应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1HIV-2 IgG抗体
HIV检测规范
1 范围本章规定了HIV抗体的检测方法、结果报告及质量控制。
适用于各级各类医疗、疾病预防控制、检验检疫、采供血及卫生保健机构。
可作为对HIV感染者诊断和监测的实验室依据。
2 规范性文件引用《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准》（中华人民共和国卫生行业标准，WS293-有效版本）。
Consolidated Guidelines on HIV Testing Services. WHO July 2015Statement from the Surveillance and Survey Working Group and the Laboratory Working Group to the Office of the Global AIDS Coordinator.26 Nov.2006.Guidelines for using HIV testing technologies in surveillance. UNAIDS/WHO.2009.《艾滋病病毒抗体快速检测技术手册》（中国疾病预防控制中心，2011年版）3 HIV抗体检测实验室要求应符合国家对实验室生物安全的有关要求。
实验室的质量控制按本规范相关章节规定执行。
4 HIV抗体检测的目的和要点4.1 HIV抗体检测的目的4.1.1 HIV抗体检测可用于诊断、血液筛查、监测等。
4.1.2 以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。
4.1.3 以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。
4.1.4 以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。
4.2 HIV抗体检测的要点4.2.1 根据目的选择检测方法及检测策略。
4.2.2 严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。
4.2.3 结果判定以试剂盒说明书为标准。
第三版免疫学检验技术第9-13章中级试题及答案
第九章酶免疫技术一、A11、下图所示的为哪一种ELISA技术的反应原理示意图（）。
A、双抗原夹心法B、双位点一步法C、间接法测抗体D、竞争法E、捕获法2、钩状效应是指用ELISA一步法测定标本中待测抗原时，抗原浓度过（），实测值偏（）的现象，极易造成假阴性A、低，高B、高，高C、高，低D、低，低E、高，不变3、ELISA试验中最常用的标记酶是（）。
A、ASTB、HRPC、ACPD、LDHE、ALT4、酶增强免疫测定技术是最早取得实际应用的（）。
A、均相酶免疫测定B、异相酶免疫测定C、固相酶免疫测定D、液相酶免疫测定E、固相-液相酶免疫测定5、利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体的方法，通常称为（）。
A、双抗体夹心法B、双位点一步法C、间接法D、竞争法E、捕获法6、ELISA中最常用的固相载体是（）。
A、聚氯乙烯B、聚苯乙烯C、三聚氧胺D、琼脂糖E、尼龙膜7、均相酶免疫测定不具有的特点是（）。
A、常用于半抗原和小分子的检测B、操作简便，易于自动化C、不易受样品中的内源性酶的干扰D、酶与抗原结合后仍保留酶和抗原的活性E、灵敏度不及异相酶免测定8、酶增强免疫测定技术（EMIT）是一种（）。
A、非均相酶免疫测定技术B、均相酶免疫测定技术C、酶免疫组织化学技术D、酶免疫测定与电泳相结合的技术E、电泳技术9、ELISA板包被后，最常用的封闭物质是（）。
A、人白蛋白B、人球蛋白C、牛血清白蛋白D、牛血清球蛋白E、鼠白蛋白10、可用免疫渗滤试验和免疫层析试验检测的项目没有（）。
A、抗HCV B、HIV C、HCG D、HBsAg E、HAV11、制备抗体酶结合物的方法通常采用（）。
A、戊二醛交联法B、糖原染色法C、免疫印迹法D、酶耦联测定法E、捕获竞争法12、下列不属于ELISA测定方法中所必需的试剂（）。
A、固相的抗原或抗体B、酶标记的抗原或抗体C、酶作用的底物D、戊二醛交联剂E、稀释的血清13、斑点免疫层析试验最常用的载体材料是（）。
胶体金与免疫渗滤斑点法临床应用
胶体金与免疫渗滤斑点法临床应用胶体金与免疫渗滤斑点法是一种常用的临床检测方法，广泛应用于医学诊断、生物学研究以及生物分析等领域。
