热带念珠菌对氟康唑耐药机制的初步研究
真菌检测的临床意义
2.8
2.9 4.2 3.9 3.0 3.3 4.2 3.6
71.5 68.1 70.4 78.9 80.2 78.1 79.2 77.8
白色、热带、近平滑念珠菌对氟康唑的敏感性仍较好，但是光滑和克柔的耐药率高。
Pfaller. J Clin Microbiol 2005
2002～2006年北京协和医院152例肺真菌感染中确诊38例：曲 霉39.5%，隐球菌34.2% 、毛霉10.5%，念珠菌仅5.3%
总之，目前仍以念珠菌感染为主，但发病呈下降趋势，白念减 少，克柔念和光滑念增多；曲霉比例逐年增高，可能成为主要 病原菌
存在争议，主要因诊断标准不同，国外以组织病理学或组织培养为 确诊依据，我国以痰或BALF培养为依据
支气管液
Mucor species - Microscopic Morphology, 400x Lactophenol cotton blue 大型孢子囊,无囊托,无
匍 菌丝及假根
真菌培养
结果可靠 可进行分类鉴定到种，可进行药敏试验 无菌部位分离出任何菌株，在未得到可靠证
据证明其污染时，不应确诊为污染。 有菌部位来源标本经两次或以上培养为同一
+/— ——
犁头霉/毛霉
/
—— ——
根霉
+++ ——
多烯类
++ ++（高MIC） —— ++（脂质） +/— +/—
+++（脂质）
—无活性；+/—可能有活性； +有活性，三线（至少临床有效） ++有活性，二线（作用稍差）；+++有活性，一线（常常有效）
抗真菌耐药性的全球问题:流行、机制与管理
抗真菌耐药性的全球问题：流行、机制与管理黄郑雨【摘要】所有严重的真菌感染都需要适当的抗真菌治疗才能取得成功.目前只有少数几类抗真菌药物可用.单一药物耐药性和多药耐药性严重妨碍了对病人的治疗.念珠菌和曲霉的唑类药物耐药是临床上最大的挑战之一,其次是念珠菌属(尤其是光滑念珠菌)的棘白菌素耐药和多药耐药.农业衍生的耐唑烟曲霉以及多重耐药耳道白色念珠菌的出现和传播给人类健康带来了新的威胁.耐药的分子机制在不太敏感菌株中自然发生,并在敏感菌株中快速获得.耐药机制包括药物与靶标相互作用的改变,药物外排泵介导降低细胞内药物浓度,以及与生物膜相关的通透性屏障.虽然耳道念珠菌天生多药耐药,但其它菌株通常通过逐步选择耐药机制而产生多药耐药性.药物处理引起的细胞应激反应促进了细胞的适应,从而导致细胞耐药性的出现.控制耐药性的举措包括有效的抗真菌药物管理计划,快速真菌诊断,治疗药物监测和临床干预.开发更好的诊断工具和有针对性地使用抗真菌药物的策略,对于保持药物效力至关重要.【期刊名称】《国外医药（抗生素分册）》【年(卷),期】2018(039)005【总页数】8页(P前插1-前插2,357-362)【关键词】耐药性;流行;机制;管理【作者】黄郑雨【作者单位】西南大学药学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】R978.51 前言真菌病原体可引起危及生命的侵袭性疾病(如真菌血症、脑膜炎、肺炎)、严重的慢性疾病(如慢性肺曲霉菌病、过敏性支气管肺曲霉菌病)和复杂的慢性呼吸道疾病(如哮喘、慢性阻塞性肺病)。
这些病原体还会引起反复感染，如口腔和阴道念珠菌病。
病人的免疫抑制是罹患侵袭性真菌感染的重要原因。
这些感染常伴随高死亡率，成功的临床治疗效果需要早期诊断和有效的抗真菌治疗。
然而，抗真菌药物的选择很少，治疗侵袭性疾病的药物仅限于唑类化合物、棘白菌素、多烯类和氟胞嘧啶。
过去的十年，毒性较小药物的开发为抗真菌预防使用和疾病治疗做出了贡献，然而这反过来又导致了耐药性的增加。
念珠菌耐药机制的研究进展
念珠菌耐药机制的研究进展贺小圆;赵明峰【摘要】In recent years,the incidence and mortality of fungal infection,especially the opportunistic fungal infection have been increasing.This is mainly associated with antifungal resistance and the restricted number of available antifungal drugs.Candida species are opportunistic fungi in human body.The common antifungal resistance mechanisms include the changes of the target enzyme,the lack of target site,the drug permeability decline of fungal cell membrane,the increased expression of multi⁃drug resistance protein,the change of cholesterol synthesis bypass,the biofilm formation and so on. The latest literature reports that secreted aspartic proteinases have a role in antifungal resistance of Candida spp..In this article,the epidemiology of Candida spp.infection and its possible antifun⁃gal resistance mechanisms are reviewed briefly.%近年来，真菌感染尤其是机会性真菌感染的发生率和病死率呈不断上升的趋势，这主要与真菌耐药和抗真菌药物品种有限有关。
克柔念珠菌对抗真菌药物耐药机制的研究进展
近年 来 ， 随着 器官 移植 和各 种侵 入性 诊 疗 技术 的普遍开展 ， 广谱抗生素 、 免疫抑制剂 和糖皮质激
楚， 可能 与 以下 因素有 关 。
１ 药 物作 用靶 酶基 因 Ｅ Ｇ １突 变或 过度 表达 Ｒ １
