样品空白速率排除胆红素对肌酐两点法测定的负干扰解读
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、起点法、速率法?之杨若古兰创作两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产品或底物浓度的总变更量以求取酶反应初速度的方法.起点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产品或底物浓度总变更量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产品或底物的浓度随时间的变更来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法.一、经常使用生化检测项目分析方法举例1．起点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因此采取一点起点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点起点法，包含总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用.2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采取此法.（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定普通应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定发生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，和血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用操纵步调如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均曾经固化在存储器里，用户不克不及点窜.各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数.生化分析仪普通另外留一些检测项目的空白通道，由用户本人设定分析参数.是以必须理解各参数的确切意义.一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数没法进行检测.1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来暗示.2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有起点法、两点法、连续监测法等，根据被检物资的检测方法道理选择其中一种反应类型.3．反应温度普通有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物资反应产品的光接收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物资光接收有关的波长. 6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度添加为正向反应，吸光度降低为负向反应.7．样品量样品量（sampling volum）普通是2μl～35μμμl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）普通是20～300μl，以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）普通也是20～300μl，以1μl步进.10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在分歧的分析仪有一个分歧的规定范围，普通是180～350μl，个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少没法进行吸光度测定. 11．孵育时间孵育时间（incubate time）在起点法是样品与试剂混匀开始至反应起点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间. 12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间以后即开始，普通为60～120s，很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变更值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采取一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点，应使用两个校准液；对于校准曲线呈非线性者，必须使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度. 15．校准K值或理论K值通过校准得到的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超出此范围应添加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关. 17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的精确性有关，普通来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但若样品中待测物浓度太高等，检测结果可能禁绝确.1．样品预浓缩设置样品量、浓缩剂量和浓缩后样品量三个数值，即可在分析前主动对样品进行高倍浓缩.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度降低限.若低于此限时底物已太少，缺乏以保持零级反应而导致检测结果禁绝确.3．前区检查免疫比浊法中利用，以判断是否有抗原过剩.将起点法最初两个吸光度值的不同（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，暗示已有抗原过剩，应浓缩样品后重测.4．试剂空白吸光度范围超出此设定范围暗示试剂已蜕变，应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂本人在监测过程中没有化学反应时的变更速率.6．方法学抵偿系数用于校准分歧分析方法间测定结果的分歧性，有斜率和截距两个参数.7．参考值范围对超出此范围的测定结果，仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内汲取的最小样品量.普通分析仪的最小样品量是2μμl 的.在样品含高浓度代谢产品或高活性酶浓度的情况下常常需采取分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围分歧）的上限得以扩大.2．最大试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法测定，以往手工法操纵时样品量10μl，试剂量4ml，如许试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，导致线性上限变低.是以对这类检测项目最大试剂量非常次要.3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能主动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩大.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少浓缩及重测次数、降低成本.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光接收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化改变，因此在肌酐反应过程中胆红素的光接收呈降低趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化改变，因此以第二试剂加入后的速率变更，减去试剂空白速率变更，即可清除胆红素的负干扰，见图7-8.二、单波长和双波长方式（一）概念采取一个波长检测物资的光接收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式.当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的接收峰与其它共存物资的接收波长无堆叠时，可以选用.在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较大接收、从而影响测定结果的精确性时，采取双波长方式更好.（二）双波长的感化双波长(di-wavelength)测定利益是①清除乐音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品本人光接收的干扰.从光源，到比色杯、单色器、检测器的全部光路零碎中，均存在着随时间发生变更的不波动的检测旌旗灯号，即乐音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测发生的乐音基本上不异，因此能清除乐音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红蛋白、胆红素等时，会发生非特异性的光接收，而干扰测定结果的精确性.采取双波长方式测定可以部分清除这类干扰，提高检测的精确性.（三）次波长的确定方法当被测物的主波长确定以后，再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物接收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波利益有尽可能不异的光接收值，而被测物在主、次波利益的光接收值应有较大的差别.普通来说，次波长应大于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体利用对于某些反应速度快且没法设置为两点起点法的分析项目，特别是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部分清除样品本人的光接收干扰.目前用单试剂法测定的项目利用双波长的为血清总蛋白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪大多可用双试剂方式分析，其利益是：①可提高试剂的波动性，多数双试剂混合成单一工作试剂时，其波动时间缩短；②能设置两点起点法，来清除来自样品本人的光接收干扰；③在某些项目检测时能清除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的唆使酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与唆使酶反应以后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真实的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应耗费的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而清除以上副反应的影响.