本文将介绍胶体金与免疫渗滤斑点法的原理、临床应用以及优势。
胶体金是一种纳米材料，具有良好的生物相容性和光学性质。
胶体金颗粒表面可以修饰不同的功能性分子，如抗体、DNA等。
免疫渗滤斑点法是一种通过胶体金与抗原或抗体的特异性结合来检测目标物质的方法。
通过在试验纸上形成胶体金-抗原或胶体金-抗体复合物，可以通过肉眼观察形成明显的颜色变化，从而判断目标物质的存在与否。
胶体金与免疫渗滤斑点法在临床应用中具有以下几方面的优势。
首先，该方法操作简单，不需要复杂的实验设备和技术。
只需将待测样品涂抹在试验纸上，加入胶体金-抗体复合物，待反应完成后观察颜色变化即可。
这种简单的操作流程使得该方法适用于各种临床实验室和基层医疗机构。
胶体金与免疫渗滤斑点法具有高灵敏度和特异性。
胶体金颗粒的表面修饰能力使得其可以与目标物质高效结合，从而提高检测的灵敏度。
同时，该方法还能通过选择合适的抗体或抗原对特定的目标物质进行检测，确保结果的特异性。
第三，胶体金与免疫渗滤斑点法具有快速的检测速度。
由于胶体金与抗原或抗体之间的结合是即时反应，因此整个检测过程可以在几分钟内完成。
这对于急诊诊断、迅速筛查和快速检测等场景非常有价值。
第四，胶体金与免疫渗滤斑点法还具有成本低、易于批量生产等优势。
胶体金颗粒的制备相对简单，成本较低。
同时，胶体金与免疫渗滤斑点法可以批量生产，满足大规模临床检测的需求。
胶体金与免疫渗滤斑点法在临床应用中有着广泛的应用。
例如，在感染性疾病的诊断中，可以利用该方法检测病原微生物或其相关抗体的存在。
此外，胶体金与免疫渗滤斑点法还可用于肿瘤标志物的检测、药物残留的监测以及食品安全等领域。
胶体金与免疫渗滤斑点法作为一种简单、灵敏、特异性高且具有快速检测速度的方法，在临床应用中具有广泛的应用前景。
随着纳米技术和生物技术的不断发展，相信胶体金与免疫渗滤斑点法将在临床诊断和生物分析领域发挥更大的作用。
艾滋病病毒感染实验检测方法研究进展
艾滋病病毒感染实验检测方法研究进展刘凤艾滋病是人类免疫缺陷病毒（HIV）感染引起的一种获得性免疫缺陷病，是全球主要公共卫生问题。
截至2019年底，全球约有3 800 万人感染，其中仅有67%接受了抗逆转录病毒治疗（ART），仍有710 万感染者甚至不知道自己的感染状况[1]。
随着抗逆转录病毒治疗技术的发展，HIV感染已成为一种可控制的慢性病，感染者能够过上长期的健康生活，寿命与未感染人群无明显差异。
联合国艾滋病规划署的3个90%目标中，首个即是90%的艾滋病病毒感染者知道自己的感染状况，而实验室检测是确定艾滋病感染的唯一办法。
随着科学的进步，HIV检测引入了许多新方法，取得了长足的进步。
本文将近年来艾滋病病毒的血清学检测和核酸检测方法的研究进展综述如下。
1 血清学检测1.1抗体检测或抗体抗原联合检测抗体检测是实验室最常用、最主要也是灵敏度和特异度均较高的HIV 检测方法。
1.1.1酶联免疫吸附试验（ELISA）中国于1985年出现艾滋病病例时开始研制第1代ELISA试剂，至今已发展到第5代，每一代新试剂都旨在克服前一代的不足。
第1代和第2代试剂只能检测IgG抗体，窗口期分别为6～8周和4～5周。
第3代试剂可检测到HIV-1 IgM抗体，窗口期为3～4周。
第4代试剂是一种HIV-1/HIV-2抗体与p24抗原的联合检测方法，窗口期为2～3周。
目前，我国HIV筛查普遍使用第3代试剂，也有部分地区使用第4代试剂，献血员的筛查使用第4代试剂，以提高输血的安全性。
2015年美国FDA批准了第5代试剂BioPlex 2200 HIV Ag-Ab assay用于临床HIV筛查，此试剂采用多重磁珠流式免疫测定的方法，可同时定性检测并准确区分HIV-1抗体、HIV-2抗体和p24抗原，可用于诊断HIV-1急性感染[2]，但在公共卫生领域中尚未广泛使用。
第5代试剂目前在中国未获得国家药品监督管理局（NMPA）批准。
HIV抗体筛查——斑点免疫胶体金快速试验
HIV抗体筛查——斑点免疫胶体金快速试验
【申请单】请完成申请单所要求项目
×××市人民医院检验申请单
姓名
性别年龄
门诊号住院号
诊断或症状
检验标本
检验目的
送检科室医师
送检日期年月日
【方法选择】
表12-1 HIV抗体筛查方法
方法ELISA法CLIA 快速检测（RT）
本次检查选择√（斑点免疫胶体金快速试验）
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附实验
CLIA: chemiluminescent immunoassay 化学发光免疫分析法;
快速检测（RT）：①颗粒凝集试验（particle agglutination test ，PA）
