睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用
家畜繁殖学期末问答
家畜繁殖学期末问答第⼀章家畜的⽣殖器官⼀．睾丸：1.⼤体结构：①均为长卵圆形，⼤⼩左右相等；⽜、马的左侧稍⼤于右侧。
②位置：两个睾丸分居于阴囊的两个腔内，各个家畜位置根据阴囊的部位不同⽽不同。
2.功能：①产⽣精⼦②分泌雄激素③产⽣睾丸液⼆．附睾：1.组成：附睾管壁、附睾管、附睾体。
2.功能：①吸收和分泌作⽤②附睾是精⼦最后的成熟场所③附睾是精⼦的储存库④运输作⽤三．副性腺：1.组成：精囊腺、前列腺和尿道球腺统称为副性腺。
2.功能：①.冲洗尿⽣殖道，避免精⼦遭受尿液危害。
②精⼦的天然稀释液③为精⼦提供营养物质④活化精⼦⑤运送精液到体外⑥缓冲不良环境对精⼦的危害⑦形成阴道栓，防⽌精液倒流。
四．卵巢：1.基本构造：⽣殖上⽪、髓质部、⽪质部、卵泡、黄体、排卵窝。
2.功能：①卵泡的发育和排卵②分泌雌激素与孕酮五．⽣殖道：1.基本构造：包括输卵管、⼦宫和阴道。
2.功能：接纳运送卵⼦，精⼦获能、卵⼦受精及卵裂的场所，分泌机能。
运送精⼦和胎⼉娩出，胎⼉发育的场所，对卵巢机能的影响作⽤，对精⼦的选择作⽤。
六．⼦宫：1.⼤体结构：各种动物的⼦宫均可分为⼦宫⾓、⼦宫体、⼦宫颈三部分。
⽜、⽺内膜上有很多⼩⾩，称⼦宫⾩，妊娠同绒⽑膜的绒⽑共同构成⼦叶胎盘。
2．功能：①输送功能②精⼦获能的环境、孕体(囊胚到附植)的营养、形成母体胎盘、胎⼉发育的场所③对卵巢机能的影响④⼦宫颈是⼦宫的门户⑤⼦宫颈是精⼦的“选择性贮库”之⼀。
第⼆章⽣殖激素问答题：下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）及催产素（OXT），垂体分泌的促性腺激素（FSH，LH，PRL），胎盘产⽣的促性腺激素（PMSG，hCG），性腺激素（A,E,P）及局部激素（PG）的名称缩写，来源，主要⽣理作⽤及⽣产中的应⽤。
（p32）1.下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）：⽣理作⽤：①激垂体前叶释放促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)，主要为促黄体素。
②对雄性动物有促进精⼦发⽣和增强性欲的作⽤；对雌性动物诱导发情、排卵、提⾼配种受胎率的功能。
神经生长因子在不同周龄小鼠睾丸组织中的表达
化 ， 外 吸收 法测 定 Ｒ Ａ浓 度 及纯 度 ， 脂 糖凝 胶 紫 Ｎ 琼
电泳检 测其完 整性 。 １４ ２ 引 物的设计 ： ．． 参照 Ｇ ｎ ａ ｋ中所登 录 的小 鼠 ｅｂ ｎ
（Ｎ ０ ３ ０ ）、 大 鼠 （Ｘ ０ ０ ７ ３ ） 人 Ｍ １６９ Ｍ０ １５ １０ 、
进行 了分 析 ， 以探 讨 Ｎ Ｆ与睾丸组 织发 育 和精子 发 Ｇ
大利 ＢｏＲ ｄ 司 ； ＭＬ ２型显微镜 ： 国 Ｌ ｉ 。 ｉ－ ａ 公 Ｄ Ｂ 德 ｅｃ ａ
１４ 方 法 ．
１４ １ 总 Ｒ Ａ 的提 取 及 检 测 ： 用 Ｔｉ ｌ 剂 盒 ． ． Ｎ 利 ｒ ｏ试 ｚ
提取各 周 小 鼠睾 丸 组 织 中 的 总 Ｒ Ａ， 规 方 法 纯 Ｎ 常
生 的关 系 。
（ Ｍ０ ２ ０ ） 牛 （ Ｍ５ ０ ０ ） Ｎ Ｆ基 因序 列 ， Ｎ ０５６ 、 Ｘ ８９７ 的 Ｇ 在
Ｎ Ｂ 上进行 同源性 比较 ， 用 Ｐｉ ｅ ． Ｃ Ｉ 利 ｒ ｒ ０软件在小 ｍ ５
１ 材 料 与方 法
１ １ 实验 动物 ． 实验 动物为 山西 医科 大学实 验动物 中心提供 的 成年昆 明 种 小 鼠 （ 动 字 第 ０ ０ ０ 医 ７ １２号 ） 共 ３ ， ２只 （ 雌雄 比例 ３ ：１ 。 笼养 一 周 后 ， 照 雌 ３只／ １ ） 按 雄
Ｋｔ５ ｐ Ｄ Ａ ｍ ｒｅ ｉ ０ ｂ Ｎ ａｋ ｒ由 大 连 宝 生 物 公 司 提 供 ； 、
Ｒ ｂ ｉａ ｔＮ Ｆ 即用 型 Ｓ Ｂ ａ ｂｔ ｎｉ Ｇ 、 ． Ａ Ｃ试 剂 盒 、 Ａ Ｄ Ｂ显 色试
