落数在15-150之 间的平板,计数典型
和可疑菌落
典型菌落为紫红色周围有 红色胆盐沉淀环，0.5mm
来大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使 得不能分解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落，所以需要进行 证实实验。
结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘 以稀释倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。
大肠菌群计数
原标准
01
初发酵
02
EMB分离培养
03
染色，复发酵
04
报 告
05
现标准
06
LST初发酵
07
BGLB验证
08
报 告
09
检样
稀释
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST）36±１℃，24~48±2h
不产气
产气
煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 36±１℃，24~48±2h
不产气
产气
大肠菌群阴性
大肠菌群阳性
计数红色带气泡菌落
报告结果
36℃±1℃
24±2h
大肠菌群PetrifilmTM 测试片检验程序
操作要点
按第一法的样品制备方法进行。 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，pH值过低或过高时分别用1M NaOH或1M HCl予以调节。 合理稀释度的选择，每稀释度接种2张测试片。 接种时避免气泡产生。 培养基未凝固时勿挪动。 将测试片的透明面朝上置于培养箱内，堆叠片数不超过20片。
MPN
阳性管数
1g(mL)检样中最大可能数（MPN）表
使用MPN检索表的注意点
这个MPN检索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北欧等标准通用的。 表里的数字是有小数点的。 报告单位不同。现报告单位为g/ml，而原报告单位是100g/ml。 原标准MPN表有64个组合，而现标准选择
选择菌落数在30~150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
证实试验
从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，进行证实试验。 BGLB肉汤管产气者，所对应的菌落即为大肠菌群阳性菌落。
微生物作业指导书
一．适用范围：本方法引用GB/T4789-2003，适用于成品大肠菌群/生菌数检验/人员涂抹大肠菌群及生菌数检验二．检验规范：1）样品制备和稀释以无菌操作取25g样品放入装有225ml无菌生理盐水的广口瓶内，振摇均匀，制成1：10的样品匀液。
用1ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液1ml，注入含9ml无菌生理盐水的的螺旋盖试管中，振摇，制成1：100的样品匀液。
2）平板菌落计数A：取1ml灭菌吸管，吸取1：10稀释样品匀液1ml，分别接种两个已经编号的灭菌平皿内，再以同一吸管吸1：100样品匀液1ml，分别接种两个异外编号的灭菌平皿内。
B：分别加12-15ml营养琼脂培养基（已放45±1℃的水浴中恒温）到各平皿内，立即将平皿内的样品液和琼脂培养基充分混合。
混合方法是将平皿倾斜和旋转。
要防止把混合物溅到平皿壁和盖上，同时将另一平皿加入1ml生理盐水和营养琼脂12-15ml混合，作空白对照试验。
将样品液加入平皿后应立即倾注琼脂培养基，每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过20min。
C：待琼脂凝固后，倒置平板，在36±1℃恒温培养箱内培养24±2h。
D：菌落计数和结果的报告方法a) 若为一种稀释倍数时，则以该稀释倍数的两个平皿的菌落数平均值乘以稀释倍数Ａ1＋Ａ2 Ａ：稀释倍数─────×Ａ２Ａ1、Ａ2：培养皿菌落数b) 若有两种稀释倍数时，则依下列公式计之，记录生菌数时应将第三位数字四舍五入Ａ1＋Ａ2 Ｂ1＋Ｂ2─────×Ａ＋─────×Ｂ２２─────────────────２Ａ、Ｂ：稀释倍数Ａ1、Ａ2、Ｂ1、Ｂ2：稀释倍数之菌落数3）大肠菌群检验A：用1ml灭菌吸管分别吸取1：10稀释的样品匀液，接种两个灭菌平皿，每皿1ml。
另取1ml灭菌生理盐水加入一个灭菌平皿作空白对照。
B：将冷却至45±1℃的去氧胆酸盐琼脂培养基10-15ml倾注到每个平皿中，小心旋转平皿，将培养基与样液充分混合。
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食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法文件修改记录版本修订次数修订日期修订内容0 0 2011-02-14A 1 2012-05-25 修订食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法分发号 : ______(仅适用于控制文件)(仅盖有红色印章的文件才有效)1.0目的规定大肠杆菌计数的方法。
2.0适用范围适用于加多宝凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。
3.0术语3.1大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。
3.2MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。
4.0职责4.1质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠菌群进行计数。
5.0流程图见附录A、附录B。
6.0内容及要求6.1设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下：6.1.1恒温培养箱：36℃±1℃6.1.2冰箱：2℃-5℃6.1.3恒温水浴箱：46℃±1℃6.1.4天平：感量0.1g6.1.5振荡器6.1.6无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。
6.1.7无菌锥形瓶：容量500ml6.1.8无菌试管：18×200ml食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法6.1.9小导管6.1.10无菌培养皿：直径90mm6.1.11菌落计数器6.2培养基和试剂6.2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤6.2.2煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤6.2.3乳糖胆盐发酵培养基（LBB）6.2.4乳糖蛋白胨培养基（LPB）6.2.5伊红美蓝琼脂培养基（EMB）6.2.6结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）6.2.775%乙醇溶液6.2.8无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min6.3大肠菌群MPN计数法6.3.1加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定6.3.1.1样品稀释a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。
b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
c、用1ml无菌吸管吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1：100的样品匀液。
d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。
注意每递增稀释依次，换用一次1ml灭菌吸管。
从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min6.3.1.2初发酵试验a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。
食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法b、将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48±2h。
记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。
未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。
6.3.1.3复发酵试验用接种环从所有48±2h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。
产气者，计为大肠菌群阳性管。
6.3.1.4大肠菌群最可能数（MPN）的报告根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C），报告每克（或每毫升）样品大肠菌群的MPN值。