②斑点EIA或称斑点ELISA（dot-EIA）；
③斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验；
④艾滋病唾液检测卡；
⑤其它快速筛查试验方法。
【材料准备】
1.人类免疫缺陷病毒（HIV 1/2）抗体检测试剂盒（胶体金法）
2.检测样品：全血/血清/血浆
【操作方法】
1.检测前仔细阅读说明书。
2.使用前将试剂盒、待测样本、质控品恢复室温后方可使用。
待一切准备后就绪之后再撕开试剂盒的包装铝箔袋。
3.加样：用加样吸管吸取血清或血浆样品，往试剂盒加样孔内垂直滴加一滴，然后立即。
医学检验部分简答和名词解释
免疫应答主要分为哪几个阶段？1）识别阶段2）活化和增值阶段3）免疫效应中枢免疫器官和外周免疫器官有哪些器官组成？各有什么功能？1）中枢免疫器官：免疫细胞发生、分化、成熟的场所，如骨髓，胸腺2)外周免疫器官：免疫细胞产生应答的场所。
如脾脏，淋巴结，黏膜，扁桃体等。
T细胞、B细胞和NK细胞的主要功能分别是什么？1）T细胞：介导细胞免疫，辅助体液免疫。
2）B细胞：产生体液免疫3）NK细胞：介导天然免疫，发挥细胞毒作用。
根据作用方式及其特点的不同，机体存在两类免疫简述各自的概念和特征？1)先天性免疫或固有性免疫，是个体出生是就具有的天然免疫，可通过遗传获得，是机体在长期进化过程中逐渐建立起来的主要针对入侵病原体的天然防御功能。
其主要特征是反应迅速，针对外来异物的范围较广，不针对某个特定异物抗原，也称非特异性免疫。
2)适应性免疫，是个体出生后，接触到生活环境中的多种异物抗原，并在不断刺激中逐渐建立起来的后天免疫，也称获得性免疫。
其主要特征是针对某个特定的异物抗原而产生免疫应答，开始的应答过程比较缓慢，一旦建立清除该抗原的效率很高，特异性很强，也称特异性免疫。
简述抗原抗体反应的原理。
答：抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原表位与抗体超变区分子间的结构互补性与亲和性，这种特性是由抗原、抗体分子空间构型所决定的，它们之间的结合是抗原表位与抗体超变区沟槽分子表面的结合简述抗原抗体反应的类型。
答：抗原抗体反应分为五种类型：①颗粒性抗原与相应抗体结合所产生的凝集反应；②可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应；③抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应；④细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应；⑤免疫标记的抗原抗体反应等。
什么是带现象?答：在抗原抗体反应等价带前后，由于抗体或抗原过量(形成前带或后带)，上清液中可测出游离的抗体或抗原，形成的沉淀物少，不出现可见反应，这种现象在做血清学试验时称为带现象。
影响抗原抗体反应的环境条件有哪些?在实验中如何控制这些条件因素?答：环境条件包括：电解质，酸碱度和温度。
全国艾滋病检测技术规范(2015年修订版)
附件1全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2015年修订版）中国疾病预防控制中心二○一五年十二月全国艾滋病检测技术规范National Guideline for Detection of HIV/AIDS（2015年修订版）中国疾病预防控制中心二○一五年十二月前言艾滋病在我国的流行已数十年，随着感染者和临床病人的不断增加、感染人群的变化，艾滋病检测工作量逐渐加大，对监测和检测的需求也不断增加，承担艾滋病检测的实验室已遍及全国各级医疗、疾病预防控制、采供血、妇幼保健机构，出入境检验检疫、军队等各个系统。
为了尽早发现HIV感染者和艾滋病病人，及早提供咨询、治疗，同时为适应基层艾滋病检测工作需求，在新的形势下，根据《关于艾滋病抗病毒治疗管理工作的意见》、《中国预防与控制艾滋病中长期规划（1998—2010年）》、《中国遏制与防治艾滋病十二五行动计划的通知（国办发[2012]4号）》、“四免一关怀”等国家艾滋病防治重要方针政策和十三五防治工作重点，在广泛征求各省、市疾病预防控制机构和医疗机构意见的基础上，在中华人民共和国卫生和计划生育委员会艾滋病专家及省级专家的参与下，中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心对《全国艾滋病检测技术规范（2009年版）》进行修改、增补和完善，制定出《全国艾滋病检测技术规范（2015年版）》（以下简称《规范》），使其既能满足目前艾滋病检测工作的实际需求，又能体现检测技术的发展。