剂 盒 （ Ｒ ０ ２ 由武 汉博 士 德生 物 工程 有 限公 司提 Ａ １２ ）
雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达
雄激素受体敲除小鼠睾丸生精功能变化及p63的表达作者：郑纯威陈宇丰奕波黄强来源：《中国现代医生》2013年第34期[摘要] 目的研究雄激素受体（AR）敲除小鼠睾丸生精功能及p63在曲细精管中表达的改变。
方法采用雄性Flox-AR小鼠与雌性ACTB-Cre小鼠交配，并敲除胚胎中AR，筛选AR敲除（AR敲除组）和AR未敲除（对照组）雄性小鼠各10只，对比睾丸曲细精管生精功能及p63的表达。
结果两组小鼠曲细精管内径、管周膜厚度、管壁生殖细胞层数、生殖细胞成熟度评分及总Makler评分之间差异均有统计学意义（P < 0.05），p63的阳性表达主要位于精原细胞及精母细胞，精子细胞及成熟精子中表达呈阴性，且AR敲除组表达阳性率及HSCRE评分均显著低于对照组（P < 0.01）。
结论 AR表达与小鼠睾丸曲细精管p63表达关系密切，AR 敲除小鼠睾丸曲细精管生精功能受损、p63表达下调，p63调控生殖细胞的早期分化。
[关键词] 雄激素受体；基因；p63；生精功能[中图分类号] R698.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）34-0001-03The testicular spermatogenic function and expression of p63 in androgen receptor knockout mouseZHENG Chunwei CHEN Yu FENG Yibo HUANG QiangLaboratory Animal Center of Zhejiang Province Traditional Chinese Medicine Academy，Hangzhou 310007， China[Abstract] Objective To study spermatogenesis and p63 expression in the seminiferous tubules of the testicular androgen receptor （AR） knockout mice. Methods Male Flox-AR mice mated with female ACTB-Cre mice， and knocked the AR in addition to embryos， screening AR knockout male mice （ARKO group） and AR did not knock （control group），each of 10 mice. Contrasted testis seminiferous tube spermatogenic function and p63 expression. Results The differences of seminiferous tube diameter， the peritubular film thickness， wall germ cell layers， the germ cell maturity score and Makler score between two groups were statistically significant （P < 0.05）， p63 mainly expressed in spermatogonia and spermatocytes， expressed in sperm cells and mature sperm were negative， and AR knockout group expression the positive rate and HSCRE of scores were