杏鲍菇粗多糖的抗氧化活性研究

杏鲍菇粗多糖的抗氧化活性研究汪建中;李艳如;龚华锐;仁晓凤【摘要】对杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖清除DPPH自由基、羟自由基的能力、铁离子螯合能力以及还原力进行了比较分析,结果表明:菌丝体、发酵液粗多糖清除DPPH自由基能力较强,清除率EC50值分别为4.15和4.81mg/mL;子实体、菌丝体和发酵液粗多糖清除羟自由基、螯合铁离子的能力较强,羟自由基清除率EC50值分别为1.27、1.31和3.54mg/mL,铁离子螯合能力EC50值分别为3.01、1.53和4.17mg/mL;在一定浓度范围内,多糖浓度增加其清除DPPH自由基、羟自由基的能力以及铁离子螯合能力亦增强,并呈现良好的量效关系.实验浓度范围内,3种粗多糖的还原力均较弱.【期刊名称】《安徽师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(037)002【总页数】5页(P160-164)【关键词】杏鲍菇;粗多糖;抗氧化【作者】汪建中;李艳如;龚华锐;仁晓凤【作者单位】安徽师范大学生命科学学院,安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室,生物环境与生态安全安徽省重点实验室,安徽芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室,生物环境与生态安全安徽省重点实验室,安徽芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室,生物环境与生态安全安徽省重点实验室,安徽芜湖241000;安徽师范大学生命科学学院,安徽省重要生物资源保护与利用重点实验室,生物环境与生态安全安徽省重点实验室,安徽芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】O636.1食用菌多糖是食用菌中最重要的活性成分之一,具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂质过氧化等抗氧化作用,从而可起到保护生物膜和延缓衰老的作用[1];此外大多数食用菌可进行液体培养,生产周期短,适合工业化生产;因此食用菌多糖将成为开发保健食品、药品以及抗氧化剂的重要来源.杏鲍菇(Pleurotus eryngii)是近年来开发栽培成功的集食用、药用、食疗于一体的珍稀食用菌新品种[2].杏鲍菇含有的特异性多糖能调节人体的免疫力,具有具有抗病毒、抗肿瘤、抗疲劳、抗损伤、抗氧化、防止动脉硬化、增强人体免疫力以及抗癌等多种生理活性[3-5].有关杏鲍菇多糖的研究报道中,杨立红等以杏鲍菇子实体为材料,采用葡聚糖凝胶过滤法,分离纯化出两种杏鲍菇多糖,对小鼠肝脏、骨骼肌有明显的抗氧化、抗损伤功效[6].刘海英等的研究表明杏鲍菇菌丝体多糖具有清除DPPH 自由基、羟自由基和NO-2自由基的能力[7].盛伟等采用Fenton法、邻苯三酚自氧化法、还原力的测定以及盐酸萘乙二胺比色法等实验方法研究了杏鲍菇菌丝体多糖与胞外多糖体外抗氧化活性.结果表明杏鲍菇菌丝体多糖与胞外多糖均具有较强的体外抗氧化活性,且随多糖浓度的增大,其抗氧化活性逐渐增强[8].本文以杏鲍菇子实体、深层培养获得的杏鲍菇菌丝体和发酵液为材料,比较研究其子实体、菌丝体和发酵液粗多糖清除DPPH自由基、羟自由基以及铁离子螯合能力和还原力等抗氧化能力,以期为杏鲍菇的综合开发利用提供一些理论依据.1 材料与方法1.1 菌种杏鲍菇(Pleurotuseryngii)菌种及其子实体由芜湖市野树林食用菌研究所提供. 1.2 培养基斜面培养基:麦芽汁培养基.液体菌种培养基:葡萄糖2%、酵母膏0.1%、硫酸镁0.05%、氯化钙0.01%、磷酸二氢钾0.05%.液体发酵培养基:葡萄糖3%,蛋白胨0.2%,麸皮1%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%.1.3 试剂二苯代苦味肼基(DPPH)自由基、菲洛嗪等购自Sigma公司;VC、EDTA二钠盐、无水乙醇、双氧水、氯化亚铁、硫酸亚铁、铁氰化钾、三氯乙酸、磷酸二氢钾等购自无锡展望化工厂.