四、测定过程的主动监测各种主动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的精确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有必定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变常常提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反应为道理的检测试剂会因酚被氧化为醌而变成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而降低等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这类方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变更速率监测一些酶试剂在反应温度下不波动，其空白吸光度可随着时间逐步发生变更，这类变更的次要缘由与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的构成和生产厂家的分歧而分歧.这类变更会影响测定结果的精确性，普通使结果偏高.如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会主动减去试剂空白变更速率.在以监测NAD（P）H 减少为唆使反应的酶活性测定中，空白速率可监测并清除由NADH本身氧化所形成的吸光度降低；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并清除底物本身分解形成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰清除中的感化，已如前述.3．样品信息监测因为样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果发生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱接收特性，用双波长或多波长检测其性质和程度，普通是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸程度.然后在结果计算时主动减去这部分干扰，这将有益于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）起点监测：起点法测定要判断所选的测光点是否到达起点或平衡点.一些分析仪在所选起点后再选一个测光点，比较这两点吸光度的差别来判断反应是否到达起点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，是以仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的大小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变更速率与连续监测期最初若干点的变更速率进行比较，来判断是否为线性期.5．底物耗费的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或降低超出其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应浓缩必定的倍数从头测定.此监测对于采取负反应分析酶活性的方法甚为次要.见图7-96．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超出此范围，分析仪将显示测定结果超出线性范围的提示，多数分析仪会主动将样品减量或增量从头测定.一、分析方法分类（一）起点法被测物资在反应过程中完整被改变成产品，即达到反应起点，根据起点吸光度的大小求出被测物浓度，称为起点法（end essay）.实际上被测物并没有完整被改变，而只是与产品达到一个动态的化学平衡，是以该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看，到达反应起点或平衡点时，吸光度将不再变更.分析仪通常在反应起点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否到达反应起点.起点法参数设置简单，反应时间普通较长，精密度较好.起点时间的确定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向波动，因此可将5min作为反应起点.②根据被测物反应起点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白蛋白的溴甲酚绿法测定中，白蛋白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，以后α球蛋白和β球蛋白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，持续约达10min，是以起点时间应采取10～30s，而不该选择10min. 1．一点起点法：在反应到达起点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个起点吸光度值，这类方法称为一点起点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数，详见第五节二操纵方法.2．两点起点法：在被测物反应或唆使反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应到达起点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点起点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能无效地清除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品本人光接收（见图7-5）形成的干扰.在单试剂分析加入试剂的初期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若唆使反应吸光度尚未明显变更，则可在此时选择第一个吸光度，在唆使反应起点时选择第二个吸光度，从而设置成两点起点法.但唆使反应初期吸光度无明显变更的化学反应较少，如单试剂方式测定总蛋白、白蛋白、钙、磷、镁等的起点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的起点法分析项目，因反应初期吸光度已有明显变更，因此均难以用上述方式设置两点起点法.但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时唆使反应普通尚未开始，则能容易设置两点起点法.在此要留意必须将两次读吸光度时分歧比色液体积进行校订.目前全主动分析仪均具有此主动校订功能，不必手工进行校订.（二）固定时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非起点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固定时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6.其计算公式与两点起点法不异，为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性成绩.例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸次要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其当前，碱性苦味可与蛋白质和其它慢反应干扰物反应.如许选用反应的第二个30s为测定时间，既防止了快反应物资的干扰，也防止了慢反应物资的影响，使肌酐浓度与吸光度变更呈良好的线性关系，有益于提高分析的特异性和精确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产品时，连续拔取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单位吸光度变更值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度，其大小与被测酶活性成反比.连续监测法的利益即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再精确地计算酶活性，因此使主动生化分析仪在酶活性测定方面明显地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，普通是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值论述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因此根据酶活性的国际单位定义得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ，将此式中以K来暗示，此K值可通过对已知值即唆使物资的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中.采取理论K值的前提该当是样品和试剂的加量精确、比色杯光径精确、温度控制精确和波长精确等.但事实上因为各型分析仪在打针器容积步进电机精度、滤光片带宽等方面的差别，可形成样品和试剂加量和吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常大，因为反应盘是半流露的，是以随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐步降低，尽管开始测定时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C摆布，且反应过程中仍有可能上下动摇，这对于酶学反应来说影响是很大的.如采取37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的动摇还会使得结果的反复性降低.当然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热安装预温，则基本不影响反应盘温度.因为摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽和加样零碎的精确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的分歧，因此有须要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K 值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH （NADPH）没有尺度纯成品，而且配成溶液后波动性又较差，不克不及直接用NADH 或NADPH尺度液来校订仪器，须通过有NAD+(NADP+)介入的反应途径.用已糖激酶(HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的耗费与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有尺度纯成品，又有国家批准文号的葡葡糖尺度液.