食品微生物综合实训-酸奶生产中微生物检验与控制

酸奶生产系统中微生物检验点及评价标准

（以酸奶生产为例）

3.1产品生产工艺描述

酸奶是以新鲜的牛奶为原料经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。按照是否加糖，酸奶可分为淡酸奶和加糖酸奶两种，我国常见的酸奶制品是加糖酸奶，即在制作酸奶的原料乳中加入一定量的白糖进行发酵得到的酸奶产品。

酸奶营养丰富，其蛋白质和钙质较鲜乳更易消化吸收，抑制腐败细菌的繁殖，降低肠道内毒素浓度。酸奶内含乳酸菌并在发酵过程中产生乳酸及族维生素等,能增强消化，促进肠道蠕动和机体物质的代谢，提高人的免疫力, 长期饮用即可保证钙质的需求, 又可健肠胃, 是一种对人体肠胃非常有益的保健食品。

3.1.1 酸奶的生产工艺

1）凝固型酸奶生产工艺流程

原料奶验收→标准化→均质→杀菌→冷却→接种→搅拌→灌装封口→发酵→冷却→后熟→凝固型酸乳

2）搅拌型酸奶生产工艺流程

原料奶验收→标准化→均质→杀菌→冷却→发酵→搅拌→灌装封口→冷藏后熟→搅拌型酸乳

↑ 果料、香精

前者先冷却，分装后培养发酵。后者先冷却接种，发酵后分装。

凝固型酸乳用于纯酸奶的生产，搅拌型酸乳还可用于果味、果料等花色品种酸奶的生产。一般凝固型纯酸奶要有良好的组织状态，要防止有裂纹出现，因此要先搅拌分装再发酵。带有果料的酸奶影响乳酸菌的发酵，不能保持良好的组织状态，故采用先发酵后搅拌加果料的方式。

3.1.2 操作要点

1）原辅料验收

（1）原料乳验收

原料奶必须符合GB19301 — 2010《食品安全标准生乳》规定的各项要求，严格进行感官、理化、微生物等指标的检验，验收原料奶单位必须具备《生鲜乳收购许可证》，每批原料验收包括：感官、酒精、密度、脂肪、蛋白质、冰点、非脂乳固体、抗生素以及掺假检测。定期监测致病菌、重金属、黄曲霉等指标。

（2）净乳

收购站对验收合格的生乳用180 目双联过滤器可去除生乳中的细小污物，操作简单方便。

（3）冷藏

若不能及时加工，采用板式换热器将过滤后的牛乳冷至2 ～4℃，泵入储奶罐暂存，但不得超过2 4 h 。

（4）辅料验收

根据相应标准对辅料进行验收，验收项目可包括：感官、生产日期、保质期、查验供方检验报告、生产许可标识、微生物等指标。

2）配料

选择符合质量标准的各种原辅料如牛乳、乳粉、砂糖和稳定剂等。称料、拌料、配料必须准确计量，与原料搅拌均匀，实现温度和时间的良好控制。

乳粉、砂糖混合后加50～60℃温水溶解。琼脂、明胶等稳定剂可与少量糖混合，加水、加热充分溶解后添加。

2）均质

均质的目的是防止脂肪上浮使脂肪微粒化改善口感。一般采用高压均质机，均质工艺条件：均质前应先将混合料预热至50～60℃，均质压力为9.8124.5MPa.

3）杀菌、冷却

杀菌的目的：①除去原料乳中的氧，降低氧化还原反应，能够明显促进乳酸菌的生长。②由于蛋白质的变性改善了牛乳的硬度与组织状态，能够有效防止乳清分离。

杀菌及冷却的条件：杀菌条件90℃、15min。经杀菌后的混合料冷却到40～45℃备用。还可以采用高温瞬时杀菌，即135～140℃加热2～3秒左右。这样有利于营养成分的保存，又减少了煮沸气味。

4）乳酸菌发酵剂的制备

①酸奶常用的乳酸菌发酵剂常将菌种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合用作发酵剂，二者的菌株配比为2:1～1:1。