本次《规范》修订工作立足于我国目前检测状况，结合发达国家使用的指南，主要对以下几个方面内容进行了修改、增补和完善：（1）完善了不同的检测策略，并将其整合为独立的一章；（2）增加了HIV-1新发感染检测一章；（3）新增补充试验概念,其内容包括抗体确证试验（WB，RIBA/LIA等）和核酸试验（定性和定量试验）；（4）增加了第4代试剂（抗原抗体联合检测试剂）的检测流程；(5)增加核酸检测流程；(6)完善了检测报告。
丙型肝炎检测
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（四）检测结果的解释
1、阴性结果的解释 由于目前抗原检测试剂的灵敏度较低，最灵敏的
检测试剂只能达到相当于500 IU/ml水平的HCV RNA，因此阴性的结果并不能排除HCV现症感染 的可能。 2、阳性结果的解释
现阶段，HCV抗原阳性仅作为HCV感染的辅助诊 断依据，不能据此确诊。特别是对处于“灰区” 的阳性结果，需要结合临床表现及HCV RNA、抗HCV等检测结果来解释。监测病程进展或抗病毒 治疗效果应进行HCV抗原的定量检测 。
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（二）抗体补充试验
抗体补充试验目前常用的为免疫印迹试验。 免疫印迹法试剂一般将 HCV不同编码区抗 原多种成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并 设置了两种不同浓度的人IgG对照带和一条 hSOD对照带，用于内部对照和结果判断。 其 诊断HCV感染的敏感性高、特异性强， 可检测针对HCV不同编码区抗原的抗体，且 不需要特殊的仪器设备。
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（三）抗-HCV检测策略及结果报告
1、 疫情监测相关的检测策略及结果报告
先用筛查试剂-1进行初筛试验，结果呈 阴性反应，报告“抗-HCV阴性”，不再进 行复检试验；结果呈阳性反应，进入复检 试验。
所有初筛阳性反应的样品使用筛查试剂-2 进行复检，结果呈阴性反应，报告“抗HCV阴性”；结果呈阳性反应，报告“抗HCV阳性”。
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3 胶体金法快速试验
（1） 免疫渗滤试验：斑点免疫胶体金快速试验以 硝酸纤维膜为载体， HCV抗原点状固定在膜上， 加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有 色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质 控点必须显色。
（2）免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HCV抗 原线状固定在膜 上，待检样品沿着固相载体迁移， 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效 试验的质控线必须显色。
HIV抗体检测与质量控制
快速检测（RT）及其它检测试验
酶联免疫吸附试验（ELISA）
HIV抗体检测试剂（第三代）：检测HIV-1/2抗
体
HIV抗原抗体联合检测试剂（第四代）：可同时
检测血液中HIV-1P24抗原和HIV-1/2抗体
用酶标仪测定结果
有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定
ELISA试验中可能出现的问题和原因分析
问题 可能的原因（非试剂盒本身的原因） 1.加样本及试剂量不准 2.加样过快，孔间发生污染 3.加错样本 测定的重复性差 4.加样本和试剂时，加在孔壁上部非包被区 5.温育时间、洗板、显色时间不一致 6.酶标仪滤光片问题
ELISA试验中可能出现的问题和原因分析
问题 可能的原因（非试剂盒本身的原因） 1.漏加酶结合物 白板（阳性对照 2.洗液配制问题，量筒不干净含酶抑制物 不显色） 3.漏加显色剂A或B 4.终止液当显色剂使用 1.洗板不干净 全部板孔都有显 2.加底物的吸头被酶污染 色 3.洗板液受酶污染
病毒特点