是以，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖尺度液浓度，测得葡萄糖尺度管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数εμL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 ，即在此台分析仪上340nm波利益测得NADH （NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH （NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产品在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有很多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其本人无色，经酶感化后释放出有色的反应产品，在405nm波长具有接收峰.最经常使用色素原底物及其产品为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶感化后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶感化后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).上面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：① 4-NP尺度储存液(1Ommo1/L).② 4-NP尺度利用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液浓缩而成).③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02).测定方法：4-NP尺度液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水代替4-NP尺度液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP尺度液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA为0.460，则。
胆红素对肌酐测定的影响分析
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医学检 验 ・
２ ０ 年 ３月第 ５ 第 ７ ０８ 卷 期
胆 红素对 肌 酐测定 的影 响分 析
殷立 奎 ． 文涛 ， 华 山 邓 马
（ 营 市 人民医 院 ， 东东 营 东 山 ２７９ ） ５ ０ １
【 关键词】 胆红 素 ； 酐 ； 定 肌 测 【 中图分 类 号】 ４ ６１ Ｒ ４ ．１
苦 味酸
（ｆ Ｊ ｅ反应 ） 定肌 酐 试 剂盒 ： ａ 测 上海 长征 医 学试
剂 有限 公司 提供 。酶 法测 定肌 酐试 剂盒 ： 华一 东菱 诊 断用 科 品 有限 公 司提 供 。胆 红 素标 准品 ｆ０ｍ １ ｇ总 胆红 素 干粉） 及测 定 药盒 ： 生公 司ｆ 元 台湾） 供 。仪 器 ： ｌ ７ ７ Ａ型全 自动生 提 Ｅ立 １０ 化 分析 仪 。
２结 果
２ ０＃ ｌ ０ ｍｏ Ｌ时 ， 味酸 法 就有 明显 干扰 ： ／ 苦 当胆红 素 浓 度 大 于
或 等 于 ５ ０￣ ｌ ０ ｍｏ Ｌ时 ， 酶 法也 产 生 明显 干扰 ， 干扰 的 程 ／ 对 且
度 随 胆红素 浓度 的增 加而 上升 。而 对苦 昧 酸法 ， 扰更 加 明 干
性 产 生 巨大影 响。 国内外 的很 多学 者都 对此 做 了深 入研 究 。
如何 排 除这 种干 扰 ， 试 Ｊ许 多 的方 法 ， 括 预处 理 法 主要 尝 ， 包 是指在 试剂 中加 入高铁 氰 化钾 、 红 素氧 化酶 、 胆 过氧 化氢 等 ，
加 ， 味酸法 与酶 法测 定的 肌酐 浓度 有显 著差 异 。也就 是说 苦 当胆 红 素浓 度较 低 时 ， １０ ｇ ｏ Ｌ以 内时 ， 种方 法 对肌 在 ０ ， ｌ ｍ ／ 两 酐 的测 定几 乎 没有 影 响 ， 随着 胆 红 素 浓度 的增 高 ， 两 种方 对
肌酐酶法测定的两点法分析
肌酐酶法测定的两点法分析摘要：目的：肌酐酶酶测定的两点分析。
方法：通过两种试剂进行比较。
反应温度为37℃，波长为500～520 纳米(主)/650 纳米(次)；标准为15毫升；样品也为15 毫升；试剂Ⅰ：200 毫升，孵育时间为300秒；试剂Ⅱ：50 毫升，第一点读数时间为120秒，第二点读数时间为300秒。
结果：酶法具有去除肌酸的干扰能力，有线性范围宽，精度高等特点。
结论：两点法对肌酐酶法测点有良好的作用。
关键字：肌酐酶法两点法对于酶法测定肌酐，目前已报告的有四种方式，其中三种均为紫外测定，一种为比色测定。
然而，在相比之下比色测定在除去肌酸的干扰能力、线性范围、精度等具有更高的优越性；市场上出售的商品试剂盒大多采用此法。
但fossati 原法的反应时间比较长，且要做一血清空白以除去血清中肌酸的干扰，这样不适合进行自动分析。
自动分析的一般反应时间为十分钟，为了除去肌酸的干扰必须采用两步法，反应时间要求在五分钟内达到。
根据实验。
必须将几种工具酶的用量增加到fossati原法的五到十倍。
然而，在实验过程中发现几种工具酶的水解速率均比较缓慢，反应的线性时间比较长；所以，将其改成两点法或是速率法测定，会取得很好的实验结果。
这也体现出两点法的优势。
1原理第一步反应：排除肌酸干扰第二步反应：测定肌酐2材料与方法2.1仪器：自动分析仪HITACHI7170，Beckman Synchron △CX5和Ciba Coring Express Plus。
分光光度计Beckman DU-640。
2.2原料试剂：原料试剂采用的工具酶比较多，如：肌酐酰氨基水解酶，肌酸脒基水解酶，肌氨酸氧化酶，棘根过氧化物酶，抗坏血酸氧化酶，这些工具酶均为Boehringer Mannheim公司产品。
3，5-二氯-2-羟-苯磺酸(DHBA)，4-氨基安替比林(4-AAP)和肌酐，均选用适量的剂量。
2.3应用试剂：试剂Ⅰ：每升磷酸盐缓冲液(150 Mmol/L,pH为7.5)中含CRTase 20 kU,SO 6 kU，POD 1 kU,ASO 1 kU,DHBA 3 Mmol,K4Fe(CN)6 20 Mmol,和4-AAP 4 Mmol。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?之迟辟智美创作两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变动量以求取酶反应初速度的方法.终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变动量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变动来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法.一、经常使用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总卵白（双缩脲法）、血清白卵白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂卵白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采纳一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总卵白、白卵白测定均已有双试剂可用.2．固按时间法苦味酸法测定肌酐采纳此法.（两点法）3．连续监测法对酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定发生浊度反应的项目，大都属免疫比浊法，载脂卵白、免疫球卵白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他卵白质如前白卵白、结合珠卵白、转铁卵白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用把持步伐如取样、冲刷、吸光度检测、数据处置等，其法式均已经固化在存储器里，用户不能修改.各种测定项目的分析参数（analysisparamete）年夜部份也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前年夜大都生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数.生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数.因此必需理解各参数简直切意义.一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测.1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来暗示.2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型.3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择，通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时，要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长. 6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种，吸光度增加为正向反应，吸光度下降为负向反应.7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μμμl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl，以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl，以1μl步进.10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在分歧的分析仪有一个分歧的规定范围，一般是180～350μl，个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少无法进行吸光度测定. 11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间，在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间. 12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始，一般为60～120s，很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变动值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的，可采纳一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点，应使用两个校准液；对校准曲线呈非线性者，必需使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度. 15．