素类药物在临床广泛应用 ， 免疫缺 陷患者 ， 尤其 是 艾滋病患者不断的增多 ， 侵袭性真菌感染 的发病率 和死 亡率 不 断 上 升 … 。侵 袭 性 真 菌 感 染 主要 是 由
【 摘要 】 近年来 ， 克柔念珠菌感染 明显 增加 ， 对抗真菌 药物尤其是 唑类药 物 的耐 药现象 越来越严 重 ， 深入研 究其 耐药机 制 已引起 高度关 注。克柔念珠菌耐药机制可 能与以下因素有关 ： 唑类 药物作用 靶酶结构 的改变 、 真菌细胞 膜上外排 泵过度表
达、 真菌细胞 内药物 蓄积 减少 等。克柔念珠菌对唑类 的耐药 可能是多种耐药机制共 同作用 的结果 。
ＱＡ ｕｓａ Ｆ Ｎ ｎ１ Ｉ Ｏ Ｚ — ，Ｅ Ｇ Ｗｅ 一 ｈ ｉ （ ｐ ｒ ｅｔｆＤ ｒ ａｏｅｅｅｌ ｙ ｔｅ ｅｏ ｄＨ ｓｉ ｌ Ｓ ａ ｘ ｄｃｌＵ ｉ ｒｔ ，ａ ｕ ｎ０ ０ ０ ， ｈｎ ） Ｄｅａｔ ｎ ｅｍ ｔ ｎｒ ｏ ， ｃｎ ｏｐｔ ｈ ｎ ｉ ｍ ｏ ｖ ｏｇ ｈＳ ａｏ ｆ Ｍｅ ｉ ｎｖ ｓ ｙ Ｔ ｉ ａ ３０ １ Ｃ ｉａ ａ ｅｉ ｙ
用唑类抗真菌药物 ， 使得住院患者念珠菌感染的流 行病 学发 生 变化 ， 白念珠 菌 感 染 呈 下 降趋 势 ， 对 而 氟康 唑敏 感性 差 的非 白念珠 菌 ， 尤其 是 对氟 康 唑 天 然耐 药 的克柔 念珠 菌 的感染 出现升 高趋 势 。克 引
柔 念珠 菌 的毒 力虽 比 白念珠 菌 弱 ， 它凭 借 对 非 生 但
白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究
㊃论著㊃白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究封小川1,2 元航1 郑莹莹1,3 白江苗1 张欠欠1(1.延安大学医学院,延安716000;2.延安市人民医院,延安716000;3.延安大学附属医院,延安716000)ʌ摘要ɔ 目的 通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G 11㊁C D R 1㊁C D R 2和MD R 1的表达水平及其与耐药的关系,旨在对本地区以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病的防治提供依据㊂方法 选取延安地区两家三甲医院临床确诊的对氟康唑耐药及敏感的白念珠菌各10株,扩增其靶酶编码基因E R G 11,分析突变位点;使用荧光染料罗丹明6G 分析耐药组与敏感组菌株的外排情况;采用荧光定量P C R 检测白念珠菌外排泵编码基因的表达水平㊂结果 E R G 11扩增测序结果显示,耐药菌株C 3号虽发生了碱基位点突变,但并未引起编码氨基酸的改变,耐药菌株C 7号及敏感菌株C 12号发生了碱基位点的突变,引起编码氨基酸的改变;荧光染料罗丹明6G 检测白念珠菌外排实验结果显示,耐药菌和敏感菌无论加入葡萄糖与否外排均存在显著差异,且耐药组加入葡萄糖较未加入葡萄糖外排量明显增加,差异有统计学意义(P <0.01);R T -P C R 检测外排泵基因结果显示,C D R 1与C D R 2外排泵基因表达水平在耐药菌与敏感菌之间差异有统计学意义(P <0.05)㊂结论 研究基因表达及外排泵功能检测结果均表明,本地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变㊂ʌ关键词ɔ 氟康唑;耐药机制;E R G 11;C D R 1;C D R 2ʌ中图分类号ɔ R 379.4 ʌ文献标志码ɔ A ʌ文章编号ɔ 1673-3827(2023)18-0481-06S t u d y on t h e m e c h a n i s m o f f l u c o n a z o l e r e s i s t a n c e i n C a n d i d a a l b i c a n s F E N G X i a o c h u a n 1,2,Y U A N H a n g 1,Z H E N G Y i n g y i n g 1,3,B A I J i a n g m i a o 1,Z HA N G Q i a n qi a n 1(1.M e d i c a l C o l l e g e o f Y a n a n U n i v e r s i t y ,Y a n a n 716000,C h i n a ;2.Y a n a n P e o p l e s H o s p i t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a ;3.Y a n a n U n i v e r s i t y A f f i l i a t e d H o s pi t a l ,Y a n a n 716000,C h i n a )ʌA b s t r a c t ɔ O b je c t i v e T o s t u d y t h e e x p r e s s i o n l e v e l s of f l u c o n a z o l e r e s i s t a n tg e n e s E R G 11,C D R 1,C D R 2,a n d MD R 1i n C a n d i d a a l b i c a n s a n d th ei r r e l a t i o n s h i p w i t h d r u g re s i s t a n c e ,a n d t o p r o v i d e a b a s i sf o r t h e p r e v e n t i o n a n d t r e a t m e n t o f i n v a -s i v e c a n d i d i a s i s m a i n l y c a u s e d b y C a n d i d a a l b i c a n s i n f e c t i o n i n t h i s r e gi o n .M e t h o d s T e n f l u c o n a z o l e r e s i