significantly lower than the control group （P < 0.01）. Conclusion AR expression in mouse testis seminiferous tubules are closely related p63 expression. AR knock damage in addition to the mouse testis seminiferous tube spermatogenic function of p63 downregulation of p63 regulation of the early differentiation of the germ cells.[Key words] Androgen receptor； Gene； p63； Spermatogenic function雄激素主要由睾丸间质细胞分泌，诱导男性性别的分化，促进内生殖器发育，进入曲细精管促进生精细胞的分化和精子生成[1]。
性成熟前小鼠生精细胞的发育过程
第20卷第3期中 国 兽 医 学 报V o l.20,N o.3 2000年5月Ch inese Jou rnal of V eterinary Science M ay2000性成熟前小鼠生精细胞的发育过程张学明,文兴豪,赖良学,李德雪3,李子义,杨盛华,杜惜明,曾发贵 (解放军军需大学动物科技系,吉林长春130062)摘要:用光镜、电镜观察了生后1～18d昆明白小鼠的生精上皮。
结果显示,生后1～3d,曲细精管内只有生殖母细胞和支持细胞2类形态结构截然不同的细胞,前者位于管中部;生后4～5d,少数生殖母细胞已附着在基膜上;生后6～7d,原始A型精原细胞大量出现并附着在基膜上;生后8d,A型精原干细胞大量出现,B型精原细胞开始出现;生后10d,B型精原细胞大量出现;生后12～13d,前初级精母细胞出现,少数曲细精管的管腔开始出现;生后14～15d,多数曲细精管管腔基本形成,前初级精母细胞大量出现。
本试验的结果表明,7～8d小鼠的睾丸最适于分离精原干细胞。
关键词:精原干细胞;形态结构;小鼠中图分类号:S852116 文献标识码:A 文章编号:100524545(2000)0320293205 精原干细胞的异体及异种移植是当前干细胞领域的一个新的研究热点。
但目前用于移植的细胞都是混合细胞,效率很低[1]。
若能将精原干细胞分离纯化,即可克服上述不足。
分离纯化精原干细胞必须选取合适日龄的睾丸,才能获取较多的细胞。
目前有关性成熟前小鼠生精上皮细胞生长发育所经历的形态结构的变化,尚缺乏系统的研究报道。
本试验系统观察了小鼠性成熟前各级生精细胞发育分化进程,以为选择合适日龄的小鼠睾丸分离纯化小鼠精原干细胞提供依据。
1 材料与方法111 动物的选择及饲养 昆明白小鼠,由本校实验动物中心提供,按常规方法饲养管理。
选择自然发情母鼠与公鼠合笼,次日8:00检查阴道栓,见栓日中午记为交配后(PC)0.5d,PC19d后确切记录幼鼠出生时间。
精子发生过程中相关基因的研究进展
ｗｉｈ ｂ ｔ ｎ ｒ ａ ｅ ｖ ｌ ｔ ｎ ｒ ｔ ｎ ｔｒｌ ｙ ｉ ｍｂ ｉ ｇ ｎ ｌ ｔ ｏ ｈ ｉ ｃ ｅ ｓ ｄ ｏ ｕ ａ ｉ ａ ｅ ａ ｄ ｓ ｅ ｉ ｎ Ｃａ ｒ ｄ ｅ ａ ｄ Ｂｅ — ｏ ｉ ｔ
中起 着 至关 重要 的作 用。文章 着 重对 干细胞 因ｆ／— ｉ ｆ ｃｋ － ｔ系统 、 细胞 周期蛋 白基 因、 热休 克基 因和 细胞 凋亡 相 关基 因等 精 子发 生相 关基 因的研 究进展 进 行 了
综述 。
啦 旗甚瓿 ： 臻瑚 轻 ｜ ｜ 一 ｔ 薯｜ ｜ 薯｜尊 ≯ 簪 蕾 ｜ ｜ ｜ ≯ ｜ 薯蔓≯ 叠 ｜
ｓｍｅｏ ｅｐ ［］ Ｂｏ ｇ ｅｒｄ ｃｏ ，９ １４ ４ ：２ — ２ ． ｏ ｆ ｈ ｅ Ｊ． ｉｏｙＲ ｐｏ ｕｔ ｎ １９ ，４（ ） ０ ６ ４ ｓ ｌ ｉ ６ ［４Ｊ ａ ｒｈｎＪＰ， ｅａ １ ｎａ ａ ＧｒｇｎＳＭ， Ｍｕａｔ Ｈ ｌｎ Ｐ，ｅ ａ． ｔｔ ｎ ｅｇｎｓ ｔ Ｍｕａｏ ｓｉ ｔ ｅ ｅ １ ｉ ｎｈ