HIV病毒主要攻击人体的辅助T淋巴细胞系统； 一旦侵入机体细胞，病毒会和细胞整合在一起 终生难以消除；病毒基因变化多样；广泛存在 于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、 尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液 ，其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高 ；对外界环境的抵抗力较弱，对乙肝病毒有效 的消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效；感染者 潜伏期长、死亡率高；艾滋病病毒的基因组比 已知任何一种病毒基因都复杂。
体外生存
人类免疫缺陷病毒在人体外生存能力极 差，不耐高温，抵抗力较低，离开人体 不易生存，常温下只可生存数小时至数 天。 HIV对热敏感。在56℃条件下30分钟即 失去活性，但在室温保存7天，仍保持活 性。
几种HIV抗体免疫检测技术
几种HIV抗体免疫检测技术艾滋病全称：获得性免疫缺陷综合征，英文简写：HIV，是一种危害性极严重的传染病，是因为受到HIV病毒感染所导致的疾病，HIV病毒是一种以攻击人体免疫系统的病毒。
目前我国的艾滋病患病率一直呈现出上升的趋势，面对这种情况就需要采取相应的措施以控制艾滋病患病率上升的趋势，此刻便对我国现目前的几种HIV抗体免疫检测技术方法进行科普，通过几种HIV抗体免疫检测技术使得医院能够尽早的发现HIV病感染者，对其进行相应的治疗和健康教育，避免HIV病毒的传染传播。
一、ELISA和WB检测技术ELISA：此种检测技术，主要是以病毒抗原包被反应板，运用间接法原理检测HIV抗体，其中这种检测技术拥有四代试剂：第一代ELISA试剂：抗原是HIV全病毒裂解物，特点是能够有效地检测出HIV，存在一定的假阳性率。
第二代ELISA试剂：抗原在细菌或者是真菌当中表达的人工重组HIV抗原或化学合成的HIV 抗原多肽，特点是单一性的抗原取代了多样性的混合抗原，其特异性要比第一代ELISA试剂好。
第三代ELISA试剂：合成的HIV抗原多肽（有些用了重组抗原），特点是应用了双抗原夹心法原理来检测HIV抗体，能够同时检测HIV-1 IgG、IgM、IgA 抗体，并且其敏感性与特异性都要比第一代ELISA试剂和第二代ELISA试剂还好。
第四代ELISA试剂：第四代ELISA试剂主要是在第三代的基础上针对P24抗原和HIV-1抗原一起包被固相载体，特点是能够同时检测 HIV-1 IgG、IgM、IgA 抗体和P24 抗原。
WB检测技术：WB检测技术是属于体外检测和鉴定HIV抗体的方法，主要是用于确证ELISA 检测阳性的个体。
其原理是以病毒抗原、重组抗原或合成肽，在SDA-PAGE电泳后转至硝酸纤维素膜上，随后再与血清或血浆中的HIV的抗体结合，最后通过显色反应来确定条带的存在。
二、HIV抗体快速检测技术关于HIV抗体快速检测技术是建立在ELISA和WB的检测基础上发展的，其主要的特点是能够在较短的时间内通过相对简单的操作就能够及时并且较准确地得到检测结果。
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第21卷2期中国病毒学21（2）：116-120收稿日期：2005-09-12, 修回日期: 2005-12-07* 基金项目：湖北省科技攻关项目(2002AA303B01)作者简介：翟建新(1980－), 男, 河北省籍, 硕士研究生。
** 通讯作者.Corresponding author. Tel: 86-27-68754627; E-mail: wangyefu@翟建新, 等. 应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1，HIV-2 IgG抗体117 中图分类号: R511 文献标识码: A 文章编号: 1003-5125(2006)02-0116-05人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)主要分为两大型，HIV-1和HIV-2。
大部分HIV血清学诊断依靠检测抗HIV抗原的抗体，尤其是抗gag和env基因产物的抗体。
对大量HIV阳性样本的免疫印迹分析表明[1]，在血清中抗跨膜蛋白抗体和抗核心蛋白P24抗体与其他抗HIV抗体相比含量较高，是主要的HIV抗体。
抗膜蛋白抗体反应在整个感染期间持续高水平出现，而抗P24抗体随病程的发展，由于P24抗原浓度增高和免疫抑制作用，其浓度持续下降直到无法检测出。
因此，对上述抗体的免疫学检测有助于医生对病人是否临近或已进入AIDS期做出较可靠的判断[2, 3]。
对GP41和GP36的氨基酸序列分析表明，两者氨基酸序列的差异高达50％，这使得我们可以分别检测其抗体来区分两种类型病毒的感染。