校准K值或理论K值通过校准获得的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性范围即方法的线性范围（linearity range），超越此范围应增加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关. 17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关，一般来说不设置这类分析参数，分析仪也能检测出结果，但如果样品中待测物浓度太高等，检测结果可能禁绝确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值，即可在分析前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中，可设置此参数，以规定一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少，缺乏以维持零级反应而招致检测结果禁绝确.3．前区检查免疫比浊法中应用，以判断是否有抗原过剩.将终点法最后两个吸光度值的分歧（ΔA）设置一个限值，如果后一点的吸光度比前一点低，暗示已有抗原过剩，应稀释样品后重测.4．试剂空白吸光度范围超越此设定范围暗示试剂已蜕变，应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用，是试剂自己在监测过程中没有化学反应时的变动速率.6．方法学赔偿系数用于校准分歧分析方法间测定结果的一致性，有斜率和截距两个参数.7．参考值范围对超越此范围的测定结果，仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量.一般分析仪的最小样品量是2μμl的.在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采纳分析仪的最小样品量作为减量参数，从而使分析仪检测范围（与线性范围分歧）的上限得以扩年夜. 2．最年夜试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目，如血清白卵白的溴甲酚氯法测定，以往手工法把持时样品量10μl，试剂量4ml，这样试剂量/样品量比例（R/S）为200，线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后，R/S却很难达到200，致使线性上限变低.因此对这类检测项目最年夜试剂量非常重要.3．弹性速率在酶活性测定中，当酶活性太高，在连续监测期中已不呈线性反应时，有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能，能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果，使酶活性测定的线性范围得以扩年夜.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L，从而减少稀释及重测次数、降低本钱.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时，胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收，而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变，因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率，因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应，而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变，因而以第二试剂加入后的速率变动，减去试剂空白速率变动，即可消除胆红素的负干扰，见图7-8.二、单波长和双波长方式（一）概念采纳一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式.当反应液中含有一种组分，或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时，可以选用.在吸光度检测中，使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较年夜吸收、从而影响测定结果的准确性时，采纳双波长方式更好.（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品自己光吸收的干扰.从光源，到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中，均存在着随时间发生变动的不稳定的检测信号，即噪音，而双波长检测是同时进行的，两种波长检测发生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红卵白、胆红素等时，会发生非特异性的光吸收，而干扰测定结果的准确性.采纳双波长方式测定可以部份消除这类干扰，提高检测的准确性.（三）次波长简直定方法当被测物的主波长确定之后，再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征，选择次波长，使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值，而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较年夜的不同.一般来说，次波长应年夜于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体应用对某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目，尤其是单试剂分析中，可以利用双波长的方式来部份消除样品自己的光吸收干扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总卵白（双缩脲法）主波长500nm，次波长576nm；血清白卵白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm，镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式，加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪年夜多可用双试剂方式分析，其优点是：①可提高试剂的稳定性，大都双试剂混合成单一工作试剂时，其稳按时间缩短；②能设置两点终点法，来消除来自样品自己的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定，血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应，使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂，使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂，启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸，而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT的活性，从而消除以上副反应的影响.四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能，以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围，试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而酿成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目，其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度，这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度，适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变动速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定，其空白吸光度可随着时间逐渐发生变动，这种变动的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关，且因试剂的组成和生产厂家的分歧而分歧.这种变动会影响测定结果的准确性，一般使结果偏高.如果设置此项监测，分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变动速率.在以监测NAD（P）H 减少为指示反应的酶活性测定中，空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中，空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用，已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果发生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性，用双波长或多波长检测其性质和水平，一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的年夜小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸水平.然后在结果计算时自动减去这部份干扰，这将有利于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否达到终点或平衡点.一些分析仪在所选终点后再选一个测光点，比力这两点吸光度的不同来判断反应是否达到终点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度，因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归，计算出各点的方差，根据方差值的年夜小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变动速率与连续监测期最后若干点的变动速率进行比力，来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时，如果在监测期内吸光度上升或下降超越其底物耗尽值，则说明该样品酶活性非常高，底物将被耗尽，监测期的吸光度将偏离线性，使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示，该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对采纳负反应分析酶活性的方法甚为重要.见图7-9 6．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围，样品结果若超越此范围，分析仪将显示测定结果超越线性范围的提示，大都分析仪会自动将样品减量或增量重新测定.一、分析方法分类（一）终点法被测物质在反应过程中完全被转酿成产物，即达到反应终点，根据终点吸光度的年夜小求出被测物浓度，称为终点法（end essay）.实际上被测物并没有完全被转变，而只是与产物达到一个静态的化学平衡，因此该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看，达到反应终点或平衡点时，吸光度将不再变动.