s t a n t s t r a i n s a n d 10f l u c o n a z o l e s e n s i t i v e s t r a i n s w e r e s e l e c t e d f r o m e a c h h o s p i t a l i n t w o t e r t i a r y a n d f i r s t -c l a s s h o s p i t a l s i n Y a n 'a n a r e a .A m -p l i f y i n g t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g g e n e E R G 11,a n a l y z i n g t h e m u t a t i o n s i t e s ,f l u o r e s c e n t d y e u s i n g rh o d a m i n e 6G w e r e u s e d t o a n a l y z e t h e e f f l u x o f s t r a i n s f r o m d r u g r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e g r o u p s .T h e n ,f l u o r e s c e n c e qu a n t i t a t i v e P C R w a s u s e d t o d e -t e c t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e e n c o d i n g t h e e f f l u x p u m p o f C a n d i d a a l b i c a n s .R e s u l t s E R G 11a m p l i f i c a t i o n a n d s e -q u e n c i n g r e s u l t s s h o w e d t h a t a l t h o u g h t h e r e s i s t a n t s t r a i n C 3h a d a b a s e s i t e m u t a t i o n ,i t d i d n o t c a u s e c h a n g e s i n t h e c o d i n ga m i n o a c i d .T h e r e s i s t a n t s t r a i n C 7a n d t h e s e n s i t i v e s t r a i n C 12h a d ab a s e s i t e m u t a t i o n ,c a u s i n g c h a n g e s i n t h e c od i n g am i -n o a c i d ;f l u o r e s c e n t d ye r h o d a m i n e 6G w a s u s e d t o d e t e c t t h e ef f l u x o f C a n d i d a a l b i c a n s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e f f l u x o f r e s i s t a n t i s o l a t e a n d s e n s i t i v e i s o l a t e w e r e s ig n i f i c a n t l y d i f f e r e n t wh e t h e r g l u c o s e w a s a d d e d o r n o t ,a n d t h e e f f l u x o f d r u gr e s i s t a n t i s o l a t e w i t h g l u c o s e w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t w i t h o u t g l u c o s e ,a n d t h e d i f f e r e n c e w a s s t a t i s t i c a l l y s i gn i f i -c a n t (P <0.05);t h e R T -P C R d e t e c t i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s s h o w e d a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f C D R 1a n d C D R 2e f f l u x p u m p g e n e s b e t w e e n d r u g-r e s i s t a n t a n d s e n s i t i v e i s o l a t e (P <0.05).C o n c l u s i o n T h e r e -s u l t s o f g e n e e x p r e s s i o n a n d e f f l u x p u m p f u n c t i o n t e s t i n g i n t h i s s t u d yi n d i c a t e t h a t t h e r e s i s t a n c e m e c h a n i s m o f C a n d i d a a l -b i c a n s t o f l u c o n a z o l e i n t h i s r e g i o n w a s m a i n l y r e l a t e d t o o v e r e x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e s ,a n d n o s i g n i f i c a n t m u t a t i o n s w e r e f o u n d i n t h e t a r g e t e n z y m e c o d i n g ge n e s .