所有试剂均为分析纯.1.4 仪器SKY2102C恒温摇床上海苏坤实业有限公司;GUCS-10发酵罐镇江东方工程设备技术有限责任公司;HH-4恒温水浴锅金坛市杰瑞尔电器有限公司;TD5A-WS离心机湘仪离心机仪器有限公司;RE52-86A旋转蒸发仪、SHZ-D(III)型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂;FD-1D-50冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司;UV-3802紫外可见分光光度计优尼科(上海)仪器有限公司;AR-1140型电子天平奥豪斯国际贸易(上海)有限公司.1.5 杏鲍菇粗多糖的制备250mL装液体培养基100mL,接种10%(v/v)的杏鲍菇液体种,170r/min,26.5℃恒温培养7天,发酵产物经过滤、固液分离获得菌丝体和发酵液.分别将菌丝体水洗、子实体切片,50℃烘干、磨碎,100目过筛,与蒸馏水按固液比1:30(W/V)混匀,95℃回流提取2h,4000r/min离心10min,沉淀重复提取一次,合并2次上清液.上清液经减压浓缩至适当体积得浓缩液,加入4倍体积95%乙醇、4℃沉淀24h,4000r/min离心10min,沉淀冷冻干燥得菌丝体和子实体粗多糖.发酵液4000r/min离心10min,上清液减压浓缩至适当体积得浓缩液,加入4倍体积95%乙醇、4℃沉淀24h,4000r/min离心10min,沉淀冷冻干燥得发酵液粗多糖.1.6 杏鲍菇粗多糖抗氧化活性的测定1.6.1 DPPH自由基清除能力测定[9] 4mL反应混合液中含有0.04mg/mL的DPPH溶液2mL,多糖样品溶液2mL.迅速混匀后,室温条件下,黑暗环境中静置30min,于波长517nm处测其吸光度.以抗坏血酸为阳性对照,以50%的乙醇溶液作参比.每个样品平行测定3次,取平均值.根据下面公式计算多糖样品的DPPH自由基清除率:式中:SE为清除率;A0为蒸馏水代替样品时溶液的吸光度;A1为加有样品或阳性对照时溶液吸光度.1.6.2 羟自由基清除能力测定[10] 3mL反应混合液中含有20mmol/L的水杨酸钠溶液0.3mL,1.5mmol/L的硫酸亚铁溶液1.0mL,多糖样品溶液1.0mL,最后加入6mmol/L的H2O20.7mL.迅速混匀后,37℃恒温水浴1h,于波长510nm处测其吸光度.以抗坏血酸为阳性对照,以蒸馏水作为参比.每个样品平行测定3次,取其平均值.根据下面公式计算多糖样品的羟自由基清除率:式中:SE为清除率;A0为以蒸馏水代替样品的吸光度;A1为加有样品或阳性对照后的吸光度.1.6.3 铁离子螯合能力测定[11] 5mL反应混合液中含有 2mmol/L的氯化亚铁溶液0.1mL,蒸馏水3.7mL,多糖样品溶液1mL,最后加入5mmol/L的ferrozine溶液0.2mL,迅速混匀,室温条件下静置20min,于波长562nm处测其吸光度.吸光度越低,多糖样品的铁离子鳌合能力越强.以EDTA-二钠盐作为阳性对照,蒸馏水作参比.每个样品平行测定3次,取其平均值.根据下面公式计算多糖样品的铁离子鳌合能力:式中:SE为清除率;A0为以蒸馏水代替样品的吸光度;A1为加有样品或阳性对照后溶液的吸光度.1.6.4 还原能力测定[12] 向试管中加入pH6.6的磷酸盐缓冲液2.5mL,多糖样品溶液1mL,1%的铁氰化钾溶液2.5mL,迅速混匀,50℃恒温水浴、黑暗条件下反应20min,再加入10%的三氯乙酸溶液2.5mL,充分振荡后,4000r/min 离心10min,取上清液2.5mL,加入蒸馏水2.5mL,0.1%的FeCl3溶液0.5mL,常温反应5分钟后,于波长700nm处测定其吸光度.吸光度越高,说明这种反应混合物的还原力越强.以抗坏血酸为阳性对照,蒸馏水作为参比.每个样品平行测定3次,取其平均值.1.7 EC50值EC50值是指清除率达到50%时所需样品的质量浓度,是评价真菌粗多糖抗氧化活性的一个重要指标,可根据不同质量浓度样品的清除率曲线得出.EC50值越低表明样品的抗氧化能力越强.本实验中的EC50值分别指当DPPH自由基、羟自由基清除率、铁离子螯合能力为50%以及还原力实验中在波长700nm处吸光度为0.5时所需样品的质量浓度,该值由统计分析的回归方程计算得出.1.8 数据处理用EXCEL和SPSS软件进行数据的处理与分析,结果取平均值±标准差.2 结果与分析2.1 杏鲍菇粗多糖含量的测定由表1可知,杏鲍菇菌丝体粗多糖的含量大于子实体粗多糖,与常青等的研究结果基本一致[13].