Ａ ｉ ｌ ｅ ｅ ，２ １ ， ２ １ ： ９ ９ ． ｎｍａ Ｇ ｎ ｔ ０ ４ （ ） ８ — ２ １
１２ Ｃ ｕＭｘ，Ｙ ｎ ， ｅ ｇＴ ｔ １Ｇ ９ａ ａ ｄｄｔ ｅｅｆｒ ｒ— ２ ｈ Ｊ ａ ｇＪ Ｆ ｎ ，ｅ ａ． ＤＦ ｓａｃｎ ｉａ ｇｎ ｏ ｏ ｅ ｐ ｌ ｃｃ ｆＳ ａｌ ａ ａ ｈｅ ［］ ｌｃ ｌ ｉ ｏｙＲ ｐｒ，０ ， ｉ ａｙｏ ｍ ｌＴ ｉ Ｈ ｎｓｅｐＪ ． ｅｕａ Ｂｏ ｇ ｅ ｏｔ２ １ ｉ ｆ ｌ Ｍｏ ｒ ｌ ｌ
小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定
睾 丸 支 持 细 胞 是 由意 大 利 组 织 学 家 Ｓ ｒ ｌ于 ｅｔ ｉ ｏ
１１ ，． 主要 试 剂 ２
胶 原 酶 Ｖ（ｉ 公 司）胰 蛋 白酶 Ｓ ｍａ ｇ 、
１６ ８ ５年 发现 的存 在 于 生精 上 皮 中 的一种 大细 胞 ， 作 为 曲精 细管 的重要 组成 部分 ，多 年来 被认 为是 生 精 细胞 的支架［２ １１ 。它参 与构成 生精 细 胞分 化发 育 的最
１ ． 方 ２ 法
释放 、 泌 、 疫豁 免 等多种 功能 【 １ 分 免 ３。
睾 丸支持 细胞 的体外 分离 、培 养对 明确体 内精 子发 生机 理具 有重要 作用 ｌ ５ １ 。另外 ， 临床上 将 睾丸 支 持 细胞 和胰 岛共 移植 可 以降低 免疫 排斥 反 应 ，提 高 糖 尿 病 治愈 的成 功 率 ｌ ６ １ 试 验对 国外 睾 丸 支 持细 。本 胞 分 离 、 化技 术 加 以改 进 ， 此 基础 上 ， 行小 鼠 纯 在 进
Ｎａ ８０ Ｃ１ ． ｇ， ＫＣ１ ． ０ ０ ４ ｇ， Ｃ ２ １ ｇ， ｇ Ｏ４‘ Ｈ２ Ｃａ １ ０．４ Ｍ Ｓ ７ ０ ０． ０ ｇ， ２ ２ ＮａＨＰＯ４‘ Ｏ ０ ＫＨ２ Ｏ４０． ６ ｇ， Ｈ Ｃ Ｈ２ ０． ６ ｇ， Ｐ ０ Ｎａ Ｏ３
睾 丸支 持细 胞原代 培养 ，并 对其 生 物学 特性 进行 检
突起 很 多， 核仁 清晰 ， 胞质 中可见 大小不等的 红色空泡状脂质 小滴。
关 键词 ： 睾丸支持 细胞 ； 离； 分 纯化 ； 培养 ； 小鼠
中图分 类号 ： ８ ５１ ０３ ￥ ６ ．－ ． ￣ ３ 文献 标识 码 ： Ａ 文章 编号 ：２ ８ ７ ３ （０ ８ ０ － ０ ７ ０ ０ ５ — ０ ３ ２ ０ ）９ ０ １— ４
211099479_高尿酸血症对小鼠生精功能和精子质量的影响及其机制
doi：10.1007/s11255-016-1439-0.［13］TAKENAKA T，INOUE T，MIYAZAKI T，et al.Klotho suppresses the renin-angiotensin system in adriamycin nephropathy［J］. Nephrol Dial Transplant，2017，32（5）：791-800.doi：10.1093/ndt/ gfw340.［14］YIN S，ZHANG Q，YANG J，et al.TGFβ-incurred epigenetic aberrations of miRNA and DNA methyltransferase suppress Klotho and potentiate renal fibrosis［J］.Biochim Biophys Acta Mol Cell Res，2017，1864（7）：1207-1216.doi：10.1016/j.bbamcr.2017.03.002.［15］章炜，王鸣，费晓，等.Klotho对缺血再灌注急性肾损伤的影响研究［J］.