但同时，两者之间又存在一定的交叉反应[4]。
传统的抗HIV抗体检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA），需要专用的仪器，且检测过程较繁琐耗时，通常需要48h至2周方能报告检测结果。
而HIV快速检测应使病人可以在初次就诊时就得到检测结果和医生的诊治及建议，从而大大减少病人的花费和等待的时间。
现有的HIV快速检测技术（主要基于免疫渗滤和免疫层析技术），检测指标较为单一，存在着灵敏度较低，准确性不高等问题。
ELISA法由于采用多种HIV抗原，提高了灵敏度，但由于种种原因，其假阳性率也随之增高[5, 6]。
因此，同步区别检测多种标志物对提高检测的灵敏度和准确性有着重要的意义。
基于以上的需要，本文在大肠杆菌中表达了5种HIV抗原蛋白，并制备了一种可以同步检测不同种类抗HIV-1和HIV-2抗体的HIV快速诊断试纸。
此方法不需要任何仪器，整个操作均在室温下进行，耗时不超过5min。
此诊断试纸可以同步检测并区分HIV-1和HIV-2感染，并为了解HIV感染者的病情及其预后可提供较为可靠的诊断依据。
1 材料与方法1.1实验材料大肠杆菌（E.coli） DH5α、BL21(DE3) 及pNL4-3（含HIV-1的全基因组序列），表达载体pET28-a均为本实验室保存。
Taq酶购自promega 公司。
限制性内切酶，T4连接酶购自华美生物工程公司。
葡萄球菌蛋白A购自北京本元正阳基因技术股份有限公司。
硝酸纤维素膜购自武汉生命科技有限公司。
氯金酸购自上海试剂一厂。
引物由上海生物工程公司合成，（引物序列见表1）。
表1 引物序列及其在HIV基因组中的位置Table 1 Primer sequences and their location in HIV-1/2 genomes1.2 HIV抗原表达载体的构建基因操作参照文献[7]。
1.3 重组蛋白的表达与抗原性鉴定按照常规方法进行IPTG诱导表达及纯化。
SDS-PAGE分析表达产物及纯化蛋白。
以HIV阳性血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗，用 Western blotting 和ELISA方法鉴定重组蛋白的抗原性。
1.4 胶体金与金标SPA的制备参照Frens等[8]的方法制备粒径约在15nm的胶体金溶液。
金标SPA的制备参照文献[9]。
1.5 胶体金免疫渗滤检测试纸的设计和制备检测试纸的模式设计和结果示意如图1所示。
各取 2 µL不同HIV抗原蛋白（浓度约1mg/mL，gp120为蛋白gp120C和gp120V3的混合溶液）及1mg/mL人IgG，BSA溶液按图1A 所示阵列点在1.5×1.5cm的硝酸纤维素膜上，分别作为检测点和质控点。
室温下放置，待其干燥后用脱脂奶封闭。
洗涤、干燥后将其装入免疫渗滤装置板内。
图1B中，检测点1，2，4显色分别表示抗gp41，p24和gp120抗体为阳性，即HIV-1阳性结果。
图Primer Sequence(5’～3’)Location inHIV-1(HXB2)and HIV-2 (ROD)genomesP24a CAAGAATTCCCTATAGTGCAGAACCTC 1186~1203bp P24b ATTCTCGAGTTAGCTCATTGCTTCAGC 1879~1893bp P41a GAAGAATTCGCAGTGGGAATAGGAG 7758~7773bp P41b TTATCTCGAGCAGCCAATTTGTTATGTT 8244~8261bp P120Ca GACGAATTCACACTCCCATGCAGAATAA 7467~7485bp P120Cb AAGCTCGAGAGCTCCTATTCCCACTGC 7758~7775bp P120V3a ATTGAATTCCATTATTGTGCCCCGG 6870~6885bp P120V3b TAGCTCGAGGTTATAAAGTGGCATTCC 7237~7250bp P36a TTAGAATTCGTGTTCGTGCTAGGGTTC 7683~7700bp P36b AATCTCGAGGACCCAGGAGGTTAAGTCA 8150~8168bp118 中国病毒学第21卷1c中，检测点3显色表示抗gp36抗体为阳性，即HIV-2阳性结果。
此结果表明该检测试纸可以同步检测并区分HIV-1/2感染。