而发酵液粗多糖的含量与菌丝体粗多糖含量相当,两者间无显著性差异. 表1 杏鲍菇粗多糖含量的比较(平均值±标准误)Table 1 Comparison on thecontent of crude polysaccharid es in Pleurotus eryngii(Mean±SE)注:具有不同字母表示同行数据间有显著差异(P＜0.05).Note:The different letter indicates that significant differences existed between the parameters in the same line(P＜0.05).子实体菌丝体发酵液粗多糖以干重计(g/100g) 6.55±1.11a 7.93±0.29b ——含量以发酵液计(g/L) ——1.07±0.10a 1.39±0.09a2.2 杏鲍菇粗多糖清除DPPH自由基能力的比较由图1可知,在2-20mg/mL浓度范围内,随着样品浓度增加,杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖DPPH自由基清除率亦增加;当浓度为20mg/mL时,它们的清除率最大,分别为11.86%、104.28%和84.26%;当浓度为10mg/mL时,菌丝体粗多糖的清除率大于VC,达到94.51%;当浓度为20mg/mL时,发酵液粗多糖的清除率接近VC,为82.26%.根据回归方程计算得到菌丝体、发酵液粗多糖的EC50值分别为4.15和4.81mg/mL,而子实体粗多糖的EC50值大于20 mg/mL,表明杏鲍菇菌丝体和发酵液粗多糖的DPPH自由基清除能力较强,而子实体粗多糖的DPPH自由基清除能力较弱,它们的清除率大小为:菌丝体＞发酵液＞子实体2.3 杏鲍菇多糖清除羟自由基能力的比较由图2可知,在一定浓度范围内,随着质量浓度的增加,杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖的羟自由基清除率也随之增加;当浓度为4mg/mL时,子实体、菌丝体粗多糖的清除率最大,分别为84.93%和87.04%;当浓度为10mg/mL时,发酵液多糖的清除率最大,为82.23%;而后随着粗多糖浓度增加,其羟自由基清除能力均有所下降,其原因有待进一步研究.根据回归方程计算得出子实体、菌丝体和发酵液粗多糖的EC50值分别为1.27、1.31和3.54mg/mL,表明杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖均具有较强的羟自由基清除能力,它们的清除率大小为:子实体＞菌丝体＞发酵液.图1 杏鲍菇粗多糖的DPPH自由基清除能力Fig.1 The capacities of scavengingDPPH free radicals of crude polysaccharides from Pleurotus eryngii图2 杏鲍菇粗多糖的羟自由基清除能力Fig.2 The capacities of scavenging hydroxyl free radicals of crude polysaccharides from Pleurotus eryngii 2.4 杏鲍菇多糖铁离子螯合能力的比较由图3可知,在一定浓度范围内,随着样品浓度的增加,杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖的铁离子螯合能力也随之增强.当浓度分别为10和6mg/mL时,子实体和菌丝体粗多糖的螯合率,分别为68.57%、60.98%;而后随着浓度的增加,它们的螯合率反而下降,其原因有待进一步研究.当浓度20 mg/mL时,发酵液粗多糖的螯合率最大,为86.63%,与EDTA-二钠相差不大.根据回归方程计算得到子实体、菌丝体和发酵液多糖螯合率的EC50值分别为3.01、1.53和4.17mg/mL,表明杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖均具有较强的铁离子螯合能力,它们的螯合率大小为:菌丝体＞子实体＞发酵液.2.5 杏鲍菇多糖还原能力的比较由图4可知,在一定浓度范围内,随着粗多糖浓度的增加,杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖还原力也随之增强.