革兰氏染色质量要求
革兰染色与镜检的质量控制
革兰染色和抗酸染色涂片镜检的质控
1. 革兰染色用转种24小时的ATCC25923(金黄色葡萄球菌)和
ATCC25923(大肠埃希菌)制备菌悬液，作为革兰染色的质量控制，每天质控和标本同步进行。
2. 抗酸染色用标准的结核抗酸杆菌制备成菌悬液，经高压灭菌后冰箱
保存，作为抗酸染色的质量控制，每次质控和标本同步进行。
染色液阳性对照菌阴性对照菌监控频率
革兰染色金黄色葡萄球菌大肠埃希菌每天
抗酸染色结核抗酸杆菌每次
3. 涂片镜检的质控
本室组4人定于每周2镜检革兰染色和抗酸染色的质控菌株，看镜检结果的符合率，符合率达100%。
及随机抽查10张痰标本涂片的革兰染色和抗酸染色，4人镜检后，经集体讨论：每一张涂片得最终结果。
并与个人的镜检结果进行对比，4人革兰染色结果的符合率应达90%以上，抗酸染色结果的符合率达100%。
SOP031革兰氏染色
革兰氏染色一、检验目的：了解待检标本中是否存在病原菌及其染色特性和形态。
二、原理：生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。
中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。
G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
三、标本的采集：1、应该收集新鲜标本。
2、标本容器应为有盖无菌容器。
四、试剂：结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、沙黄溶液、酒精乙醚、香柏油、生理盐水。
五、仪器设备普通光学显微镜、载玻片、酒精灯。
六、操作步骤1、涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上滴加生理盐水1滴，取菌落、分泌物、穿刺液涂片，制成薄涂面；如有标本不易在玻片上附着，可加小量无菌血清或蛋白液。
2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。
3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）4、结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
革兰氏染色法操作规程
革兰氏染色法操作规程革兰氏染色法操作规程1目的建立革兰氏染色法操作规程，确保革兰氏染色法操作规范化、科学化。
2范围适用于用革兰氏染色法对细菌进行分类和鉴定。
3职责3.1检验员：负责按本规程进行革兰氏染色操作。
3.2 QC主管、质量部经理：负责监督。
4内容4.1仪器与用具酒精灯、洁净的盖玻片、接种环、滴管、生物显微镜。
4.2材料4.2.1试剂结晶紫、番红、碘化钾、碘、95%乙醇、草酸铵、香柏油。
4.2.2试液及配制方法4.2.2.1 结晶紫染色液：称取结晶紫2g，溶于20ml 95%乙醇中；称取草酸铵0.8g，溶于80ml水中；将两种溶液混合，静置48h后使用。
4.2.2.2碘染色液：称取碘化钾2g，加5～10ml水使充分溶解，加碘1g，待完全溶解后，加水至300ml。
4.2.2.3 番红复染液：称取番红0.25g溶于10ml 95%乙醇中，然后加水100ml。
4.3操作步骤4.3.1 样品固片取一干净的载玻片，用接种环挑取一环无菌水于载玻片中，挑取少量菌于生理盐水中涂片或直接滴一滴待检菌在盖玻片中央，自然干燥固定。
4.3.2 初染滴加结晶紫染液于已固定的涂片上，染1min，用水冲洗、甩干。
4.3.3 媒染滴加碘染色液，液作用1min，用水冲洗、甩干。
4.3.4 脱色滴加95%乙醇脱色，置白色背景下，侧动盖玻片，直至无紫色脱落为止（约为20-30秒），立即用水冲洗、甩干。
4.3.5 复染滴加番红复染液，染1-2 min，用水冲洗、甩干。
4.3.6 镜检置油镜下观察。
先用低倍镜找准目标，于涂有样品处滴加香柏油一滴，用油镜观察。
4.3.7 结果判定革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常呈假阳性。
4.4 注意事项4.4.1 待检菌菌龄应为18～24h。
一般情况下，革兰氏阴性菌的染色反应较稳定，不易受菌龄长短影响；而革兰氏阳性菌，有的在幼龄时呈阳性，超过24h可变为阴性。
革兰氏染色实验注意事项
革兰氏染色实验注意事项1.实验前准备：-准备好所需的试剂和设备，包括水洗瓶、稀释盘、热源、革兰染色各液、镜片、显微镜等。
