微生物学实验指导书

实验一土壤中微生物的分离

一、实验目的：

1、使学生熟悉土壤中微生物种类。

2、学会用稀释平板技术确定土壤样本中的细菌和真菌的数目。

二、实验原理：

土壤中含有大量的微生物，包括、真菌、原生动物、藻类和病毒。尽管有如此多样性，细菌，包括霉菌样防线菌和真菌乃是最占优势的。

必须记住，土壤环境随地点不同而不相同；同一地点，不同时期的土壤环境也不一样。这样，像湿度、PH值、温度、氧气含量、土壤中有机和无机组成在确定特定样本的特定微生物中将是决定性的。

就像土壤不同一样，用于分析土壤的微生物学方法也不同。一个单一的技术是不能用来对所给的土壤样本中不同类型的微生物进行分离计数的。本实验中确定的仅仅是细菌、防线菌、和真菌的相对数目。所用的方法是系列稀释平板法。为培养这三类微生物的生长，采用了不同的培养基：甘油醇母琼脂培养基用于防线菌分离；Saboruaud 琼脂培养基用于真菌的分离；为了抑制细菌的生长，两种培养基都补以每毫升培养基10微克的金霉素。营养琼脂培养基用于细菌的分离。

三、实验材料：

土壤：1克充分碾碎的肥沃的花园土样本，放入装有99毫升无菌水的烧瓶中，标记为瓶1:1:100稀释度（10ˉ2）。

培养基：每个实验组：1瓶75毫升保持在45℃熔化的营养琼脂培养基；1瓶75毫升45℃甘油醇母琼脂培养基；1瓶75毫升45℃Sabouraud琼脂培养基。2瓶99毫升无菌水。

器材：酒精灯，计数器，无菌1毫升吸管，无菌培养皿，记号笔。四、实验步骤：

1．按下法标记每组的四个培养基

营养琼脂培养基：104-，105-，106-，107-（用于细菌计数）。

甘油醇母琼脂培养基：103-

，104-，105-，106-（用于放线菌计数）。

Sabouraud琼脂培养基：102-，103-，104-，105-（用于真菌计数）。

2.用笔标记二瓶99毫升无菌水为瓶2和瓶3。

3.用力摇动1：100（102-）稀释度的土壤样本大约30分钟。

4.用一支无菌1毫升吸管，从瓶1中吸取1毫升所给土壤样本稀

释液到瓶2，并如前用力摇动。其稀释度为1：10000（104-）。

5.用另一支无菌1毫升吸管，从瓶2中吸取1毫升稀释液到瓶3，

并如前用力摇动。其稀释度为1：1000000（106-）。

6.按下法，用无菌1毫升吸管及无菌技术，吸取适当量的每种稀释液到相应标记的平皿中以得到最终所需稀释度。

a.真菌——放入标记的Sabouraud琼脂平皿中

1毫升瓶1稀释液加入到标记102-平皿中

0.1毫升瓶1稀释液加入到标记103-平皿中

1毫升瓶2释液加入到标记104-平皿中

0.1毫升瓶2释液加入到标记105-平皿中

b.放线菌——放入标记的甘油醇母琼脂平皿中

0.1毫升瓶1稀释液加入到标记103-平皿中

1毫升瓶2释液加入到标记104-平皿中

0.1毫升瓶2释液加入到标记105-平皿中

1毫升瓶3液加入到标记106-平皿中

c.细菌——放入标记的营养琼脂平皿中

1毫升瓶2释液加入到标记104-平皿中

0.1毫升瓶2释液加入到标记105-平皿中

1毫升瓶3液加入到标记106-平皿中

0.1毫升瓶3液加入到标记107-平皿中。

7.从水浴中取出熔化的营养琼脂培养基并擦干烧瓶。用无菌技术，在每个用于细菌计数的平板中倒入大约15毫升培养基，轻轻旋转每个平板以保证培养基中细胞均一分布。

8.重复步骤7，用熔化的Sabouraud琼脂培养基进行真菌计数；用熔化的甘油醇母琼脂培养基进行放线菌的计数。

9.使所有的琼脂平板固化。

10.把平板置于25℃下，倒置3-7天。

实验二抗生素产生菌的分离

一、实验目的：

1.用致密平板技术分离抗生素产生微生物

2.确定分离的抗生素抗菌活性范围

二、实验原理：

土壤是能产生抑制其他微生物生长的抗生素的微生物的主要栖息地。医学上用的抗生素是从四个土壤微生物种群中分离出来的：链霉菌，芽孢杆菌，青霉菌和头孢霉菌，它们分别代表着放线菌，细菌和霉菌三个微生物类型。

虽然在工业实验室中不断进行来自全球土壤的筛选以分离得到新的产生抗生素的微生物，但是工业微生物学已把其力量对准已有抗生物质的化学修饰上。这是通过增加或取代化学侧链、重组分子内键，或产生能分泌更多潜在形式抗生素的突变体微生物菌株来完成的。化学同类物的产生是为了防止抗生素抗性的产生，把对宿主不利的副作用降到最小和增加抗生素的有效范围。

实验的A部分中，学生将使用致密平板技术从土壤样品中分离抗生素产生微生物，其中之一接种灰色链霉菌作为阳性对照。在B 部分中，显示抗生素活性的分离物将被筛选出来对几种不同的微生物进行抗性反应以确定它们的效果。