6.3.2工艺水等水样中大肠菌群的测定6.3.2.1推测性试验a、取待检样品10ml，接种到10ml双料的乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品10ml、1ml、0.1ml（取样品1ml于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液1ml），分别接种于含10ml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，各接种5管。
b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种1ml、0.1ml、0.01ml甚至0.1ml、0.01ml、0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。
接种1ml一下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌刻度吸管。
c、将以上接种好的试管置于36±1℃培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管或乳糖蛋白胨发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
6.3.2.2确证性试验6.3.2.2.1方法一a、分离培养将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃升华培养箱内，培养18-24h取出。
观察菌落形态，用接种换挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。
食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法①菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽；②紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落；③淡紫红色、中心较深的菌落。
b、证实试验经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于36±1℃升华培养箱培养24±2h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。
6.3.2.2.2方法二自推测性检验阳性管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤中，置于36±1℃培养箱内培养48h。
观察BGLG管中的产气情况，如有气味产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无则为大擦汗那个菌群阴性。
6.3.2.3结果报告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，可得出水样中大肠菌群的MPN 值。
5管法见附录E。
稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。
如所有乳糖胆盐发酵管均为阴性时，可报告大肠菌群未检出。
6.4大肠菌群平板计数法6.4.1样品稀释按6.3.1.1执行6.4.2平板计数6.4.2.1选取1-3个适宜的稀释度（液体样品可以选用原液）接种两个无菌平皿，每皿1ml，同时分别取1ml无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。
6.4.2.2及时将冷却至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20ml倾注于每个平皿中。
小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）覆盖平板表层。
翻转平板，置于36±1℃培养箱内培养18-24h。
6.4.2.3选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑的大肠菌群菌落。
典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落至今岗位0.55mm或更大。
6.4.3证实试验食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养箱内培养24-48h，观察产气情况。
凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。
6.4.4平板计数法的报告经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以6.2.2.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克（或每毫升）样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液1ml，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×（6/10）×10-4 g/ml = 6.0×10 CFU/g （CFU/ml）7.0质量记录7.1 KJWIF-QA-34 《成品检测记录》食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法附录A大肠菌群MPN计数检验程序食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法检样25g（25ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择适宜三个连续稀释度的样品匀液，接种LST肉汤管36℃±1℃ 48h±2h不产气产气BGLB肉汤36℃±1℃ 48h±2h不产气产气大肠菌群阴性大肠菌群阳性查ＭＰＮ表报告结果附录Ｂ大肠菌群平板计数检验程序食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法检样25g（25ml）样品+225ml稀释液，均质１０倍系列稀释选择2——3个适宜稀释度的样品匀液，接种VRBA平板36℃±1℃ 18—24h计数典型和可疑菌落BGLB肉汤或复发酵试验36℃±1℃ 24—48h报告结果食品有限公司版本:A/1日期:2012-05-25页数: Page 1 of 12标题：大肠菌群计数方法附录C大肠菌群最可能数（MPN）检索表每克（或每毫升）检样中大肠菌群最可能数（MPN）的检索见下表：阳性管数MPN 95%可信限阳性管数MPN95%可信限0.1 0.01 0.001 下限上限0.1 0.01 0.001 下限上限0 0 0 <3.0 —9.5 2 2 0 21 4.5 42 0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94 0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94 0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94 0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 940 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 941 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110 1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180 1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 ？9 180 1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200 1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420 1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420 1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 4201 3 0 16 4.5 423 2 1 150 37 4202 0 0 9.2 1.4 383 2 2 210 40 430 2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000 2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000 2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000 2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100 2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 —注1：本表采用3个稀释度［0.1g（或0.1ml）、0.01g（或0.01ml）和0.001g（或0.001ml）］，每个稀释度接种3管。