-检查试剂的保存期限，确保试剂的有效性。
-按要求进行无菌操作，保证实验环境的清洁。
2.样品处理：-选择新鲜细菌培养物作为样品，确保细菌的新鲜度。
-为了避免脏染色，应在菌培养基上挑选单纯菌落。
-对于液体培养物，可以通过离心法将菌细胞沉淀下来，然后进行革兰氏染色。
3.实验步骤：-充分清洗玻璃片，以免杂质对实验结果产生干扰。
-均匀涂取菌液于干燥的玻璃片上，切勿用手触摸菌液，以免污染样品。
-确保菌液均匀涂满玻璃片，避免过多或过少，以防染色效果不理想。
-染色时间要控制好，过长或过短都会导致结果错误，通常为30秒至1分钟不等。
-染色液要均匀地覆盖于菌液上，并避免气泡的产生。
-完成染色后，将玻璃片轻轻漂洗，去除多余染色液。
4.镜检操作：-将染色后的玻璃片置于显微镜载物架上进行观察。
-根据细菌形态、染色性质以及结构特征进行初步鉴定。
-鉴定时要注意放大倍数的选择，以保证观察到细菌的细节。
-观察时要仔细观察细菌的形态、大小、排列方式等信息，并进行记录。
5.清洁工作：-实验结束后，应及时清洗试管、显微镜载架、显微镜物镜等设备，防止细菌的交叉污染。
-废液和废弃物应按规定处理，避免对环境和人员健康造成危害。
6.安全操作：-在进行实验时，应遵守实验室的安全操作规程，佩戴好个人防护用品，如实验服、手套和护目镜等。
-对于有毒性或刺激性的试剂，应注意避免直接接触。
-实验中注意火源和电源的使用安全，防止发生火灾或电击事故。
总之，进行革兰氏染色实验时，除了掌握正确的操作步骤外，还要注意实验前的准备和实验过程中的清洁工作，确保实验结果准确无误，并保证实验过程的安全进行。
革兰氏染色及镜检sop
革兰氏染色及镜检SOP1. 目的规范革兰氏染色及镜检的标准操作规程，确保试验的准确性。
2. 范围本标准适用于革兰氏染色及镜检的操作。
3. 定义3.1.革兰氏阳性菌（G+）：G+的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成。
在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
3.2.革兰氏阴性菌（G-）：G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高。
当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
4. 职责4.1.QC负责本规程的起草、修订、培训及执行。
4.2.QA、QC组长、质量管理部经理负责本规程的审核。
4.3.质量总监负责本规程的批准。
4.4.QA负责本规程执行的监督。
5.引用标准无6. 材料6.1.仪器、实验用具：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环。
6.2.试剂与配制革兰氏染色液、95%乙醇、香柏油、二甲苯和0.9%氯化钠溶液。
结晶紫溶液：称量2g结晶紫于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入100ml烧杯中，量取95%乙醇20ml 将其溶解；草酸铵溶液：称量0.8g草酸铵于200ml烧杯中，量取80ml纯化水将其溶解；结晶紫染色液：将配好的结晶紫溶液倒入草酸铵溶液中，混匀，静置24h后过滤即成结晶紫染色液；此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。
碘化钾溶液：称量2gKI粉末，转移至200ml烧杯中，量取100ml的纯化水将其充分溶解；碘溶液：称量1g碘颗粒于研钵内研磨至粉末，将粉末倒入500ml烧杯中，量取200ml纯化水倒入并碘染液：将配好的碘化钾溶液倒入碘溶液中，混匀即成。
配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。
沙黄溶液：称量0.25g沙黄于200ml烧杯中，量取95%乙醇10ml将其溶解；沙皇（番红）复染液：待沙黄溶液完全溶解后加纯化水定容至100ml，混匀即成。
革兰氏染色标准操作规程 sop文件
微生物室SOP文件-革兰氏染色标准操作规程原理本染色是最基本的染色法，染色结果将细菌分为革兰阳性（紫色）和革兰阴性（红色）两类，可用于标本涂片或菌落涂片。
标本采集与处理选择正确生理部位和采集合适的标本及其正确运送等环节至关重要。
而所有与标本质量有关的检验工作者必须要了解在整个实验过程中保证标本质量的重要性和必要性。
标本的选择与采集：采集送检标本前，标本选择的种类和采集部位必须反映有效病程。
一个没有有效病原体的标本是没有临床诊断价值的。