浙江医学，2020，42（20）：2175-2184.ZHANG W，WANG M，FEI X，et al.Effects of Klotho on acute kidney injury induced by ischemia reperfusion［J］.Zhejiang Med J，2020，42（20）：2175-2184.doi：10.12056/j.issn.1006-2785.2020.42.20.2020-1755.（2022-07-05收稿2022-11-25修回）（本文编辑魏杰）高尿酸血症对小鼠生精功能和精子质量的影响及其机制江晓翠，田代志，赵敏，龚健，余何，姜兴宇，萧闵△摘要：目的探讨高尿酸血症（HUA）通过氧化损伤诱导睾丸细胞凋亡、降低小鼠生精功能和精子质量的机制。
DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞生物学特性的影响及其调节睾酮合成机制的研究的开题报告
DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞生物学特性的影响及其调节睾酮合成机制的研究的开题报告
研究背景：
脱氢表雄酮（DHEA）是一种具有广泛生物学功能的内源性甾体激素，在动物性体内经雄激素或催乳素刺激后，由睾丸和肾上腺皮质中的类固
醇激素合酶（CYP17）合成。
睾丸间质细胞是睾丸内的主要细胞类型之一，对向精子细胞提供生长因子、营养物质和支持环境等具有重要作用。
先
前的研究表明，DHEA在小鼠睾丸中具有促进睾酮合成、增加睾丸大小、提高生殖能力等生物学效应，但其对原代大鼠睾丸间质细胞的作用和作
用机制尚未明确。
研究目的：
本研究旨在探究DHEA对原代大鼠睾丸间质细胞生物学特性的影响，以及其对调节睾酮合成机制的作用。
研究内容：
1. 提取大鼠睾丸间质细胞，并鉴定其纯度和活性；
2. 采用细胞培养技术，分别注射不同浓度的DHEA溶液，在不同时
间点取样并检测睾酮合成能力、生长状态和细胞增殖等生物学特性指标；
3. 进一步研究其作用机制，包括检测CYP17和相关信号分子的表达水平变化，以及使用抑制剂对相关途径的干预效果。
研究意义：
该研究有望为理解DHEA对睾丸间质细胞生物学特性和调节睾酮合
成机制的作用机制提供新的证据，为进一步探寻适用于肾上腺和性腺等
疾病的药物研发提供新思路。
小鼠睾丸支持细胞分离培养及生物学特性鉴定
幼 鼠 睾 丸 进 行 分 离 、纯 化 和 生 物 学 特 性 鉴 定 。结 果 表 明 ： 分 离 、纯 化 后 的 睾 丸 支 持 细 胞 损 伤 少 、活 率 高 、睾 丸 支 持 细
胞 占 培 养 细 胞 总 数 的 ９０％ 以 上 ； 根 据 形 态 学 观 察 及 油 红 Ｏ 脂 质 染 色 法 鉴 定 ， 睾 丸 支 持 细 胞 的 生 长 状 态 良 好 ， 细 胞
图 ２ 睾 丸 支 持 细 胞 培 养 ２４ ｈ（ ２００×）
１８
２００８ 年 第 ４４ 卷 第 ９ 期
Ｒｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａ ｎｄ Ｐ ｈｙｓ ｉｏｌｏｇｙ · 繁 殖 生 理
图 ３ 睾 丸 支 持 细 胞 培 养 ８ ｄ（ ２００×）
２．２．２ ＨＥ 染 色 形 态 学 观 察 睾 丸 支 持 细 胞 胞 体 呈 宽大的柱状或不规则形状， 其胞质铺展得很大， 一般 有 ３～４ 个突起， 细胞核为卵圆形， 位于胞质的中央或 稍偏位， 有 ２～３ 个清晰可见的核仁。多个一起存在 时， 细胞的突起相互连接， 界限不清， 呈单层膜状， 胞 质中可见有多量大小不一的空泡状结构（ 图 ４） 。
２ 结果与分析
２．１ 睾 丸 支 持 细 胞 的 分 离 纯 化 刚 分 离 后 的 睾 丸 支持细胞中夹杂有大量的生精细胞， 纯化后计数， 平 均 每 个 睾 丸 可 获 得 ４×１０５ 个 细 胞（ 图 １） 。 细 胞 悬 液