当浓度为20mg/mL时,它们的OD值最大,分别为0.28、0.11和0.11.杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液多糖还原力的EC50值均大于20mg/mL,说明这三种多糖的还原力较弱.图3 杏鲍菇粗多糖的铁离子螯合能力Fig.3 The iron ion chelating abilities of crude polysaccharides from Pleurotus eryngii图4 杏鲍菇粗多糖的还原力Fig.4 The reducing powers of crude polysaccharides from Pleurotus eryngii3 讨论食用菌多糖是一种天然、安全的生理活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、防衰老、降血脂、调节免疫等多种生物功效;另一方面,大多数食用菌多糖可以通过深层发酵获得,利于工业化生产.因此,研究食用菌多糖,特别是其菌丝体、发酵液粗多糖的抗氧化活性具有重要意义.有研究表明金顶侧耳(Plurotus citrinopileauts)、姬菇(Pleurotus cornucopiae)、毛头鬼伞(Coprinus comatus)、棕灰口蘑(Tricholoma myomyces)和蜜环菌(Armillaria mellea)子实体粗多糖清除DPPH自由基的EC50值分别为 14.51、15.36、15.02、1350和10mg/mL[14-15],远大于本研究中杏鲍菇菌丝体、发酵液粗多糖的EC50值;鸡油菌(Cantharellus cibarius)、变绿红菇(Russula virescens)、金顶侧耳、姬菇和毛头鬼伞子实体粗多糖清除羟自由基的EC50值分别为1.12、1.21、2.45、2.60和2.59mg/mL,与本研究中杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖清除羟自由基的能力相差不大,可见杏鲍菇菌丝体和发酵液粗多糖清除DPPH、羟自由基的能力较强;子实体粗多糖清除羟自由基的能力较强.菌丝体粗多糖清除DPPH自由基的能力强于发酵液粗多糖,略强于子实体粗多糖,与前人的研究结果基本一致[7,16].有研究表明美味牛肝菌(Boletus edulisBull)、松茸(Tricholoma matsutake)、鸡油菌、变绿红菇(Russula virescens)和蜜环菌以及经纯化的洋蕈(Agaricus bisporus)、和巴西蘑菇(Agaricus brasiliensis)子实体多糖铁离子螯合能力的EC50值分别12.78、4.97、3.22、3.79、3.41、7.80和2.04mg/mL[15,17,18],而本研究中杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖的EC50值分别为3.01、1.53和4.17mg/mL,可见这三种粗多糖均具有较强的铁离子螯合能力.综上所述,杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖均具有较强的体外抗氧化活性,对机体的氧化损伤有一定的保护作用.4 结论本文提取了杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖,并比较其体外抗氧化能力.结果表明,菌丝体、发酵液粗多糖清除DPPH自由基能力较强;子实体、菌丝体和发酵液粗多糖清除羟自由基、螯合铁离子的能力较强;实验浓度范围内,3种粗多糖的还原力均较弱.在一定浓度范围内,多糖浓度增加其清除DPPH自由基、羟自由基的能力以及铁离子螯合能力亦增强,并呈现良好的量效关系.虽然实验结果表明了杏鲍菇子实体、菌丝体和发酵液粗多糖都具有较明显的抗氧化活性,是一种天然的、安全的抗氧化剂.但它们均为混合物,今后有待对其进一步分离纯化、探讨其抗氧化作用机制,以期为大型食药用真菌的综合开发利用提供理论依据.参考文献:[1] 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