②发酵剂的制备首先将购买的发酵剂或保藏的菌种活化，制成母发酵剂，检验合格后，将母发酵剂放大培养，制作中间发酵剂，检验合格后，进一步放大培养制成工作发酵剂。

③工艺条件及接种量选用处于对数期的种子液接种，一般接种量为2.0～3.0%。主发酵温度为42～45℃，时间为2.5～3.5h。

通常，低产酸力的发酵剂接种量要多，高产酸力的发酵剂接种量要少。一般低接种量按0.5～1.0%，高接种量按5.0%以上，最适接种量为2.0～3.0%。主发酵温度采用42～45℃，这是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合后的最适生长温度。生产中，我们要注意控制好三个因素：接种量、发酵剂活性和培养温度。

5）发酵条件的控制

灌装或分装完成后，应迅速入发酵室发酵，在42～43℃条件下发酵2.5～4h，以奶液达到凝固状态为准。此时酸度0.7～0.8，pH低于4.6。此时，需迅速转移至2～6℃的冷库

中存放12h防止过酸，促进芳香物质产生，并增加制品的粘稠度。

6）发酵终点的判断

酸奶发酵时，指示终点的条件是组织状态为凝固状态，没有过多乳清分离现象。

7）冷却灌装

发酵好的酸奶通过冷却系统将产品冷却至25℃以下，组织状态正常即可进行灌装。果料、花瓣酸奶可在灌装前加入果料、果汁或花瓣。

灌装前要对灌装机、输送带清洗杀菌、包装材料必须卫生无污染。灌装过程中要防止交叉污染，确保灌装过程卫生。

8）冷藏与后熟

在2～6℃冷藏，48～72h 产品后熟后即可销售。

3.2产品生产系统中微生物检验点及评价标准

3.2.1原料奶验收的微生物检测

1）收购原料奶中菌落总数的检测

根据发达国家的调查，一般鲜奶中不可避免的细菌数是102～103cfu/mL；在极其严格的无菌操作下，用机器挤出的奶的细菌总数为104cfu/mL，对鲜奶的影响较小；但原料奶受到污染，细菌总数达到106～107cfu/mL时，鲜奶就会出现令人觉察或检出的缺陷。这是导致奶产品变质的直接原因。

变质产品表现为产酸、产气、变粘或同时产酸产气、蛋白热稳定性下降或呈粥样，带苦味、严重异味，不论对消费者的健康还是产品的市场形象都是危害最大的。同时，细菌总数高，其中的致病菌可产生非常耐热的毒素，这些毒素经超高温处理后仍有少量残留，消费者饮用后，会导致中毒。大量细菌繁殖会加速产酸，从而引起原料奶酸度增加，蛋白质热稳定性下降。国外对原料奶细菌总数卫生指标控制十分严格，荷兰鲜奶的收购标准中要求细菌总数小于2.5×105cfu/mL；在瑞士细菌总数超过105cfu/mL将被降低奶款，甚至拒付奶款；欧共体1993年规定液态奶制品的原料奶细菌总数不能超过105cfu/mL。因此，在酸奶生产中，原料乳中微生物总数的测定对产品的质量控制尤为重要。

本文参照GB设计了原料奶中菌落总数的检测方法。

（1）实训目的

掌握原料奶中菌落总数的检测方法；

熟悉原料奶验收时微生物的指标的检测与控制。

（2）实训器材

高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、平皿、无菌刀、三角瓶、大试管、吸量管、酒精灯

（3）实训步骤

①培养基制备营养琼脂培养基配方：牛肉膏1g、酵母膏2g、蛋白胨5g、NaCL5g，加水定容至1000ml，调PH为7.4。分装后按照1.5～1.8%的添加量加入琼脂粉，配成固

体培养基，于121℃高压灭菌20min。

②样品采集与预处理

a.样品采集以无菌刀、勺取样，采取不同部位具有代表性的检样，放入灭菌容器内，立即送检，如条件不许可时，最好不超过4h，送检样时应注意冷藏。

b.样品的预处理无菌条件下打开采样容器的瓶口，将样品充分混匀，且瓶口经火焰灭菌后，称取25g（或吸取25ml）检样，放入装有225ml灭菌生理盐水的三角瓶内，振摇混匀，得10-1的样品稀释液。再按照图3-1所示进行梯度稀释，分别制得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的样品稀释液。