基金项目:陕西省重点研发计划项目(2021S F -230);榆林市科技项目(C X Y -2020-064);延安大学校产学研项目(C X Y 202121)作者简介:封小川,女(汉族),硕士,主治医师.E -m a i l :x i a o c h u a n 880112@163.c o m 通信作者:张欠欠,E -m a i l :z h a n g q i a n yd @163.c o m ㊃184㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6ʌK e y w o r d sɔf l u c o n a z o l e;d r u g r e s i s t a n c e m e c h a n i s m s;E R G11;C D R1;C D R2[C h i n J M y c o l,2023,18(6):481-486]近年来,世界范围内以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病呈上升趋势,全球S E N T R Y抗真菌监测显示,在欧洲,白念珠菌引起的感染占念珠菌属的52.5%㊁亚太地区为46.0%㊁拉丁美洲为43.9%㊁美国和加拿大为42.7%[1],我国流行病学调查显示[2-3],白念珠菌引起的感染占念珠菌属的65%,个别地区甚至大于70%,在免疫功能低下者和植入医疗设备的健康人中白念珠菌的感染率居首位,感染病死率高达68.9%[4],美国每年也会因置入导管引发的白念珠菌感染造成约10万人死亡[5]㊂美国感染病学会(I D S A)指出氟康唑是既往非粒细胞缺乏念珠菌血症患者初始治疗及I C U中高危患者侵袭性念珠菌感染预防的首选药物[6],在发展中国家,三唑类药物(如氟康唑等)是治疗侵袭性念珠菌感染尤其是白念珠菌感染的主要药物[7]㊂但随着氟康唑在临床上的长期广泛应用,致使白念珠菌对氟康唑的耐药性不断增强,据美国疾控中心(C D C)统计,在感染念珠菌患者的血液样本中,约有7%对氟康唑耐药[8]㊂全球S E N T R Y监测显示[9],白念珠菌对氟康唑的耐药率为11.9%,我国白念珠菌对氟康唑的耐药率小于6%,剂量依赖性敏感(S D D)率为4.35%[10],这势必给临床治疗白念珠菌引发的疾病过程中带来严峻考验㊂文献报道显示[11-13],白念珠菌对氟康唑耐药机制主要是靶酶编码基因E R G11的突变和外排泵编码基因过表达,但由于不同地区白念珠菌的感染及其耐药不同,其耐药机制亦不尽相同,因此,本文通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因E R G11㊁C D R1㊁C D R2和MD R1的表达水平及其与耐药的关系,探究延安地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制,对管理目前有限的抗真菌药物,以及为患者提供精准治疗服务至关重要㊂1材料和方法1.1材料菌株收集延安市两家三甲医院送检并经鉴定为白念珠菌且对氟康唑耐药和敏感的菌株各10株,耐药菌株编号C1-C10,敏感菌株编号C11-C20㊂标准质控菌株:白念珠菌A T C C90028㊂纳入标准:①经质谱鉴定为白念珠菌;②根据美国临床实验室标准化研究所(C L S I)判断标准[14],敏感(S):M I Cɤ8μg/m L,耐药(R):M I Cȡ64μg/m L,药敏结果复核为白念珠菌对氟康唑耐药及敏感菌株;③所有操作均符合实验室操作标准㊂主要试剂和仪器 Y e a s t O n e p l a t e真菌药敏板试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)(批号:280543)㊁T a q D N A聚合酶(北京百奥莱博科技有限公司)(批号:J N0015)㊁逆转录试剂盒(广州赛国生物科技有限公司)(批号:70060000)㊁罗丹明6G(西亚化学试剂商店)(批号:20211115)㊁V I T E K M S全自动快速质谱微生物检测系统(法国梅里埃公司)㊁A B I7300型全自动荧光定量P C R 仪(美国A B I公司)㊁C y t o m i c s500流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司)㊁N a n o d r o p O n e超微量分光光度计(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)㊁T a n o n3500型凝胶成像分析系统(上海天能有限公司)㊂1.2方法E R G11基因扩增并测序白念珠菌D N A的提取:菌株培养㊁离心后,提取出白念珠菌D N A,与5μL样品混合均匀后进行电泳约55m i n,应用电脑成像系统进行凝胶相片拍摄㊂以G e n B a n k公布的白念珠菌标准菌株E R G11基因序列数据为准, P C R引物设计:E R G11F:5 -A T G G C T A T T-G T T G A A A C T G T C A T T G-3 (第1~25位)㊁E R G11 R:5 -T T A A A A C A T A C A A G T T T C T C T T T T T-T C C-3 (第1560-1587位)㊂罗丹明6G在试验菌株中外排情况的测定①实验菌株经离心㊁预冷,重悬于P B S使葡萄糖耗尽,加入罗丹明6G后将试管放于冰面上,然后在菌液中加入P B S混合均匀㊁离心,用流式细胞仪进行分析记录,此时菌株的荧光强度设为外排前的起始荧光强度;②洗3次预冷P B S,将多余的罗丹明6G去除后分为两管,一管50μL菌液加入1m L P B S,另一管50μL菌液加入1m L P B S,离心加入P B