分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值，求出其平均值计算结果，并可根据两点的吸光度差来判断反应是否达到反应终点.终点法参数设置简单，反应时间一般较长，精密度较好.终点时间简直定：①根据时间-吸光度曲线来确定，如Trinder反应测定尿酸，反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定，因而可将5min作为反应终点.②根据被测物反应终点，结合干扰物的反应情况来确定，如在血清白卵白的溴甲酚绿法测定中，白卵白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应，之后α球卵白和β球卵白与溴甲酚绿发生 "慢反应"，使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升，继续约达10min，因此终点时间应采纳10～30s，而不应选择10min. 1．一点终点法：在反应达到终点，即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值，这种方法称为一点终点法（one point end essay），其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数，详见第五节二把持方法.2．两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时，选择第一个吸光度，在反应达到终点或平衡时选择第二个吸光度，此两点吸光度之差用于计算结果，称为两点终点法（two point end essay），其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品自己光吸收（见图7-5）造成的干扰.在单试剂分析加入试剂的早期、或双试剂分析中第二试剂加入之初，若指示反应吸光度尚未明显变动，则可在此时选择第一个吸光度，在指示反应终点时选择第二个吸光度，从而设置成两点终点法.但指示反应早期吸光度无明显变动的化学反应较少，如单试剂方式测定总卵白、白卵白、钙、磷、镁等的终点法分析项目，及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目，因反应早期吸光度已有明显变动，因而均难以用上述方式设置两点终点法.但在双试剂分析中，如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前，此时指示反应一般尚未开始，则能容易设置两点终点法.在此要注意必需将两次读吸光度时分歧比色液体积进行校正.目前全自动分析仪均具有此自动校正功能，不用手工进行校正.（二）固按时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点，此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度，这两点的吸光度差值用于结果计算，称为固按时间法（fixed-time essay），反应曲线见图7-6.其计算公式与两点终点法相同，为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐，反应的最初30s内，血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应，且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后，碱性苦味可与卵白质以及其它慢反应干扰物反应.这样选用反应的第二个30s为测按时间，既防止了快反应物质的干扰，也防止了慢反应物质的影响，使肌酐浓度与吸光度变动呈良好的线性关系，有利于提高分析的特异性和准确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay），是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时，连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值，并以此线性期的单元吸光度变动值（ΔA/min）计算结果，见图7-7A 和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等，如图7-7C所示，图中δ1及δ5值偏小，而δ2＝δ3＝δ4，故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应，期间的ΔA/min 即为酶促反应的初速度，其年夜小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min，根据此值再准确地计算酶活性，因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度，一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值，代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值叙述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中，因酶活性尚无公认的校准品可用，因而根据酶活性的国际单元界说得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× ，将此式中以K来暗示，此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出，即为理论K值，可作为分析参数输入到分析仪中.采纳理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进机电精度、滤光片带宽等方面的不同，可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常年夜，由于反应盘是半流露的，因此随着较冷试剂的加入，反应盘中的温度会逐渐降低，尽管开始测按时反应盘温度已升到37°C，但在某一项目测定过程的开始阶段，温度可能达不到37°C ，甚至仅35°C左右，且反应过程中仍有可能上下摆荡，这对酶学反应来说影响是很年夜的.如采纳37°C时的理论K值，将会使测定结果降低，温度的摆荡还会使得结果的重复性降低.固然，若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温，则基本不影响反应盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响，书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的分歧，因而有需要获得实际的摩尔吸光系数，然后用来计算的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH （NADPH）没有标准纯制品，而且配成溶液后稳定性又较差，不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器，须通过有NAD+(NADP+)介入的反应途径.用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时，葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有标准纯制品，又有国家批准文号的葡葡糖标准液.因此，根据公式A=εbC，已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度，测得葡萄糖标准管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数εμL，酶试剂加入量为335μL，比色杯光径为0.7cm，在340nm测得吸光度为0.465，则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424，即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH （NADPH）的摩尔吸光系数为6424，而理论上NADH （NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物，其自己无色，经酶作用后释放出有色的反应产物，在405nm波长具有吸收峰.最经常使用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物，经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline，4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid， ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm)，对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm)，对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：① 4-NP标准贮存液(1Ommo1/L).② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L，以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成).③底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中，37℃,pH l0.09土0.02).测定方法：4-NP标准液加入量为5μL，底物缓冲液加入量为350μL，波长405nm，光径0.7cm，温度37℃，测定得吸光度为A1；另用蒸馏水取代4-NP标准液，按上述方法测定其吸光度为A2，4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2，若测得ΔA 为0.460，则。
肌酐酶法测定的两点法分析
肌酐酶法测定的两点法分析摘要：目的：肌酐酶酶测定的两点分析。
方法：通过两种试剂进行比较。
反应温度为37℃，波长为500～520 纳米(主)/650 纳米(次)；标准为15毫升；样品也为15 毫升；试剂Ⅰ：200 毫升，孵育时间为300秒；试剂Ⅱ：50 毫升，第一点读数时间为120秒，第二点读数时间为300秒。
结果：酶法具有去除肌酸的干扰能力，有线性范围宽，精度高等特点。
结论：两点法对肌酐酶法测点有良好的作用。
关键字：肌酐酶法两点法对于酶法测定肌酐，目前已报告的有四种方式，其中三种均为紫外测定，一种为比色测定。
然而，在相比之下比色测定在除去肌酸的干扰能力、线性范围、精度等具有更高的优越性；市场上出售的商品试剂盒大多采用此法。
但fossati 原法的反应时间比较长，且要做一血清空白以除去血清中肌酸的干扰，这样不适合进行自动分析。
自动分析的一般反应时间为十分钟，为了除去肌酸的干扰必须采用两步法，反应时间要求在五分钟内达到。
根据实验。
必须将几种工具酶的用量增加到fossati原法的五到十倍。
然而，在实验过程中发现几种工具酶的水解速率均比较缓慢，反应的线性时间比较长；所以，将其改成两点法或是速率法测定，会取得很好的实验结果。
这也体现出两点法的优势。
1原理第一步反应：排除肌酸干扰第二步反应：测定肌酐2材料与方法2.1仪器：自动分析仪HITACHI7170，Beckman Synchron △CX5和Ciba Coring Express Plus。