图3-1 样品梯度稀释液的制备

③倾注平板根据原料奶的污染情况，分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀释梯度的样品稀释液各1mL，加到已灭菌的平皿中，再将融化后已经冷却至45℃左右但尚未冷凝的固体培养基倾注入平皿，然后迅速转动平皿，将培养基和菌液混合均匀。

④菌落计数待倾注好的平板完全凝固后，倒置，于30～35℃培养箱中培养72±2h。培养完成后，取出培养皿，肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的菌落数。以菌落形成单位（colony forming units，CFU）表示。选取菌落数在10 CFU～150 CFU 的平板，作为有效梯度的记录数，当菌落蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用三个平板的平均数。

（4）实训结果与报告

计算三个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数的计算结果。

若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。

菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。菌落数大于或等于100时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，后面用0代替位数来表示结果；也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。

（5）实训注意事项

①营养琼脂固体培养基一般按照1.5%的添加量加入琼脂粉，若在夏天或环境温度较高时也可适当增加至1.8%。若用琼脂条代替琼脂粉，一定要将琼脂条充分融溶后再分装，否则，琼脂分散不均匀将影响菌体生长以及菌落分布。

②样品梯度稀释时，要用0.85%的生理盐水或者PBS缓冲液进行稀释，若用无菌水代替，易使菌体细胞渗透压急速下降而造成细胞破裂，使计数结果偏低。

③倾注平板时，一定要等熔融的培养基温度降至45℃以下（不烫手）时，方可倾注，

否则，培养基温度过高易将菌体热致死，也将使计数结果偏低。

④倾注平板后要迅速转动平板，在培养基凝固前趁机将菌液和培养基充分混匀，否则，菌落生长成片，影响计数结果的准确性。

⑤计数时，平板上的大小菌落均要计算在内。

2）原料奶中的芽孢总数及耐热芽孢总数

原料奶中通常既含有细菌的营养细胞，也含细菌的芽孢。形成芽孢的有芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌、芽孢乳杆菌、脱硫胎状菌和芽孢八叠球菌5个属。原料奶中常见的芽孢杆菌属有：枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等。它们的适宜生长温度为20℃～40℃，最高生长温度可达55℃。这类细菌广泛存在于牛舍和饲料中，其芽孢体对热和干燥具有较强的抵抗力。

原料奶中芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌和嗜冷菌等细菌所产生的芽孢在超高温灭菌后仍能存活，并导致产品腐败，所以，虽然国标并未将芽孢总数检测规定为必检项目，它却是酸奶生产企业在原料奶验收时严格保障产品质量的一项重要检测项目。

将原料奶在80℃条件下加热10min, 可杀死绝大多数微生物的营养细胞, 仅有少数耐热细菌的芽孢存活。使用热处理的原料奶直接作细菌总数的测定就可测出原料奶的芽胞总数。

（1）实训目的

掌握原料奶中芽孢及耐热芽孢总数的检测方法；

明确原料奶中芽孢及耐热芽孢总数检验的意义。

（2）实训器材

高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、平皿、无菌刀、三角瓶、大试管、吸量管、酒精灯、恒温水浴锅、稳定计

（3）实训步骤

①培养基制备营养琼脂培养基配方：牛肉膏1g、酵母膏2g、蛋白胨5g、NaCL5g，加水定容至1000ml，调PH为7.4。分装后按照2%的添加量加入琼脂粉，配成固体培养基，于121℃高压灭菌20min。