S混合均匀,运用流式细胞仪分析,将未用罗丹明6G处理的菌株细胞的荧光强度作为自身荧光对照;③将摄取罗丹明6G之后的细胞荧光强度作为基底,分别减去加与不加葡萄糖外排之后的细胞㊃284㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6荧光强度,进行数据分析㊂白念珠菌外排泵基因表达的检测 白念珠菌外排泵基因引物序列见表1㊂表1 白念珠菌外排泵基因引物T a b .1 G e n e p r i m e r s o f C a n d i d a a l b i c a n s e f f l u x p u m p 序列名称片段片段大小18S r R N AF :5'-T CG G G G G T A T C A G T A -T T C A G T T G T C -3'83b pR :5'-T C C T T G G T A A A T G C T T T -C G C A G T A G -3'C D R 1F :5'-TG A C T C C T G C T A C C G T G T -T G -3'194b pR :5'-A C C T G G A C C A C T T G G A A -C A T -3'C D R 2F :5'-C C TG G A A G C A C A G T T G T C -C A -3'161b pR :5'-T C C C C C T T T T G C A T A G C A -C C -3'MD R 1F :5'-G G G T G C T G T T T G T G G T C C -T A -3'196b pR :5'-A C C G G T G A T G G C T C T C A A -T C -3'A C T 1F :5'-TG G A C G G T G A A G A A G T T G -C T -3'184b pR :5'-T T G G A T T G G G C T T C A T C A -C C A -3'P MA 1F :5'-A C CG T T G C C G A A T T T G C T T -C -3'194b pR :5'-G C A A T A C C A A C G G C A T C A -C C -3'白念珠菌总R N A 的提取 采用T r i z o l 法提取白念珠菌总R N A ,R T -P C R 扩增外排泵基因严格按照试剂盒说明书进行操作㊂P C R 反应条件:94ħ预变性3m i n ,94ħ变性10s ,55ħ退火20s ,72ħ延伸30s ,40个循环㊂收集荧光阈值(c yc l e t h r e s h o ld ,C t ),将核糖体基因18S r R N A 设定为内参基因,用相对定量әC t 表示(әC t =C t 目的基因-C t 18S )并进行分析,其中әC t 值越小,相对基因表达量越高,反之则越低,见图1及图2㊂1.3 统计学分析采用S P S S 25.0统计软件分析,计量资料均用 x ʃs 表示,采用t 检验,检验水准α=0.05,P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果2.1 E R G 11基因的检测结果实验菌株E R G 11基因P C R扩增的产物经纯图1 实验菌株R T -P C R 溶解曲线 图2 实验菌株R T -P C R 扩增曲线F i g.1 R T -P C R d i s s o l u t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n F i g.2 R T -P C R a m p l i f i c a t i o n c u r v e o f e x p e r i m e n t a l s t r a i n s 化并测序,测序结果与G e n B a n k 中的标准序列X 13296进行比对分析,发现氟康唑耐药的C 3号菌株第414位碱基发生了突变GңA ,但并未引起第118位氨基酸甘氨酸(G l y )密码子的改变;氟康唑耐药的C 7号菌株及对氟康唑敏感的C 12号菌株的第518位碱基发生了突变CңG ,引起第173位氨基酸密码子改变,致脯氨酸(P r o )变为精氨酸(A r g),见图3~6及表2㊂表2 白念珠菌E R G 11基因突变及对应氨基酸改变T a b .2 M u t a t i o n o f E R G 11g e n e a n d c o r r e s p o n d i n g am i n o a c i d c h a n ge s i n C a n d i d a a l b i c a n s 菌株编号碱基突变位点氨基酸变化C 3G 414A G 118G C 7C 518G P 173R C 12C 518GP 173R注:C 12为敏感菌株,C 3和C 7为耐药菌株㊂2.2 罗丹明6G 的外排情况结果显示,敏感株在摄取罗丹明6G 后,未加葡萄糖几乎不发生外排,加葡萄糖后略有外排,但二者比较差异无统计学意义(P >0.05);耐药株在摄取罗丹明6G 后,无论加葡萄糖与否均发生外㊃384㊃ 中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M yc o l ,D e c e m b e r 2023,V o l 18,N o .6图3白念珠菌E R G11基因扩增D N A凝胶电泳图图4耐药组白念珠菌C3碱基峰值图图5耐药组白念珠菌C7碱基峰值图图6敏感组白念珠菌C12碱基峰值图F i g.3 A m p l i f i e d D N A g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f C a n d i d a a l b i c a n s E R G11g e n e F i g.4 C3b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.5 C7b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n d r u g r e s i s t