接 种 ２４ ｈ 后 经 Ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ 液 低 渗 处 理 ， 可 融 解 除 去 绝 大 部 分 精 原 细 胞 ， 获 得 均 一 、高 纯 度 的 睾 丸 支 持 细 胞 ， 其 纯 度 可 达 ９０％（ 图 ２） 。 经 台 盼 兰 染 色 ， 活 细 胞 均透亮， 拒染， 少数死细胞蓝染， 活细胞可占总数 ９５％以 上 。
Id4标记小鼠睾丸中的精原干细胞的开题报告
Id4标记小鼠睾丸中的精原干细胞的开题报告
题目：利用Id4标记小鼠睾丸中的精原干细胞
摘要：
精原干细胞（SSC）是哺乳动物睾丸中的一种少量的、自更新和能够分化为成熟精子的种子细胞。
SSC在生殖医学研究中具有广泛的应用前景，例如生育障碍和不育症的治疗以及动物繁殖方面的应用等。
然而，由于SSC数量非常稀少，目前对SSC的研究还比较困难。
在这篇报告中，我们将探讨一种新型的SSC标记方法。
我们使用了
一种名为Id4的基因来标记小鼠睾丸中的SSC。
Id4是一种转录因子，已被证明在小鼠和人类的精细胞中高度表达。
我们使用CRISPR/Cas9基因
编辑技术将启动子区域的GFP序列插入到Id4基因上，使得SSC可以带
有绿色荧光蛋白标记，从而可以更容易地被检测和分离。
实验结果显示，Id4-GFP标记的小鼠睾丸中有大量的绿色荧光细胞，这些细胞在形态和生理特征上与已知的SSC相似。
我们还使用了荧光原
位杂交技术，进一步确定了这些细胞确实是SSC。
总之，我们成功地建立了一个新的SSC标记方法，它可以为SSC的研究提供更准确、更高效的检测方法，并为相关研究奠定基础。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
睾丸间质细胞在小鼠生精恢复过程中的作用摘要：研究睾丸间质细胞对小鼠生精恢复过程的作用，可以为深入理解睾丸精原干细胞与其微环境（体）细胞间的相互关系提供实验证据选取8周龄健康C57近交系成年雄性小鼠60只，腹腔注射22mg/kg白消安建立小鼠精子发生受阻模型，随机分成1，2--甲磺酸乙烷（ethanel，2-dimethanesulphonate，EDS）处理组、氟他胺处理组和对照组，每组20只，3d后分别给予EDS腹腔注射（100mg/kg）、氟他胺埋植，对照组仅注射溶剂、埋植空管，分别在处理后的1个月内每周采样，Real-time RT-PCR检测CSF1.Gdnf、PLZF和Nanog mRNA表达水平，Gdnf蛋白水平表达，并在4周时进行睾丸组织HE染色，观察组织学变化并对相关指标进行量化分析结果表明，小鼠睾丸间质细胞去除及雄激素受体阻断均能促进睾丸损伤后的生精恢复过程，但是，受体阻断的效果更强，说明间质细胞除了通过雄激素发挥作用外还直接对生精恢复起着一定的促进作用，这种促进作用可能是通过分泌CSF1等细胞因子来实现的。
关键词：间质细胞；生精恢复；小鼠；睾丸The Role of Leydig Cell for Restoration of Spermatogenesis in Testis of miceYUANLi-fang1，2，AN Na2，WANG Shan-lin2，GUAN Shu-luan2，WANG Feng2，LI Zong-yue2，ZHU Bao-chang，（1.College of Mathematics and Computer Science，Shangrao Normal University，Shangrao 334000，Jiangxi，Chian；2.College of Life Science，Capital Normal University，Beijng 100048，Chian）Abstract：To study the role of Leydig cells inrestoration of spermatogenesis in testis of mice，we compared reestablishment of spermatogenesis in testes with ablation of Leydig cells and blockage of androgen