三、实验材料：

培养物：B部分，用trypticase soy肉汤培养基培养24小时的大肠杆菌，金黄色葡萄球蓖，耻垢分枝杆菌和铜绿色假单胞菌。

土壤悬液：A部分，1：500稀释度的土壤悬液（每50毫升自来水0.1克土样）作为未知；1：500稀释度土壤接种链霉菌作为阳性对照。

器材：A部分，500毫升烧杯，试管，无菌平皿，接种针，加热板，温度计，1毫升和5毫升吸管，放大镜。

B部分，酒精灯和接种环。

四、实验步骤：

A部分抗生素产生微生物的分离

1.在每套的三个平皿上标记所要的土壤样本和稀释度（1：1000，1：2000，1：4000），并用你的收字母加以识别。共标记二套。

2.把6支trypticase soy琼脂试管放入水浴中加热至100℃，然后冷却至45℃保持。

3.按下法准备未知和阳性对照的1：500土壤样品系列稀释度。

a.在三支试管上标记1，2和3，用吸管加5毫升自来水到每支试管中。

b.充分摇动所给1：500土壤样品以得到均匀的土——水悬液。

c.用5毫升吸管，吸取5毫升1：500稀释液到试管1中并混匀，稀释度为1：1000。

d.用另一支吸管，从试管1中吸5毫升稀释液到试管2中并混匀，稀释度为1：2000。

e.再用另一支吸管，从试管2中吸5毫升稀释液至试管3中，混匀，稀释度为1：4000。

f.分别用1毫升吸管，吸取1毫升的1：1000，1：2000和1：4000的稀释液到相应标记的平皿中。

g.每皿倒一管45℃的trypticase soy琼脂培养基，轻轻转动混匀之。

h.使其固化

4.所有平板于25℃倒置保温2至4天。

5.保温后，用接种针从每个培养物中无菌分离有生长抑制圈的菌落于trypticase soy琼脂斜面上。

6.将斜面于25℃保温2至4天，将其作为B部分的抗生素产生分离的原种培养物。

B部分分离物抗菌范围的确定

1.在trypticase soy琼脂平板上标记上分离物的土壤样品来源。

2.用无菌技术，在琼脂平析用单线划线接种每种分离物。接种线将平板分成两半。

3.将平板于25℃倒置保温3－5天。

4.保温后，在每个平板底部划四条垂直于抗生素产生分离物生长线的直线。

5.按每个平板上的底部描线，无菌划线接种四种供试培养物，从靠近（但不接触）抗生素产生分离物的生长处开始，划向平板的边缘。

6.平板于37℃倒置保温24小时。

实验三豆科植物根瘤中根瘤菌的分离

一、实验目的：

1.观察根瘤和类菌体

2.从根瘤中分离根瘤菌

二、实验原理：

不同的根瘤菌感染相应的豆科植物根部形成根瘤。根瘤是根瘤菌和豆科植物的共生组织，它能大量地同化大气分子态氮，供豆科植物用，同时豆科植物为根瘤提供所需营养成分。根瘤菌在根瘤中是以类菌体的形式存在。虽然土壤中存在很多根瘤菌，但如果从土壤中进行分离，则很难鉴别。最简单的方法就是从根瘤中进行分离。本实验选用大豆植株根系上的根瘤进行大豆根瘤菌的分离。

三、实验材料：

植株：接种了根瘤菌的生长30天左右的大豆植株。

培养基：每实验组1瓶150毫升结晶甘露醇酵母琼脂培养基，4支甘露醇酵母琼脂斜面，5支10毫升无菌水。

试剂：95％酒精，0.1％升汞。

器材：无菌培养皿，无菌眼科剪、眼科镊，接种环。

四、实验步骤：

1.挖取植株根系，带土放入水中浸泡，稍后抖掉泥土，用水冲洗，获得带瘤根系。

2.选择根系主根上部发育健壮，饱满呈红色的根瘤，用眼科剪将根瘤剪下，剪下时稍带一些根，以保持根瘤的完整性。

3.为去除根瘤表面的杂菌，将剪下的根瘤浸入95％酒精中5分钟，然后再转入0.1％升汞中5分钟。

4.无菌操作，将根瘤放入无菌水中浸洗，振摇5分钟，重复4次。

5.将灭菌清洗干净的根瘤放置于无菌培养皿中。

6.用无菌镊子将根瘤压碎，流出浆液。用1毫升无菌吸管吸1毫升无菌水与浆液混匀，制成悬液。

7.按下法进行四路划线分离

a.取一环菌悬液在甘露醇酵母琼脂平板图示区域1表面划3次。

b.灼烧接种环并使其冷却，把平板转90°，把接种环放置区域1的角上，交叉在区域1的划线上，在图示区域2上划3次。

c.再次灼烧接种环，并冷却之，再将平板转90°，从区域2的角上，按上法在区域3上划线。

d.不再灼烧接种环，再将平板转90°，从区域3的角上划线至区域4。

8.将平板倒置，于28℃保温4－7天。

9.另将菌悬液涂片，供观察。

实验四感病死亡昆虫中杀虫细菌的分离

一、实验目的：

掌握病原细菌的分离方法

二、实验原理：

大多数病原细菌使昆虫致死的方式是一旦进入血腔，就会引起败血症。一般死虫体内充满乳糜状液样物，因此将昆虫体内的体液接种到合适的培养基上，就能达到分离病原细菌的目的。