a n c e g r o u p F i g.6 C12b a s e p e a k o f C a n d i d a a l b i c a n s i n s e n s i t i v e g r o u p排,加葡萄糖较未加葡萄糖的外排量增加,二者比较差异具有统计学意义(P<0.01);将耐药组株对罗丹明6G的外排与敏感组菌株对罗丹明6G的外排量进行分析,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,差异具有统计学意义(P<0.01),见表3和图7㊂表3白念珠菌耐药组与敏感组罗丹明6G外排实验结果比较T a b.3 C o m p a r i s o n o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t r e s u l t s b e t w e e nd r u g-re s i s t a n t g r o u p a n d s e n s i t i v e g r o u p of C a n d i d a a l b i c a n s分组耐药组(n=10)敏感组(n=10)t P未加葡萄糖外排能力5.47ʃ0.530.45ʃ0.2327.621<0.01加入葡萄糖后外排能力7.77ʃ0.80.44ʃ0.2527.526<0.01 t-11.6020.44P<0.01>0.052.3 R T-P C R测定外排泵基因表达水平统计学分析显示,耐药组和敏感组肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1的表达水平相比较,差异无统计学意义(P >0.05);耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),图7敏感和耐药白念珠菌罗丹明6G外排实验结果F i g.7 R e s u l t s o f r h o d a m i n e6G e f f l u x t e s t o f s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t a n t C a n d i d a a l b i c a n s见表4和图8㊂表4白念珠菌主动外排泵基因在敏感组与耐药组相对表达水平的比较(әC t值)T a b.4 C o m p a r i s o n o f r e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f a c t i v e e f f l u x p u m p g e n e o f C a n d i d a a l b i c a n s b e t w e e n s e n s i t i v e g r o u p a n d d r u g r e s i s t a n t g r o u p外排基因耐药组(n=10)敏感组(n=10)t PC D R16.42ʃ0.905.00ʃ0.863.589<0.01 C D R27.75ʃ1.116.30ʃ1.033.040<0.01 MD R19.74ʃ0.719.05ʃ1.141.616>0.05 A C T18.15ʃ0.318.16ʃ0.42-0.030>0.05 P MA18.04ʃ0.118.07ʃ0.14-0.612>0.05㊃484㊃中国真菌学杂志2023年12月第18卷第6期 C h i n J M y c o l,D e c e m b e r2023,V o l18,N o.6图8敏感和耐药白念珠菌外排泵基因的表达量F i g.8 E x p r e s s i o n o f e f f l u x p u m p g e n e i n s e n s i t i v e a n d d r u g-r e s i s t-a n t C a n d i d a a l b i c a n s3讨论全世界每年由念珠菌引起的深部器官感染病例40万以上,病死率超过45%[15],尤其白念珠菌的发病率㊁致死率明显上升㊂唑类药物中的氟康唑是临床早期经验治疗白念珠菌感染尤其作为高危人群预防白念珠菌感染的首选药物,使其在人体内长期处于亚治疗水平,引起耐药性增加[16],白念珠菌耐药是目前临床治疗其感染失败的一个重要原因,研究报道,E R G11基因错义突变可使氟康唑抗真菌的作用靶点去甲基化酶C Y P51的血红素表面结合位点发生变化,从而使氟康唑无法与白念珠菌有效结合而致耐药[17],而且白念珠菌细胞膜上的外排泵活力增强也是白念珠菌对氟康唑耐药的主要机制之一[18]㊂本研究中靶酶编码基因E R G11的目的基因扩增测序中虽然引起氨基酸的改变,即耐氟康唑的C7号菌株及对氟康唑敏感的C12号菌株的第518位碱基发生了突变,引起第173位氨基酸密码子改变,致P r o变为A r g,但耐药及敏感菌株中均存在,虽为错义突变,但该突变没有发生在E R G11点突变的105-165㊁266-287㊁405-488氨基酸之间的3个 热点 区域[19],也不是既往文献报道的Y123F㊁K143R㊁F449V和G464S等多个与白念珠菌对氟康唑耐药有关的突变位点[20],推测这个位点的突变在白念珠菌对氟康唑耐药机制中为无意义突变,但此也不能表明该机制在本地区白念珠菌耐药性的产生中无作用,可能与样本量较少有关,尚需扩大样本量进行进一步研究㊂罗丹明6G作为白念珠菌细胞膜上活性流出系统的底物,具有无毒㊁易检测㊁易吸收入射光的能量等优点,准确测量白念珠菌中罗丹明6G的积累浓度值有利于选择抗性菌株中C D R1㊁C D R2㊁MD R1等基因的过度表达㊂研究结果显示,加入荧光染料罗丹明6G后,耐药组罗丹明6G的外排量明显高于敏感组,说明白念珠菌对氟康唑耐药为主动外排系统所致㊂为排除实验环境(如菌株的生长环境和R N A的抽提等)对外排泵基因的检测结果的影响,耐药组和敏感组加入肌动蛋白相关基因A C T1和质膜H+-A T P酶编码基因P MA1,比较其表达水平,差异无统计学意义(P>0.05),说明实验环境对外排泵基因的检测结果没有影响㊂耐药组C D R1和C