receptors for understanding relationship between spermatogonial stem cells and their microenvironment.Total numbers of 60 male mice（C57）were selected at age of 8 weeks old.Spermatogenesis disruption model was made by intraperitoneal injection with busulfan（22mg/kgBW （body weight））.Then they were randomly divided into 3 groups.Treatments of EDS group（n=20），flutamide group（n=20）and the control group（n=20）were received intraperitoneal in jection of ethane 1，2-dimethanesulphonate（EDS）（100mg/kg BW），flutamide implantation and viechle solution，respectively.The expression of CSF1，Gdnf，PLZF and Nanog mRNA were measured by Real-time RT-PCR at 4 weeks after treatment.In addition，the protein expression of GDNF was assayed by Western blot.The histological changes in testicular tissue were observed under microscope with HE staining at 4 weeks.Although both removal of Leydig cells and blockage of androgen receptors could promote restoration of spermatogenesis in testis of mice，we found that androgen receptor blockage gave rise to a stronger effect.在生理条件下，睾酮对于成年动物的精子发生是不可或缺的，然而Ogawa 和Dohrinski等在精原干细胞移植研究中相继表明[1]，使用GnRH激动剂抑制受体动物睾酮后能显著增加精原干细胞移植后的克隆形成效率，进而证实促进精原干细胞克隆率就是通过抑制睾酮与受体结合来实现的，因此，不论何种方法只要抑制了睾酮的作用就能表现出这种促进作用（包括GnRH激动剂、受体拮抗剂等），其作用机理至今仍不完全明了。
睾丸间质细胞（Leydig cells，LCs）仅占睾丸细胞总数的2%～4%，却是雄性睾丸内所有雄激素的唯一来源。
然而，睾酮是通过受体来发挥作用的，研究发现睾酮受体仅存在于睾丸体细胞（包括支持细胞、赖氏细胞和管周膜细胞等）上，生殖细胞本身并没有睾酮受体，也就是说，睾酮并不直接作用于生殖细胞，而是通过睾丸体细胞对生殖细胞施加影响的。
有研究表明Sertoli细胞可以通过分泌某些细胞因子（如GDNF、SCF、ERM等）影响精原干细胞的增殖[2]，然而，其他睾丸细胞也对精子发生具有一定的贡献，如赖氏细胞除了分泌睾酮外也能够分泌CSF1来影响精原干细胞[3]，但是，LCs在精子发生受损后的恢复过程中是否发挥作用却仍然不清楚。
本研究通过对比去除LCs与阻断雄激素的区别来推测睾丸LCs缺失在精子发生恢复过程中是否具有雄激素以外的其他作用，为深入理解睾丸精原干细胞与其微环境（体）细胞间的相互关系提供实验证据。
1材料与方法1.1实验动物购自军事医学科学院品系为C57近交系成年健康雄性小鼠，饲养在本校动物中心的屏障环境内，自由饮食，环境温度为22～26℃，人工光照周期为12L：12D自动控制。