②芽孢总数测定

a.以无菌刀、勺取样，采取不同部位具有代表性的检样，放入灭菌容器内，立即送检。

b.用10ml灭菌吸管吸取5ml奶样加入灭菌试管中。在另一支试管加入与奶样等量的水。在装水的试管中插一支温度计。

c.将装有奶样和水的试管同时放入热水中（在电炉上用白瓷缸把水煮至有小气泡时）。直至“装水试管”的温度达到80℃，计时10分钟。

d.10分钟后，取出试管，用冷水冲，使含奶样的试管冷却。用1ml灭菌吸管分别吸1ml冷却后的奶样于两个灭菌平皿中。

e.及时将冷却至46℃的营养琼脂注入平皿约15ml，并转动平皿使之混匀；同时将营养琼脂分别注入加有1ml灭菌生理盐水的平皿和另一个灭菌的空白平皿内，做空白对照。

f.待营养琼脂凝固后，翻转平板。置于36±1℃的培养箱内培养72±2h，取出计数。

③耐热芽孢总数测定

a.用10ml灭菌吸管吸取5ml奶样加入灭菌试管中。在另一支试管加入与奶样等量的水，在装水的试管中插一支温度计。

b.将装有奶样和水的试管同时放入沸水浴中（在电炉上用白瓷缸把水煮沸，并保持沸腾）。直至“装水试管”的温度达到100℃，计时10分钟。

c.10分钟后，取出试管，用冷水冲，使含奶样的试管冷却。用1ml灭菌吸管分别吸1ml冷却后的奶样于两个灭菌平皿中。

d.及时将冷却至46℃的营养琼脂注入平皿约15ml，并转动平皿使之混匀将营；同时将营养琼脂分别注入加有1ml灭菌生理盐水的平皿和另一个灭菌的空白平皿内，做空白对照。

e.待营养琼脂凝固后，翻转平板。置于55±1℃的培养箱内培养48～72h，取出计数。

（4）实训结果与报告

计算三个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。

若所有平板上菌落数均大于150 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。若所有平板上菌落数均小于10 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；如为原液，则以小于1计数。

（5）实训注意事项

①若用琼脂条代替琼脂粉，一定要将琼脂条充分融溶后再分装，否则，琼脂分散不均匀将影响菌体生长以及菌落分布。

②耐热芽孢总数测定时，样品需在沸水浴中达到100℃，如果水不到100℃就沸腾，则等候时间需延长；或在水中加入盐以提供高沸点温度，但要避免奶样沸腾。

③倾注平板时，培养基温度也不宜过低，否则培养基凝固太快，菌体不易分散均匀，使长出的菌落不能均匀散开。

④倾注平板后要迅速转动平板，在培养基凝固前趁机将菌液和培养基充分混匀，否则，菌落生长成片，影响计数结果的准确性。

3.2.2发酵剂活力的测定

1）以产酸率确定发酵剂活力

向灭菌脱脂乳中加3%发酵剂，在适宜温度下（42℃）培养3.5小时，滴定其酸度。以乳酸酸度值来表示发酵剂活力。

称取10 g（精确到0.001 g）已混匀的试样，置于150 mL锥形瓶中，加20 mL新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液电位滴定至pH 8.3为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0 mL酚酞指示液，混匀后用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并在30 s 内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入下面公式中进行计算。

试样中的酸度数值以（o T）表示，按下式计算：

c ×V ×100

X = ——————————×0.009

m ×0.1

式中：

X——试样的酸度，单位为度（o T）；

c——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；

V——滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）。

0.009——相当于乳酸（90%）的量

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

并非活力越强发酵剂质量越好，酸度应控制在0.65～1.15范围内，其中0.8～0.95最佳，发酵剂活力与最佳接种量的关系可参考如下参数：

活力大于0.9时，接种量2.0-2.5%

活力在0.8-0.9时，接种量3.0-3.5%

活力在0.7-0.8时，接种量3.5-4.0%

活力在0.6-0.7时，接种量5.0%

活力小于0.6的发酵剂不适于在酸奶生产中使用。

2）刃天青还原法

将1毫升发酵剂加入9毫升灭菌脱脂乳中，并加0.005%刃天青溶液1毫长，36.7℃

保温30分钟后开始检查，其后每5分钟观察一次结果，淡粉红色为终点。活力好的发酵剂应在35分钟内还原丸天青。50~60分钟还原的发酵剂不宜使用，对照的不含发酵剂空

白灭菌脱脂乳的还原时间不应少于4小时。

3）以凝乳时间判断发酵剂活力

称取一定量的脱脂乳粉，配制成12%的复原乳，然后蒸煮15min，或者118℃、15min 进行高压灭菌处理。复原乳冷却至接种温度后，按照2%的接种量接入待测发酵剂，混合后在待测菌种的最适温度下进行培养，观察并记录凝乳时间。凝乳时间越长，表明发酵剂的活力越差，凝乳越快，表明发酵剂活力越强。酸奶生产监测中，性能优良的发酵剂按照一定的接种量，凝乳时间一般控制在2.5～3h，可据此判断新的一批发酵剂的活力是否能够达到实际投产的要求。