D R2外排泵基因表达量较敏感组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),由此可知影响本地区白念珠菌对氟康唑耐药机制中最为重要的是其药物外排泵基因C D R1㊁C D R2过度表达,并且耐药组耐药基因C D R1㊁C D R2相对表达量均显著高于敏感株组,与文献报道结果相似[21-22]㊂分析原因主要是,C D R1的表达受顺式作用调控元件的控制,包括一个B E E(基础表达元件)㊁一个D R E(药物敏感元件)㊁两个S R E(甾醇调控元件)和一个N R E(负调控元件),而C D R2的表达仅受D R E的控制,在这些不同的元件中,只有D R E参与必需的C D R1和C D R2的高表达和对氟康唑外排的上调相反,MD R1基因不具有D R E元件,并且MD R1启动子也不直接与氟康唑反应[21]㊂综上所述,本地区白念珠菌的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变,由于白念珠菌对氟康唑耐药现象的产生并非由于单一机制的调控,且临床很多患者存在滥用抗真菌药物的现象,导致白念珠菌对氟康唑的耐药性不断提高,而新型抗真菌药开发缓慢,改善白念珠菌对氟康唑的耐药问题迫在眉睫,因此,我们急需进一步探索白念珠菌致病机制和耐药机制,寻找新的药物治疗靶点,探索新的治疗体系,提高患者的生存率㊂参考文献[1]P F A L L E R M A,D I E K E MA D J,T U R N I D G E J D,e t a l.T w e n t y y e a r s o f t h e S E N T R Y a n t i f u n g a l s u r v e i l l a n c e p r o-g r a m:R e s u l t s f o r C a n d i d a s p e c i e s f r o m1997-2016[J].O p e n F o r u m I n f e c t D i s,2019,6(S u p p l1):S79-S94. 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念珠菌耐药机制在分子水平上的研究进展
白念珠菌突变株 自发 回复成对药物敏感 的野生株
时 ，Ｄ ２的表 达 量 也 得 以恢 复 。Ｃ Ｒ 的表 达 受 多 ＣＲ Ｄ 种 因素的影响 ， 温度 、 物及 人皮质类 固醇等。 如 药 Ｋ ｓｎｍ ｒｙ等ｌ 对 念 珠 菌在 不 同条 件 下 Ｃ Ｐ Ｌ． ｉ ｆｈａ ｕｔ ｈ 一 ＤｍＲ Ｎ Ａ的 表 达 进 行 了 检 测 ， 现 当 温 度 升 高 时 ， 发 Ｃ Ｒｍ Ｎ Ｄ ｌ Ｒ Ａ呈迅 速 显 著 的增多 ， 但这 种 表达 的增 多
ห้องสมุดไป่ตู้
的 Ｃ Ｒｍ Ｎ Ｄ Ｒ Ａ及 其 编码蛋 白（ｄｐ含 量 约为氟 康唑 ｃｒ）
作 者 单位 ：３００兰 州医 学 院 第 二 附 属 医院 皮 肤 科 ７０ ３
奉文所用主要缩写 ： Ｄ ： Ｃ Ｒ 念珠菌耐药基因： Ｆ 主要易化子超 Ｍ： 家旌 Ｍ Ｉ 多种药物耐受基 因， ． Ｈ １ ． 甲基酶 ． Ｙ Ｓ …４ 击 Ｄ； Ｒ １ Ｄ ：４ 去 ４ ｏ Ｃ ＰＩ１ 甲基酶编码 基因 Ｆ ２ ： Ｒ 株 氟康唑耐药椿
是短暂的。他们 还发现将 念珠菌在含有眯唑类药 物、 雌二 醇或孕酮 的培养基 中培养 后 Ｃ Ｒ Ｒ Ａ 口 ． Ｄｍ Ｎ 也过度表 达 。
Ｍ Ｒ编 码 一 种 膜 转 运 蛋 白 ｍ ｒ。 — 属 于 Ｄ ｄ ｐ
积量下降 ， 但其对除氟康唑以外 的其他 咪唑类药物
的细胞 内累 积量 不发 生 变化 。他 们 还 发现 Ｆ ２株 Ｒ
维普资讯
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综述 ・
念 珠菌 耐 药 机 制 在分 子水 平 上 的研 究 进 展
3种方法检测念珠菌对氟康唑敏感性评价
3种方法检测念珠菌对氟康唑敏感性评价【摘要】目的：评价3种真菌药敏方法检测念珠菌对氟康唑敏感性的相关性，从而选择一种易于在各临床实验室开展、准确、简便的检测方法，以期更好的指导临床用药。
方法：分别用rosco纸片扩散法、液体培养基微量稀释法、atbfungus3浓度梯度法检测82株念珠菌对氟康唑的敏感性，以clsi推荐的微量肉汤稀释法作为参考方法。
结果：与液体培养基微量稀释法检测结果相比，rosco 纸片扩散法一致性为91.5%；atb浓度梯度法一致性为87.7%，均无一种方法敏感而其他2种方法为耐药或一种方法耐药而其他2种方法为敏感的严重误差。
结论：rosco纸片扩散法法对氟康唑的检测结果与clsi推荐的液体培养基微量稀释法相比符合率好，准确率高，监测的抗真菌药物种类多，更适合在临床实验室推广应用。
【关键词】念珠菌，氟康唑，真菌药物敏感试验近年来，机会性真菌感染发病率的不断上升及其耐药菌株的逐渐增多使真菌病的治疗面临着严峻的挑战。
氟康唑其作用机制是通过抑制14a脱甲基酶，使麦角固醇合成受阻，导致真菌细胞膜的完整性受损，从而发挥其抗真菌作用［1］。
但是氟康唑长期反复治疗易导致耐药菌株的出现，因此合理使用抗真菌药物和耐药性的检测具有重大意义。
但是，临床真菌药物敏感试验一直存在一些问题，如：现有的真菌药敏试验的可操作性和重复性不理想，需要进一步提高；真菌药敏折点需要改善；药敏试验的操作需要规范，并且需做好质量控制等。
因此，本研究通过比较3种不同药物敏感性方法检测念珠菌对氟康唑敏感性的相关性，从而选择一种易于在各临床实验室开展的准确、简便的检测方法，更好的指导临床用药。
材料和方法1．材料1.1实验菌株实验菌株来自广东省肇庆市皮肤病医院检验室2010年1月至2011年4月病人阴道分泌物等标本中分离出的82株念珠菌。
其中白念30株，热带15株，光滑23株，近平滑14株。
实验所用82株念珠菌的菌种构成如表1。
白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性分析