要避免常居菌群随时可能造成的污染，以确保取得反映感染过程的典型标本。
标本的送检:所有标本都必须立即送往实验室，最好在2小时内。
如不能及时送检，细菌病原体待检标本应按规定条件下存放，通常用于细菌学检验的标本的存放不要超过２４小时。
临床标本或传染性材料从一个实验室到另一个实验室的送检，不论距离长短，都要求严格注意标本的包装和标签说明。
所要运送的材料必须贴上适当的标签，包装得当。
送检期间要予以安全防护。
试剂制备：结晶紫溶液:A液：结晶紫2.0g95%乙醇20mlB液：草酸铵0.8g蒸馏水80ml用前24h将A、B液混合，过滤后装入试剂瓶备用。
碘液碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300ml将碘与碘化钾混合研磨，加少许水至完全溶解。
最后补足水量。
脱色液（丙酮酒精）95％酒精97ml丙酮3ml稀释复红石碳酸复红10ml蒸馏水90ml染色方法涂片经火焰固定，加结晶紫液染1分钟，清水冲洗。
加碘液染1分钟，清水冲洗。
加丙酮酒精脱色，不时摇动约15-25秒，至无紫色脱落为止，清水冲洗。
加稀释复红染15-25秒，清水冲洗。
干后镜检。
注意事项染液注意密封，以免凝结产生沉淀影响使用效果。
体液标本均应离心后取下层沉淀液与染液混合，以提高检出率。
提高责任心，做到全片检查。
临床意义将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类，有助于进一步鉴定。
还可为临床选择用药提供参考，帮助临床制订有针对性的治疗方案。
革兰氏染色标准操作规程
革兰氏染色标准操作规程1、目的
确保染色结果清晰可靠。
2、范围
球菌、杆菌和弧菌染色
3、职责
临床微生物实验室当班工作人员认真按程序文件操作。
5、试剂
5.1结晶紫溶液
A液：结晶紫2g
95%乙醇20ml
Β液：草酸铵0.8g
蒸馏水80ml
使用前24小时将A液Β液混合后，过虑后装入试剂瓶内备用。
5.2碘液
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300ml
5.3脱色液：95%乙醇
5.4复染液
储存液：沙黄2.5g
95%乙醇100ml
应用液：储存液10ml
蒸馏水90ml
6、工作程序
6.1待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然干燥后用火焰固定。
6.2加结晶紫液染1分钟，清水冲去染液。
6.3加碘液染1分钟，清水冲去染液。
6.4加95%乙醇脱色液，不时摇动约10-30秒钟，至紫色已脱落为至，水冲洗。
6.5加复染液（伊红），染30秒钟，水冲洗。
6.6待涂片自然干燥后，油镜镜检。
7、质量控制
金黄色葡萄球菌为革兰氏染色阳性,大肠埃希菌为革兰氏染色阴性。
8.参考文献
中国人民共和国卫生部医政司编.《全国临床检验操作规程》（第三版）.2006, 第六篇P725。
革兰氏染色无菌安全要求
革兰氏染色无菌安全要求
革兰氏染色是常用的细菌分离和鉴定的方法，该方法通过染色区分出细菌的不
同形态和性质，然后观察细菌的生长和代谢等特征进行鉴定和分类。
革兰氏染色操作需要注意一些无菌和安全要求，以确保实验结果的准确性和人员的安全。
无菌要求
1.实验室必须保持无菌状态，经常进行清洁和消毒工作。
2.实验室内使用的器材和试剂必须为无菌状态，必要时进行灭菌处理。
3.实验室内必须有无菌操作区，操作人员必须穿戴相关无菌装备，如无
菌手套、帽子、口罩等，并进行手部消毒。
4.操作染色时必须使用无菌培养基，并进行无菌操作。
染色过程中不能
离开培养基，操作过程中尽量减少外界干扰和空气污染。
安全要求
1.严格遵守实验室安全操作规程，正确使用实验室器材和试剂，遵循操
作步骤和安全要求。
2.禁止在实验室内食用、饮水、吸烟等无关活动，保持环境清洁和整洁。
3.操作过程中要保持安全距离，防止溅洒物质伤害到自身或他人。
4.实验室中应配备急救箱等急救设备，以应对紧急情况，一旦发生意外
要及时报告并进行处理。
5.每次操作结束后，必须彻底清洁器材和工作区域，防止交叉污染和细
菌滋生。
总之，革兰氏染色操作需要遵循无菌和安全要求，以确保实验的准确性和人员
的安全。
实验操作人员应认真学习和了解相关知识，并遵循操作步骤和规程。
革兰氏染色法的判断标准
革兰氏染色法的判断标准革兰氏染色法（Gram staining）是细菌学中最常用的染色技术之一，由丹麦微生物学家克里斯蒂安·格拉姆（Christian Gram）于1884年发明。