分光光度计Beckman DU-640。
2.2原料试剂：原料试剂采用的工具酶比较多，如：肌酐酰氨基水解酶，肌酸脒基水解酶，肌氨酸氧化酶，棘根过氧化物酶，抗坏血酸氧化酶，这些工具酶均为Boehringer Mannheim公司产品。
3，5-二氯-2-羟-苯磺酸(DHBA)，4-氨基安替比林(4-AAP)和肌酐，均选用适量的剂量。
2.3应用试剂：试剂Ⅰ：每升磷酸盐缓冲液(150 Mmol/L,pH为7.5)中含CRTase 20 kU,SO 6 kU，POD 1 kU,ASO 1 kU,DHBA 3 Mmol,K4Fe(CN)6 20 Mmol,和4-AAP 4 Mmol。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变化量以求取酶反应初速度的方法。
终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量，以求出酶活力的方法，亦称平衡法。
速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应的初速度的方法，即连续监测法。
一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
（两点法）3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysis paramete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
常用生化检测项目分析方法与参数设置
常用生化检测项目分析方法及参数设置一、常用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测常用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总蛋白（双缩脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等。
以上项目中，除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采用一点终点法外，其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法，包括总蛋白、白蛋白测定均已有双试剂可用。
2．固定时间法苦味酸法测定肌酐采用此法。
3．连续监测法对于酶活性测定一般应选用连续监测法，如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。
一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等，也可用连续监测法。
4．透射比浊法透射比浊法可用于测定产生浊度反应的项目，多数属免疫比浊法，载脂蛋白、免疫球蛋白、补体、抗"O"、类风湿因子，以及血清中的其他蛋白质如前白蛋白、结合珠蛋白、转铁蛋白等均可用此法。
二、分析参数设置分析仪的一些通用操作步骤如取样、冲洗、吸光度检测、数据处理等，其程序均已经固化在存储器里，用户不能修改。
各种测定项目的分析参数（analysisparamete）大部分也已设计好，存于磁盘中，供用户使用；目前大多数生化分析仪为开放式，用户可以更改这些参数。
生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道，由用户自己设定分析参数。
因此必须理解各参数的确切意义。
一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件，没有这些参数无法进行检测。
1．试验名称试验名称（testcode）是指测定项目的标示符，常以项目的英文缩写来表示。
2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等，根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型。
干化学速率法检测肌酐在临床的应用分析
干化学速率法检测肌酐在临床的应用分析作者：李敬芝来源：《中国当代医药》2010年第02期[摘要]目的：通过干化学速率法与苦味酸速率法检测血肌酐相比较，进一步探讨其精密度、抗干扰及防污染能力。
方法：通过不精密度试验、50例对比试验、干扰试验进行检测。
结果：千化学速率法批内、批间，标准差、CV％值均小于苦味酸速率法。
对比试验：干化学速率法与苦味酸速率法相关系数r=0.964 6，P>0.05。
干扰试验：干化学速率法基本无干扰。
苦味酸速率法维生素227 zgL以上有正干扰。
胆红素43~mol／L以上有负干扰。
结论：干化学速率法不但精密度高，而且抗干扰能力强。
与苦味酸速率法有良好的一致性。
加标本采用一次性吸头，无需反应杯，又防止了标本间的交叉污染。
因此，对临床的使用价值很高。
[关键词]速率法；苦味酸；干化学；肌酐[中图分类号]R115[文献标识码]B[文章编号]1674-4721(2010)01(b)-072-01临床实验室肌酐测定的方法从最早的Jaffe肌酐分析法，又发展为同一原理的速率法。
笔者通过对苦味酸速率法和干化学速率法在不同仪器上检测肌酐做了对比分析。
1资料与方法1.1试剂上海长征康仁医学科学有限公司生产的苦味酸速率法试剂盒和美国强生公司生产的干化学试剂子弹夹。
标准品是两厂家配备的。
仪器：日本olympus-AU640型全自动生化分析仪和美国强生VITROS 5.1全自动干式生化分析仪。
1.2干化学速率法反应温度37℃，工作环境温度10～30℃。
湿度20％～80％。
工作电源220 V,50 Hz，通过光的透射与反射来测量。
待测标本加到试剂干片上，反应3-5 min即出结果。
样本浓度可通过Kubelka-Munk理论来计算。
苦味酸速率法：波长520 nm，温度37℃，样品：试剂为20：200。
反应时间为54～126 s，读取吸光度的变化。
2结果2.1不精密度试验用混合血清同时使用两种方法。
两点法、终点法、速率法
什么叫两点法、终点法、速率法?之马矢奏春创作两点法：测定酶反应开始后某一时间内(t1到t2)产物或底物浓度的总变动量以求取酶反应初速度的方法.终点法：通过测定酶反应开始到反应达到平衡时产物或底物浓度总变动量, 以求出酶活力的方法, 亦称平衡法.速率法：是指连续测定(每15秒~1分钟监测一次)酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变动来求出酶反应的初速度的方法, 即连续监测法.一、经常使用生化检测项目分析方法举例1．终点法检测经常使用的有总胆红素（氧化法或重氮法）、结合胆红素（氧化法或重氮法）、血清总卵白（双缩脲法）、血清白卵白（溴甲酚氯法）、总胆汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、总胆固醇（胆固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂卵白胆固醇（直接测定法）、钙（偶氮砷Ⅲ法）、磷（紫外法）、镁（二甲苯胺蓝法）等.以上项目中, 除钙、磷和镁基本上还使用单试剂方式分析因而采纳一点终点法外, 其它测定项目都可使用双试剂故能选用两点终点法, 包括总卵白、白卵白测定均已有双试剂可用.2．固按时间法苦味酸法测定肌酐采纳此法.（两点法）3．连续监测法对酶活性测定一般应选用连续监测法, 如丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、γ谷氨氨酰基转移酶、淀粉酶和肌酸激酶等.一些代谢物酶法测定的项目如己糖激酶法测定葡萄糖、脲酶偶联法测定尿素等, 也可用连续监测法.4．透射比浊法透射比浊法可用于测定发生浊度反应的项目, 大都属免疫比浊法, 载脂卵白、免疫球卵白、补体、抗"O"、类风湿因子, 以及血清中的其他卵白质如前白卵白、结合珠卵白、转铁卵白等均可用此法.二、分析参数设置分析仪的一些通用把持步伐如取样、冲刷、吸光度检测、数据处置等, 其法式均已经固化在存储器里, 用户不能修改.各种测定项目的分析参数（analysisparamete）年夜部份也已设计好, 存于磁盘中, 供用户使用；目前年夜大都生化分析仪为开放式, 用户可以更改这些参数.生化分析仪一般另外留一些检测项目的空白通道, 由用户自己设定分析参数.因此必需理解各参数简直切意义.一、分析参数介绍（一）必选分析参数这类参数是分析仪检测的前提条件, 没有这些参数无法进行检测. 1．试验名称试验名称（test code）是指测定项目的标示符, 常以项目的英文缩写来暗示.2．方法类型（也称反应模式）方法类型（assay）有终点法、两点法、连续监测法等, 根据被检物质的检测方法原理选择其中一种反应类型.3．反应温度一般有30℃、37℃可供选择, 通常固定为37℃. 4．主波长主波长（primary wavelength）是指定一个与被测物质反应产物的光吸收有关的波长.5．次波长次波长（secondary wavelength）是在使用双波长时, 要指定一个与主波长、干扰物质光吸收有关的波长.6．反应方向反应方向（response direction）有正向反应和负向反应两种, 吸光度增加为正向反应, 吸光度下降为负向反应. 7．样品量样品量（sampling volum）一般是2μl～35μl, 以0.1μl步进, 个别分析仪最少能达到1.6μl.可设置常量、减量和增量.8．第一试剂量第一试剂量（first regengt volum）一般是20～300μl, 以1μl步进.9．第二试剂量第二试剂量（second regengt volum）一般也是20～300μl, 以1μl步进.10．总反应容量总反应容量（total reacting volum）在分歧的分析仪有一个分歧的规定范围, 一般是180～350μl, 个别仪器能减少至120μl.总反应容量太少无法进行吸光度测定.11．孵育时间孵育时间（incubate time）在终点法是样品与试剂混匀开始至反应终点为止的时间, 在两点法是第一个吸光度选择点开始至第二个吸光度选择点为止的时间.12．延迟时间延迟时间（delay time）在连续监测法中样品与反应试剂（第二试剂）混匀开始至连续监测期第一个吸光度选择点之间的时间.13．连续监测时间连续监测时间（continuous monitoring time）在延迟时间之后即开始, 一般为60～120s, 很多于4个吸光度检测点（3个吸光度变动值）.14．校准液个数及浓度校准曲线线性好并通过坐标零点的, 可采纳一个校准液（calibrator）；线性好但欠亨过坐标零点, 应使用两个校准液；对校准曲线呈非线性者, 必需使用两个以上校准液.每一个校准液都要有一个合适的浓度.15．校准K值或理论K值通过校准获得的K值为校准K值（calibrate coefficient）或由计算得出的K值为理论K值. 16．线性范围即方法的线性范围（linearity range）, 超越此范围应增加样品量或减少样品量重测.与试剂/样品比值有关.17．小数点位数检测结果的小数点位数（decimal point digit）.（二）备选分析参数这类分析参数与检测结果的准确性有关, 一般来说不设置这类分析参数, 分析仪也能检测出结果, 但如果样品中待测物浓度太高等, 检测结果可能禁绝确.1．样品预稀释设置样品量、稀释剂量和稀释后样品量三个数值, 即可在分析前自动对样品进行高倍稀释.2．底物耗尽值底物耗尽值（substrate exhaust limit）在负反应的酶活性测定中, 可设置此参数, 以规定一个吸光度下降限.若低于此限时底物已太少, 缺乏以维持零级反应而招致检测结果禁绝确.3．