图1 检测点及结果模式图Fig.1 Formats of Detection dots and resultsA：Detection dots: 1, gp41; 2, p24; 3, gp36; 4, gp120; 5, Negative control; 6, Positive control; B：HIV-1 positive format; C：HIV-2 positive format; D：Negative result format.1.6 检测过程PBST溶液润洗膜片，然后均匀、缓慢滴加40µL 待检血清（若有聚集物必须先离心除去）。
渗过后，用PBST溶液洗膜，再滴加50µL金标SPA溶液，质控点显色后立即加PBST溶液2～3滴洗膜。
检测点显红色者，其对应HIV抗体为阳性；仅阳性质控点（人IgG）显色者为HIV抗体阴性。
2 结果2.1 重组质粒的构建与鉴定四种HIV-1基因片段来自质粒pNL4-3；HIV-2跨膜蛋白gp36基因来自HIV-2毒株(HIV-2 MVP- 15132)cDNA。
各基因片段通过PCR扩增得到。
扩增产物及表达载体pET28-a用Eco RⅠ和XhoⅠ双酶切、回收和连接分别得到重组质粒pET-p24、pET-41、pET-120C、pET-120V3和pET-36（如图2所示）。
2.2 各HIV基因片段表达产物及纯化后蛋白的SDS-PAGE鉴定对表达产物的SDS-PAGE分析结果（图3）表明各表达蛋白均存在于沉淀中。
其中gp120V3表达菌体不能完全溶于SDS-PAGE上样缓冲液，但可溶于6M盐酸胍溶液。
p24的纯化则还可采用柱上复性技术，最后用含250mmol/L咪唑的磷酸缓冲液(pH8.0)洗脱，可得到无变性剂存在的可溶性蛋白溶液。
纯化蛋白的SDS-PAGE分析见图4A。
图2 重组表达载体的构建Fig.2 Construction of recombinant expression plasmids图3 重组蛋白表达图谱Fig.3 SDS-P AGE profile of products expressed by Recombinant plasmidsProteins were expressed in E.coli. BL21(DE3) following induction with 1mM IPTG for 5h and subjected to SDS-PAGE(15% gel). Lane 1, pET-120V3; 2, pET-120C; 3, pET-36; 4, pET-41; 5, pET-p24; 6, pET28a; 7, standard Protein molecular weight marker.2.3 HIV基因表达产物的抗原性鉴定将各纯化后的重组蛋白经SDS-PAGE分离后，从凝胶电转移至硝酸纤维素膜上。
用HIV-1阳性血清与HIV-1重组蛋白GP41，P24，GP120C，GP120V3反应，HIV-2阳性血清与蛋白GP36反应，结果表明5种重组蛋白与相应血清可发生特异性反应（图4B）。
HIV-1的四种抗原中，以P24和GP41反应最强，GP120C次之，GP120V3反应最弱。
GP36与GP41序列相当，也有较强的反应。
将各抗原稀释至10 µg/mL包被酶标板，分别翟建新, 等. 应用斑点金免疫渗滤试验快速同步检测抗HIV-1，HIV-2 IgG抗体119检测100倍稀释的3份HIV-1阳性血清（与HIV-1重组蛋白反应），1份HIV-2阳性血清（与gp36反应）和3份阴性血清，结果显示各融合蛋白均能与相应HIV阳性血清反应，但反应强度有所差异。
图4 纯化蛋白的分析Fig.4 Analysis of purified fusion proteins by reduced SDS- PAGE and Western blot assayA: SDS-PAGE. Lanes 1~5 show fusion proteins gp120V3, gp120C, gp36, gp41 and p24 respectively; 6, standard protein molecular weight marker. B: Western blotting of Purified Proteine. 1, standard protein molecular weight marker; 2, P24; 3, GP41; 4, GP120V3; 5, GP120C; 6, GP36.2.4 胶体金及胶体金标记SPA的透射电镜鉴定结果取10µL胶体金滴于铜网上，滤纸吸干水分，在透射电镜（TEM）下进行观察（电镜照片见图5a)，所制胶体金大约为15nm±2nm，颗粒为圆形，较为均匀，且单分散性较好。