该法简便易行，不需试剂与繁琐的检测设备，也不破坏样品的组织结构，但需要连续观察，较费时，且有一定的主观差异性。

3.2.3 发酵剂纯度的测定

（1）实训目的

熟练掌握镜检法简单快速地判断酸奶发酵剂的纯度；

进一步熟悉革兰氏染色的操作过程及显微镜的使用。

（2）实训器材

高压灭菌锅、超净工作台、显微镜、载玻片、盖玻片、接种针、滴瓶（带胶头滴管）、三角瓶、棉塞、滴管、大试管

（3）实训步骤

①种子发酵剂的采样与预处理以无菌勺取样，采取不同部位具有代表性的检样，无菌条件下将样品充分混匀，且瓶口经火焰灭菌后，称取10g（或吸取10ml）检样，放入装有90ml灭菌生理盐水的三角瓶内，振摇混匀，得10-1的样品稀释液。

②样品的革兰氏染色

a. 涂片用移液枪吸取10ul已稀释好的样品液滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

b. 干燥与固定将涂布样品面向上，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发

完全后，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3 次，共约2-3 秒种，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

c. 初染在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2 滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min 后，水洗去除表面的结晶紫，至洗下的水呈无色为止。

d. 媒染用移液枪吸取约300ul 碘液滴在涂片薄膜上，使染色液覆盖涂片，染色约1min后，再次水洗。

e. 脱色斜置载玻片，滴加95%乙醇脱色，至流出的乙醇不现紫色为止，大约需时20-30S，随即水洗。

f. 复染在涂片薄膜上滴加番红染液1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min后水洗至洗下的水呈无色。

③镜检取制好的玻片用吸水纸吸掉水滴，将载玻片晾干或吹干后置显微镜下观察，先用低倍镜观察，确定染色区及目标视野后滴一滴香柏油在玻片上，再用油镜观察细菌的颜色及细胞形态。

（4）实训结果与报告

酸奶发酵剂中正常的乳酸菌是革兰氏阳性菌，镜检为紫色，呈球状或杆状，若有其他形态的菌株，可疑似为污染的杂菌，需进一步鉴定，方可投产。

（5）实训注意事项

①涂片时，不宜取样过多，且不可涂布面积过大，否则，菌样过于分散，不易观察。

②将菌样蒸干与固定时，切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形，影响菌体形态的观察与判断。

③脱色时间不宜过长，否则可能使菌体脱色过度，镜检时看不到明显的紫色菌体。

3.2.4 成品的微生物指标检测

1）乳酸菌活菌计数

酸奶中乳酸菌的含量是评价产品对人体营养与健康作用的重要指标，新的酸奶国家标准中（GB/T4789.35-2003）规定市售酸奶中的乳酸菌活菌数不得低于1×106cfu/mL。作为保健食品的酸奶，应突出乳酸菌并保持一定的活菌数，若成品中乳酸菌活菌数较少，则达不到酸奶制品应有的功效。由于酸奶中乳酸菌活菌的数量直接影响着产品的质量，所有乳酸菌活菌计数成为判断产品是否合格的重要指标，也是生产中成品检验必不可少的一项。

乳酸菌的活菌计数：采用MRS培养基倾注培养法，于42℃厌氧条件下培养2-3d后计数。

（1）实训目的

掌握酸奶中乳酸菌活菌数的检测方法；

了解酸奶中乳酸菌活菌数测定的意义。

（2）实训器材

高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、干燥箱、平皿、无菌刀、三角瓶、大试管、吸量管、酒精灯

（3）实训步骤

①培养基制备MRS培养基配方：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.2g、吐温801mL，加水定容至1000ml，PH自然。分装后按照2%的添加量加入琼脂粉，配成固体培养基，于121℃高压灭菌20min。

②样品预处理