前区检查免疫比浊法中应用, 以判断是否有抗原过剩.将终点法最后两个吸光度值的分歧（ΔA）设置一个限值, 如果后一点的吸光度比前一点低, 暗示已有抗原过剩, 应稀释样品后重测. 4．试剂空白吸光度范围超越此设定范围暗示试剂已蜕变, 应更换合格试剂.5．试剂空白速率连续监测法中使用, 是试剂自己在监测过程中没有化学反应时的变动速率.6．方法学赔偿系数用于校准分歧分析方法间测定结果的一致性, 有斜率和截距两个参数.7．参考值范围对超越此范围的测定结果, 仪器会打印出提示.（三）某些参数的特殊意义1．最小样品量最小样品量是指分析仪进样针能在规定的误差范围内吸取的最小样品量.一般分析仪的最小样品量是2μl, 目前也有小至1.6μl的.在样品含高浓度代谢产物或高活性酶浓度的情况下往往需采纳分析仪的最小样品量作为减量参数, 从而使分析仪检测范围（与线性范围分歧）的上限得以扩年夜.2．最年夜试剂量方法灵敏度很高而线性上限低的检测项目, 如血清白卵白的溴甲酚氯法测定, 以往手工法把持时样品量10μl, 试剂量4ml, 这样试剂量/样品量比例（R/S）为200, 线性上限则为60g/L.此法移植到分析仪上后, R/S却很难达到200, 致使线性上限变低.因此对这类检测项目最年夜试剂量非常重要.3．弹性速率在酶活性测定中, 当酶活性太高, 在连续监测期中已不呈线性反应时, 有些仪器具有弹性速率（flexrate）功能, 能自动选择反应曲线上连续监测期中仍呈线性的吸光度数据计算结果, 使酶活性测定的线性范围得以扩年夜.如AST可从1000U/L扩展至4000U/L, 从而减少稀释及重测次数、降低本钱.4．试剂空白速率当样品中存在胆红素时, 胆红素对碱性苦味酸速率法或两点法测定肌酐有负干扰.因为胆红素在肌酐检测的波长505nm有较高光吸收, 而且胆红素在碱性环境中可被氧化转变,因而在肌酐反应过程中胆红素的光吸收呈下降趋势.若在加入第一试剂后一段时间内设置试剂空白速率, 因为此段中苦味酸尚未与肌酐反应, 而胆红素在第一试剂的碱性环境中已同样被氧化转变, 因而以第二试剂加入后的速率变动, 减去试剂空白速率变动, 即可消除胆红素的负干扰, 见图7-8.二、单波长和双波长方式（一）概念采纳一个波长检测物质的光吸收强度的方式称为单波长(mono-wavelength)方式.当反应液中含有一种组分, 或在混合反应液中待测组分的吸收峰与其它共存物质的吸收波长无重叠时, 可以选用.在吸光度检测中, 使用一个主波长和一个次波长的称双波长方式.当反应液中存在干扰物的较年夜吸收、从而影响测定结果的准确性时, 采纳双波长方式更好.（二）双波长的作用双波长(di-wavelength)测定优点是①消除噪音干扰;②减少杂散光影响;③减少样品自己光吸收的干扰.从光源, 到比色杯、单色器、检测器的整个光路系统中, 均存在着随时间发生变动的不稳定的检测信号, 即噪音, 而双波长检测是同时进行的, 两种波长检测发生的噪音基本上相同, 因而能消除噪音干扰.当样品中存在非化学反应的干扰物如甘油三酯、血红卵白、胆红素等时, 会发生非特异性的光吸收, 而干扰测定结果的准确性.采纳双波长方式测定可以部份消除这类干扰, 提高检测的准确性.（三）次波长简直定方法当被测物的主波长确定之后, 再选择次波长.如根据甘油三酯等干扰物吸收光谱特征, 选择次波长, 使干扰物在主、次波长处有尽可能相同的光吸收值, 而被测物在主、次波长处的光吸收值应有较年夜的不同.一般来说, 次波长应年夜于主波长100nm.以主波长与次波长吸光度差来计算结果.（四）双波长的具体应用对某些反应速度快且无法设置为两点终点法的分析项目, 尤其是单试剂分析中, 可以利用双波长的方式来部份消除样品自己的光吸收干扰.目前用单试剂法测定的项目应用双波长的为血清总卵白（双缩脲法）主波长500nm, 次波长576nm；血清白卵白（溴甲酚氯法）主、次波长分别为600和700nm；钙（偶氮砷Ⅲ法）主、次波长分别为 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波长为340、405nm, 镁（二甲苯胺蓝法）主、次波长为505和 600nm.三、单试剂和双试剂方式反应过程中只加一次试剂称单试剂方式, 加两次试剂便为双试剂方式.目前的生化分析仪年夜多可用双试剂方式分析, 其优点是：①可提高试剂的稳定性, 大都双试剂混合成单一工作试剂时, 其稳按时间缩短；②能设置两点终点法, 来消除来自样品自己的光吸收干扰；③在某些项目检测时能消除非特异性化学反应的干扰.如血清ALT测定, 血清中的内源性丙酮酸及其它酮酸也可与试剂中的指示酶（乳酸脱氢酶）起反应, 使结果偏高.若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一试剂, 使其它酮酸与指示酶反应之后再加入含有α-酮戊二酸的第二试剂, 启动真正的ALT酶促反应生成丙酮酸, 而丙酮酸与乳酸脱氢酶的反应消耗的NAD＋能真正反映ALT 的活性, 从而消除以上副反应的影响.四、测定过程的自动监测各种自动生化分析仪或多或少都具有对测定过程进行各种监测的功能, 以便在没有人"监督"化学反应的情况下提高检测的准确性.高档分析仪的监测功能更强.1．试剂空白监测每种试剂都有一定的空白吸光度范围, 试剂空白吸光度的改变往往提示着该试剂的蜕变：如利用Trinder反应为原理的检测试剂会因酚被氧化为醌而酿成红色；碱性磷酸酶、γ－谷氨酰转移酶、淀粉酶等检测试剂会因基质分解出硝基酚或硝基苯胺而变黄；有些试剂久置后变浑浊.这些情况均可使空白吸光度升高.丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶等负反应检测项目, 其试剂在放置过程中空白吸光度会因NADH自行氧化为NAD+而下降等.试剂空白的测定方法有两种：①每瓶试剂在使用前通过对试剂空白校准来确定试剂空白吸光度, 这种方式适用于先取样品后加试剂的分析仪.②每个样品测定前均检测试剂空白吸光度, 适用于先加试剂后取样品的分析仪.2．试剂空白变动速率监测一些酶试剂在反应温度下不稳定, 其空白吸光度可随着时间逐渐发生变动, 这种变动的主要原因与工具酶或辅酶的纯度有关, 且因试剂的组成和生产厂家的分歧而分歧.这种变动会影响测定结果的准确性, 一般使结果偏高.如果设置此项监测, 分析仪在结果计算时会自动减去试剂空白变动速率.在以监测NAD（P）H减少为指示反应的酶活性测定中, 空白速率可监测并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原为底物的酶活性测定中, 空白速率可监测并消除底物自身分解造成的吸光度升高.有关空白速率监测在胆红素对碱性苦味酸速率法测定肌酐负干扰消除中的作用, 已如前述.3．样品信息监测由于样品的溶血、脂浊、黄疸会对测定结果发生非化学反应的干扰.根据溶血、脂浊、黄疸的光谱吸收特性, 用双波长或多波长检测其性质和水平, 一般是测定样品在600nm／570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的年夜小来分别判断样品溶血、脂浊和黄疸水平.然后在结果计算时自动减去这部份干扰, 这将有利于提高分析结果的可靠性.4．结果可靠性监测（1）终点监测：终点法测定要判断所选的测光点是否达到终点或平衡点.一些分析仪在所选终点后再选一个测光点, 比力这两点吸光度的不同来判断反应是否达到终点.（2）线性期监测：连续监测法选择时间－吸光度反应曲线上的线性期来计算酶活性或被测物浓度, 因此仪器要确定此连续监测期是否呈线性.其监测方法为①将连续监测到的各吸光度值进行线性回归, 计算出各点的方差, 根据方差值的年夜小来判断是否呈线性；②取连续监测期开始若干点的变动速率与连续监测期最后若干点的变动速率进行比力, 来判断是否为线性期.5．底物消耗的监测在连续监测法测定酶活性时, 如果在监测期内吸光度上升或下降超越其底物耗尽值, 则说明该样品酶活性非常高, 底物将被耗尽, 监测期的吸光度将偏离线性, 使测定结果不成靠.此时不打印结果或打印结果同时也打印出底物耗尽提示, 该样品应稀释一定的倍数重新测定.此监测对采纳负反应分析酶活性的方法甚为重要.见图7-96．方法线性范围监测每种待测物分析都有一个可测定的浓度或活性范围, 样品结果若超越此范围, 分析仪将显示测定结果超越线性范围的提示, 大都分析仪会自动将样品减量或增量重新测定.一、分析方法分类（一）终点法被测物质在反应过程中完全被转酿成产物, 即达到反应终点, 根据终点吸光度的年夜小求出被测物浓度, 称为终点法（end essay）.实际上被测物并没有完全被转变, 而只是与产物达到一个静态的化学平衡, 因此该法称为平衡法更为恰当.从时间-吸光度曲线来看, 达到反应终点或平衡点时, 吸光度将不再变动.分析仪通常在反应终点附近连续选择两个吸光度值, 求出其平均值计算结果, 并可根据两点的吸光度差来判断反应是否达到反应终点.终点法参数设置简单, 反应时间一般较长, 精密度较好.终点时间简直定：①根据时间-吸光度曲线来确定, 如Trinder反应测定尿酸, 反应曲线上3～5min时其吸光度已趋向稳定, 因而可将5min作为反应终点.②根据被测物反应终点, 结合干扰物的反应情况来确定, 如在血清白卵白的溴甲酚绿法测定中, 白卵白与溴甲酚绿在10s内很快完成反应, 之后α球卵白和β球卵白与溴甲酚绿发生 "慢反应", 使反应曲线上吸光度在10s后仍继续缓慢上升, 继续约达10min, 因此终点时间应采纳10～30s, 而不应选择10min.1．一点终点法：在反应达到终点, 即在时间-吸光度曲线上吸光度不再改变时选择一个终点吸光度值, 这种方法称为一点终点法（one point end essay）, 其反应曲线见图7-3.其检测结果的计算公式是：待测物浓度CU=（待测吸光度AU－试剂空白吸光度AB）×K. K为校准系数, 详见第五节二把持方法.2．两点终点法：在被测物反应或指示反应尚未开始时, 选择第一个吸光度, 在反应达到终点或平衡时选择第二个吸光度, 此两点吸光度之差用于计算结果, 称为两点终点法（two point end essay）, 其反应曲线见图7-4.计算公式为CU=（待测吸光度A2－待测吸光度A1）×K.该法能有效地消除溶血（hemolysis）、黄疸（icterus）和脂浊（lipo-turbid）等样品自己光吸收（见图7-5）造成的干扰.在单试剂分析加入试剂的早期、或双试剂分析中第二试剂加入之初, 若指示反应吸光度尚未明显变动, 则可在此时选择第一个吸光度, 在指示反应终点时选择第二个吸光度,从而设置成两点终点法.但指示反应早期吸光度无明显变动的化学反应较少, 如单试剂方式测定总卵白、白卵白、钙、磷、镁等的终点法分析项目, 及双试剂方式测定葡萄糖、总胆固醇、甘油三酯等的终点法分析项目, 因反应早期吸光度已有明显变动, 因而均难以用上述方式设置两点终点法.但在双试剂分析中, 如果将第一吸光度选择在第二试剂加入前, 此时指示反应一般尚未开始,则能容易设置两点终点法.在此要注意必需将两次读吸光度时分歧比色液体积进行校正.目前全自动分析仪均具有此自动校正功能, 不用手工进行校正.（二）固按时间法指在时间-吸光度曲线上选择两个测光点, 此两点既非反应初始吸光度亦非终点吸光度, 这两点的吸光度差值用于结果计算, 称为固按时间法（fixed-time essay）, 反应曲线见图7-6.其计算公式与两点终点法相同, 为CU=(A2-A1)×K.有时也称此法为两点法.该分析方法有助于解决某些反应的非特异性问题.例如：苦味酸法测定肌酐, 反应的最初30s内, 血清中快反应干扰物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能与碱性苦味酸反应；在第二个30s时碱性苦味酸主要与肌酐反应, 且此段时间－吸光度曲线的线性较好（故也可用连续监测法测定肌酐）；在80～120s及其以后, 碱性苦味可与卵白质以及其它慢反应干扰物反应.