该方法通过染色和颜色保持的特点，将细菌区分为革兰阳性菌和革兰阴性菌两大类。
革兰氏染色法的判断标准主要包括以下四个方面：1. 革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁的构成差异：革兰阳性菌细胞壁较厚，主要由一层厚的胞壁多糖（包括胞原质、葡聚糖和多肽聚糖）构成，同时含有较少的脂类物质；而革兰阴性菌细胞壁较薄，主要由一个细胞膜和较薄的胞壁组成，同时有较多的脂类物质、脂多糖和糖脂组成。
这种差异使得革兰阳性菌在染色过程中更容易保留紫晶体染料，而革兰阴性菌则很容易被冲洗净。
2. 革兰阳性菌和革兰阴性菌对染色剂的亲和力：革兰氏染色法使用的染色剂包括靛紫（crystal violet）和碘酒液（iodine solution）。
在革兰阳性菌细胞壁较厚且含有较少脂类物质的情况下，靛紫和碘酒液较容易与细胞壁结合形成复合物，使细胞保持紫色；而在革兰阴性菌细胞壁较薄且含有大量脂类物质，特别是脂多糖的情况下，细胞壁容易被冲洗，无法固定靛紫和碘酒液，因此在后续染色步骤中会出现颜色变化。
3. 革兰氏染色法中的洗涤步骤：革兰氏染色法中，染色剂和洗涤液的运用非常重要。
在染色过程中，使用无菌生理盐水或水对细菌进行洗涤，这一步骤会决定细菌在染色后颜色的保持情况。
洗涤液的pH值和温度也会影响革兰氏染色结果。
一般来说，革兰阳性菌对洗涤液的影响较小，而革兰阴性菌则很容易被洗涤液冲洗净。
4. 革兰阳性菌和革兰阴性菌在显微镜下的观察：通过显微镜观察革兰氏染色结果，可以进一步确定细菌的分类。
革兰阳性菌呈现出紫色或暗紫色细胞，而革兰阴性菌呈现出红色或粉红色细胞。
总结以上几个方面，可以判断细菌是否为革兰阳性菌或革兰阴性菌。
但是需要注意的是，革兰氏染色法存在一定的局限性，例如某些细菌可能存在变异、不规则或干扰的染色结果等情况。
革兰氏染色质量要求
细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G+），呈现第二次染色的效果；革兰氏阴性菌（红阴G-）；
口诀：紫碘醇红，分分半分；阳紫阴红
G+ G-
4.备注
5.相关资料/文件
乐美无菌灌装作业标准书－带菌不良品处理流程O－Q－01－030
复染－－红色的沙黄染液第二次染色60S；
镜检；
3.3操作质量要求
涂片厚薄：挑取菌体与水混合成悬液直径1cm薄层；
干燥固定：手持载玻片两端在酒精灯火焰上部过3－5下，勿紧靠火焰及加热时间偏长；
菌龄选择合适：幼龄细菌
看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净（例如：用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头沿同一方向擦2—3次，注意：二甲苯有毒性）；
1.目的
发生带菌不良品时进行细菌类别的初步分类鉴定。
2.适用范围
本标准适应于乐美罐无菌灌装线质量控制。
3. 革兰氏染色质量要求
3.1产品规格
分析纯；
有产品生产许可证，合格证；
保质期内使用；
3.2推荐测试方法
涂片固定；
单染－－结晶紫染液第一次染色60S；
媒染－－碘－碘化钾浸湿60S；
脱色－－95％乙醇溶液进行30S脱色；
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发生带菌不良品时进行细菌类别的初步分类鉴定。
2.适用范围
本标准适应于乐美罐无菌灌装线质量控制。
3. 革兰氏染色质量要求
3.1产品规格
分析纯；
有产品生产许可证，合格证；
保质期内使用；
3.2推荐测试方法
涂片固定；
单染－－结晶紫染液第一次染色60S；
媒染－－碘－碘化钾浸湿60S；
脱色－－95％乙醇溶液进行30S脱色；
3.4结果判定
细菌呈现第一次染色的效果紫色，革兰氏阳性菌（紫阳G+），呈现第二次染色的效果；革兰氏阴性菌（红阴G-）；
口诀：紫碘醇红，分分半分；阳紫阴红
G+ G-
4.备注
5.相关资料/文件
乐美无菌灌装作业标准书－带菌不良品处理流程O－Q－01－030
复染－－红色的沙黄染液第二次染色60S；
镜检；
3.3操作质量要求
涂片厚薄：挑取菌体与水混合成悬液直径1cm薄层；
干燥固定：手持载玻片两端在酒精灯火焰上部过3－5下，勿紧
酒精染色时间准确控制；
染色过程中勿使染色液干涸；
看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净（例如：用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头沿同一方向擦2—3次，注意：二甲苯有毒性）；