白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性分析李莉;苏天璐;苗翠;张文卿【摘要】Objective To investigate the resistance of Candida albicans to common used antifungals drugs .Methods NCCLS 2003 as assessment criteria were used to test the susceptibilities to 494 strains of Candida albicans with DISC diffusion method .Results The susceptibilities test showed 494 strains of Candida albicans were highly susceptible to Amphotericin B (96. 1％ ) and Nystatin (93.9％) ,were low susceptible to Miconazole (51.9％) .The main infected organs were respiratory tract and urinary tract .Candida albicans were highly resistant to common used antifungals drugs .Conclusion The resistant of Candida albicans to common used antifungals drugs showed a ascending trend and the resistant mechanism needs to study more .%目的了解白色念珠菌对临床常用抗真菌药物的耐药性.方法按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的酵母菌纸片扩散法敏感试验指南,对临床分离的494株白色念珠菌进行抗真菌药物的敏感性测定.结果 494株白色念珠菌对两性霉素B、制霉菌素敏感性最高,分别为96.1%和93.9%,对咪康唑的敏感性最低为51.9%;念珠菌常见临床感染部位为呼吸道,其次是泌尿道.白色念珠菌对唑类抗真菌药物存在较大的耐药性.结论白色念珠菌对常用抗真菌药物的耐药性呈上升趋势,其耐药机制有待于进一步研究.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2011(015)001【总页数】3页(P126-128)【关键词】白色念珠菌;抗真菌药物;耐药机制【作者】李莉;苏天璐;苗翠;张文卿【作者单位】青岛大学医学院附属青岛市立医院,山东,青岛,266011;青岛大学医学院附属青岛市立医院,山东,青岛,266011;青岛大学医学院附属青岛市立医院,山东,青岛,266011;青岛大学医学院【正文语种】中文【中图分类】R379.4白色念珠菌是人体皮肤、粘膜的正常寄生菌,也是临床重要的条件致病性真菌。
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热带念珠菌对氟康唑耐药机制的初步研究
作者：江雨璐， 王中新， 沈继录， Jiang Yulu， Wang Zhongxin， Shen Jilu
作者单位：安徽医科大学第一附属医院检验科,合肥,230022
刊名：
安徽医科大学学报
英文刊名：Acta Universitatis Medicinalis Anhui
年，卷(期)：2014,49(4)
1.Kothavade R J;Kura M M;Valand A G Candida tropicalis:its prevalence,pathogenicity and increasing resistance to fluconazole 2010(08)
2.顾迟;陈功祥;周宏伟念珠菌对唑类药物耐药性及耐药机制的研究进展 2010(03)
3.Jiang C;Dong D F;Yu B Q Mechanisms of azole resistance in 52 clinical isolates of Candida tropicatis in China
2013(04)
4.Silva S;Hooper S J;Henriques M The role of secreted aspartyl proteinases in Candida tropicalis invasion and damage of oral mucosa 2011(02)
5.Pfaller M A;Diekema D J Epidemiology of invasive candidiasis:a persistent public health problem 2007(01)
6.张月香;杨淑华;王建红热带念珠菌耐药基因的初步研究 2009(03)
7.Vandeputte P;Larcher G;Bergès T Mechanisms of azole resistance in a clinical isolate of Candida tropicalis 2005(11)
8.江岑;董丹凤;俞焙秦3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及耐药机制比较 2013(04)
9.Sanglard D;Ischer F;Koymans L Amino acid substitutions the cytochrome P-450 lanosterol 14 α-demethylase (CYP5lA1) from azole resistant Candida albicans clinical isolates contribute to resistance to azole antifungal agents 1998(02)
引用本文格式：江雨璐.王中新.沈继录.Jiang Yulu.Wang Zhongxin.Shen Jilu热带念珠菌对氟康唑耐药机制的初步研究[期刊论文]-安徽医科大学学报 2014(4)。