1.2主要试剂白消安（busulfan）、DMS0、MTT及氟他胺（flutamide）（美国Sigma公司），Trizol及RT-PCR试剂盒（德国TianGen公司），SYBR Green Assay 试剂盒（日本TaKaRa公司），引物由上海Invitrogen公司设计合成，Gdnf抗体（美国Santa 公司），一抗β-Actin（鼠源，中杉公司），EDS由本实验室合成。
1.3小鼠睾丸损伤模型8周龄雄性C57小鼠60只，25～32g，以溶剂比例（DMS0：水=1：1配制成）4.4mg/mL的溶液，按22mg/kg体重分别给60只小鼠腹腔注射后，随机分成EDS处理组、氟他胺处理组和对照组3组，每组20只。
1.4小鼠LCs去除和氟他胺埋植EDS处理组在白消安注射3d后腹腔注射100mg/kgEDS，配制方法为称取200mgEDS粉末，溶于DMS0：水=1：3的10mL溶液中；氟他胺组小鼠颈部皮下埋植两头开口5mm长的硅胶管，管内填满氟他胺粉末。
1.5 睾丸组织形态学观察EDS和氟他胺处理4周后，处死小鼠，取睾丸，放人苦味酸（Bouin液）中间定15h，常规制备石蜡切片，HE染色，于光学显微镜下观察睾丸组织形态学切片。
统计曲细精管直径（seminifemus tubule diameter）、生精上皮厚度（the thickness of seminiferous epithelium），成型精子头部数（sperm head number）及空泡率（vacuoles rate）等组织形态学指标，每组中每项指标至少统计10个切片，100个曲细精管。
不规则圆形曲细精管取最小直径值，生精上皮厚度取垂直和水平方向4个生精上皮厚度的平均值，空泡率=产生空泡的曲细精管个数/总曲细精管数X100%。
1.6 Real-time RT-PCR检测睾丸组织PLZF、Gdnf、Nanog、CSF1、mRNA 表达采用Trizol-氯仿抽提总RNA，各组RNA样本260nm与280nm吸光度（A）值的比值A260/A280）均>1.8，符合PCR试验要求。
按RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA，加入SYBR Green Assay，反转录混合体系建立完成后，混匀，进行下一步Real time RT-PCR检测，本实验用的是Bio-RAD Real-time RT-PCR仪，mRNA 水平用L19作内对照标化。
基因表达通过各组Ct值间对照组Ct值间的比值做相对定量分析各基因的引物及其碱基序列如表1所示。
1.7 MTT法探究不同浓度EDS对Helas细胞的损伤取对数生长期的Helas细胞，以1X105/mL的密度接种于96孔板，培养箱培养24h后加入终浓度为0.1mg/mL、1mg/mL、10mg/mL、100mg/mL、1000mg/mL 直至饱和浓度的EDS，每组6个复孔继续培养24h后于倒置显微镜下观察细胞形态变化，每孔弃旧液培养，并加入20μL、5g/L的MTT原液和180μL无血清培养基，放入培养箱继续培养，4h后弃去培养液并加入150DMSO，待沉淀溶解酶标仪测定570nm波长的吸光度值。
1.8 Western-Blot检测睾丸组织Gdnf的蛋白表达TRIzol法提取蛋白质，Bradford法测定7d、14d、21d、28d、35d的对照组、EDS组和氟他胺组共15个蛋白样的蛋白浓度，配制12%的分离胶及5%浓缩胶，运用Bio-RAD的标准电泳装置电泳后转至PVDF膜，1gBSA加上20μLPBST室温封闭1h，1：1000—抗4℃孵育过夜，TBST洗涤3次，1：2000二抗室温孵育2h，TBST洗涤3次，将膜取出加显影液A、B，按照0.5mLA，0.5niLB，4mL 水的配制方法，按操作程序进行曝光处理，曝光时间为2～5S。
用GAPDH进行蛋白检测：条带进行图像分析，测定灰度值，用β-Actin作内参来比较各组Gdnf 的相对表达差异。