这样选用反应的第二个30s为测按时间, 既防止了快反应物质的干扰, 也防止了慢反应物质的影响, 使肌酐浓度与吸光度变动呈良好的线性关系, 有利于提高分析的特异性和准确度.（三）连续监测法连续监测法（continuous monitoring essay）又称速率法（rate essay）, 是在测定酶活性或用酶法测定代谢产物时, 连续选取时间-吸光度曲线中线性期的吸光度值, 并以此线性期的单元吸光度变动值（ΔA/min）计算结果, 见图7-7A和B.所谓线性期就是各点吸光度差值相等, 如图7-7C所示, 图中δ1及δ5值偏小, 而δ2＝δ3＝δ4, 故A1点至A4点属线性段.此线性期对底物来说属零级反应, 期间的ΔA/min即为酶促反应的初速度, 其年夜小与被测酶活性成正比.连续监测法的优点即是可以确定线性期并计算ΔA/min, 根据此值再准确地计算酶活性, 因而使自动生化分析仪在酶活性测定方面显著地优于手工法.连续监测法也可用于测定呈线性反应的代谢物浓度, 一般是某些基于酶法测定的代谢物.酶活性（U/L）＝ΔA/min×理论（或校准）K值, 代谢物浓度CU=ΔA/min×校准K值.关于理论K值和校准K值叙述如下：1．理论K值：多用于酶活性测定中, 因酶活性尚无公认的校准品可用, 因而根据酶活性的国际单元界说得出酶活性的计算公式为：酶活性(U/L)=ΔA/min× , 将此式中以K来暗示, 此K值可通过对已知值即指示物质的毫摩尔消光系数（ε）、反应液总容量（TV）、样品容量（SV）和比色杯光径（d）计算后得出, 即为理论K值, 可作为分析参数输入到分析仪中.采纳理论K值的前提应当是样品和试剂的加量准确、比色杯光径准确、温度控制精确以及波长准确等.但事实上由于各型分析仪在注射器容积步进机电精度、滤光片带宽等方面的不同, 可造成样品和试剂加量以及吸光度检测的偏差.温度的影响有时也非常年夜, 由于反应盘是半流露的, 因此随着较冷试剂的加入, 反应盘中的温度会逐渐降低, 尽管开始测按时反应盘温度已升到37°C, 但在某一项目测定过程的开始阶段, 温度可能达不到37°C , 甚至仅35°C左右, 且反应过程中仍有可能上下摆荡, 这对酶学反应来说影响是很年夜的.如采纳37°C时的理论K值, 将会使测定结果降低, 温度的摆荡还会使得结果的重复性降低.固然, 若试剂在加入反应杯前经试剂臂内加热装置预温, 则基本不影响反应盘温度.由于摩尔吸光系数受比色杯光径、波长、带宽以及加样系统的准确性等的影响, 书本上或试剂厂家提供的理论摩尔吸光系数可能与实际所用分析仪所测的分歧, 因而有需要获得实际的摩尔吸光系数, 然后用来计算的K值称为实测K值.（1）NADH（NADPH）摩尔吸光系数的测定：NADH（NADPH）没有标准纯制品, 而且配成溶液后稳定性又较差, 不能直接用NADH 或NADPH标准液来校正仪器, 须通过有NAD+(NADP+)介入的反应途径.用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脱氢酶(GD)方法测定葡萄糖时, 葡萄糖的消耗与NADH的生成呈等摩尔关系.葡萄糖有标准纯制品, 又有国家批准文号的葡葡糖标准液.因此, 根据公式A=εbC, 已知比色杯光径b和葡萄糖标准液浓度, 测得葡萄糖标准管的吸光度A后即可计算出NADH（NADPH）的摩尔吸光系数ε为 A/bC.假设,葡萄糖标准液浓度为1Ommo1/L(0.01mol/L), 标准液加入量为3.5μL, 酶试剂加入量为335μL, 比色杯光径为0.7cm, 在340nm测得吸光度为0.465, 则实测NADH摩尔吸光系数= ＝6424 , 即在此台分析仪上340nm波长处测得NADH（NADPH）的摩尔吸光系数为6424, 而理论上NADH（NADPH）的ε为6220.（2）"色素原"酶促产物在405nm波长摩尔吸光系数的测定：有许多酶底物为人工合成的"色素原"底物, 其自己无色, 经酶作用后释放出有色的反应产物, 在405nm波长具有吸收峰.最经常使用色素原底物及其产物为: ALP测定以磷酸对硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate, 4-NPP)为底物, 经酶作用后释放出黄色的对硝基苯酚(4-Nitrophenol, 4-NP), GGT测定以γ-L-谷氨酰对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或γ-L-谷氨酰-3-羟基-对硝基苯胺(γ-L-Glutamyl-3-carboxyl-p-nitroan)为底物, 经酶作用后释放出黄色的对硝基苯胺(p-Nitroaniline, 4-NA)或对硝基-5-氨基苯甲酸(2-amino-nitrobenzoicacid, ANBA).对硝基苯酚的摩尔吸光系数为18700(405nm), 对硝基苯胺的摩尔吸光系数为9870(405nm), 对硝基-5-氨基苯甲酸的摩尔吸光系数为9490(405nm).下面是对硝基苯酚的摩尔吸光系数测定方法.试剂：① 4-NP标准贮存液(1Ommo1/L).② 4-NP标准应用液(2.5mmo1/L, 以0.84mol/L AMP缓冲液稀释而成).③ 底物缓冲液(l5mmol/L 4-NPP配于0.84mol/L AMP-HCL缓冲液中, 37℃,pHl0.09土0.02).测定方法：4-NP标准液加入量为5μL, 底物缓冲液加入量为350μL, 波长405nm, 光径0.7cm, 温度37℃, 测定得吸光度为A1；另用蒸馏水取代4-NP标准液, 按上述方法测定其吸光度为A2, 4-NP标准液吸光度ΔA= A1- A2, 若测得ΔA为0.460, 则实测4-NP摩尔吸光系数＝＝186622．校准K值酶活性校准品经校准把持后由分析仪自动计算得出.在进行酶学测按时, 如果分析条件的变动如温度、样品试剂加量和吸光度检测偏差可同等水平地影响校准物和待测样品, 则使用校准品能进行赔偿.一般来说以使用校准K值为好, 但必需有两个先决条件：①必需使用配套的试剂；②必需使用配套的高质量的校准品, 该校准品应具有溯源性.使用与该分析仪配套的酶活性校准品也可获得较好的酶活性测定结果.关于酶活性标准品, 欧洲标准局（BCR）和美国国家标准技术研究院（NIST）均发表了人血清基质的酶活性标准物, 但目前尚无公认的标准（校准）品问世.（四）透射比浊法。
消除肌酐测定中两种干扰因素的探讨
ＤＥＬ ＴＡ —Ｔ ＬＷ ＥＡＲＩ ＴＹ
６ ０Ｓ
８ ４ｍｍｏ／Ｌ ８ ｌ
１４ 样 品 的 处 理 与 测 定 ： ．
取肝素抗凝 血液样 品 １ ０份 ， 中 总 胆 红 素 ＜ 其
１ ￣ ｏ／ ０ ｍ ｌＬ和总 胆红 素 ＞１ ｐ ｏ／ ５ ￣ ｌＬ血液 样 品各 ５份 ｍ 编号； 总胆 红 素 ＜１１ ｏ Ｌ者 编 为 １—５号 ； ０￣ ｌ ｍ ／ 总胆 红
湖 北 职 业 技 术 学 院 学 报
Ｊ ＵＲＮ Ｏ ＡＬ ＯＦ ＨＵＢ ＩＰ ．Ｔ ＣＨＮＩ ＮＳ ｍ Ｅ Ｅ ＯＩ Ｅ Ｙ ＣＩ Ｔ Ｊ Ｔ
Ｎｏ． １ １ ４ Ｖｏ ． ｌ
Ｄｅ ． ｏ ｃ ２ ０８
［ 章编 号 ］１７ －８ ７ （０ ８ ０ —（】５＿ ２ 文 ６ １－ １８ ２０ ）４ ｘ８－０
Ｈ ０ ３ ￣ 浴 ３ ｍｉ、 ２７Ｃ水 ０ ｎ 未溶 血加 ０ ８ ｍ ｌＬ Ｈ ０ ３ ￣ 浴 ２ ｍｎ五种 处理 的血液样 品 中肌 酐值 。结果 ： ．８ ｏ ２ ２７Ｃ水 ／ ０ｉ 其他
四组与第一组差异均有统计学意义（ ＜ ．１ ； Ｐ ００ ） 第三组与第二组、 第五组测定结果有差别（ ００ 或 Ｐ＜ ． Ｐ＜ ．１ ０ ｏ ） 而第三组与 第四组的测 定结果则无 差别 （ Ｏ０ ） ５， Ｐ＞ ．５ 。结论 ： ０８ｍ ｌＬＨ２２处理溶 血样 品后 ， 用 ．８ ｏ Ｏ ／ 再进 行
． １２ 仪 器： ＲＴ一 ０ ． Ｕ Ｉ ８０半 自动 生化分析仪 、 求精加 １ ５ 统 计 处 理 方 法 ： 样 器 、 浴箱 水 实验结果采用配对 ｔ 检验 ， ＳＳＩ． 用 ＰＳ２０进行分析
１３ 程序编 制 ： ．
ｒ ＥＭ Ｐ
Ｗ ・Ｌ
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样品空白速率排除胆红素对肌酐两点法
测定的负干扰
石凌波，虞勇明，林龙顺，刘书霞
(广州军区广州总医院检验科,广州510010)
摘要利用碱性试剂作样品空白速率消除黄疸血清对Jaffe 反应两点法测定肌酐的干扰。
线性范围在1393 μmol／L 内;CV 2.09%～6.21%。
50例黄疸样品(总胆红素Tbil 平均为153.3 μmol／L)和50例非黄疸样品(Tbil 平均＜20 μmol／L),用速率法(原法)、本法及Rate-B 法分别进行对照实验,结果表明黄疸组,本法与Rate-B 法结果一致,方法判断可接受,原法与Rate-B 法结果不一致,方法判断不可接受,而非黄疸组,无论本法还是原法都与Rate-B 法结果一致,方法判断均可接受。
关键词肌酐Jaffe 法；样品空白速率法；胆红素
用碱性苦味酸法测定血清肌酐时,由于胆红素逐渐转化为胆绿素,对505 nm 处的ΔA有负干扰甚至出现负值。
我们利用半自动生化分析仪,通过增设样品空白速率,从方法学角度克服了黄疸对肌酐测定的负干扰。
1 材料和方法
1.1 试剂自配苦味酸试剂R1:160 mmol／L NaOH,20 mmol／L硼砂;R2:50 mmol／L苦味酸。
胆红素试剂盒(重氮法):宁波亚利生物公司。
1.2 肌酐标准液8 840 μmol／L,上海生物制品研究所。
13
2.6 μmol／L 北京中生公司。
1.3 胆红素标准纯品(分析纯)［1］。
1.4 收集混合血清及肌酐低、中、高值黄疸和非黄疸血清各50例。
1.5 测定方法和参数肌酐测定分别用Rate-B 法(日立7150全自动分析仪)和速率法(S500P半自动生化分析仪),后者又分原法和本法。
其中原法(速率法)主要参数:温度30℃,样品50 μl,R1∶R2按5∶1混合为工作液1000 μl,波长505 nm,两点法测定,延滞时间12秒,两点读数时间12秒。
本法(样品空白速率法)参数完全同原法。
不同之处在于将样品与R1混合后作为样品空白按本法参数多测一次,原法与样品空白(负值)结果之差为本法结果。
Rate-B法参数见文献［1］。
2 反应读数时间的选择
选取浓度分别为6.6、37.8、169.6 μmol／L的低、中、高胆红素标准液,用本法测定,此时样品中肌酐浓度为0,从反应一开始,每12秒记录一次吸光度,观察144秒全反应过程中吸光度的变化,共13个测光点。
如附图所示。
结果表明,在胆红素标准液中加入R1或工作液后,在读数时间中单位时间内胆红素被氢氧化钠氧化下降的吸光度变化基本相同。
由于氢氧化钠对胆红素的作用与肌酐存在与否无关,故采用试剂R1代替工作液做样品空白速率。
3 方法学评价
3.1 准确度实验将8 840 μmol／L肌酐标准液按肌酐∶水=1∶5稀释成1
473 μmol／L标准液后,再用胆红素标准液进行倍比稀释,制成黄疸标准液,同时也选取上海生物制品研究所提供的定值质控血清,分别用原法、本法和Rate-B法测定,结果重复三次,取均值,见附表。
结果表明,原法受胆红素的干扰,本法接近实际值。
□曲线1∶R1与胆红素标准液6.6 μmol／L的反应曲线
■曲线2∶工作液与胆红素标准液6.6 μmol／L的反应曲线
△曲线3∶R1与胆红素标准液37.8 μmol／L的反应曲线
▲曲线4∶工作液与胆红素标准液37.8 μmol／L的反应曲线
○曲线5∶R1与胆红素标准液169.6 μmol／L的反应曲线
●曲线6∶工作液与胆红素标准液169.6 μmol／L的反应曲线
附图低、中、高值胆红素标准液与R1或工作液反应的吸光度变化
附表本法测定肌酐准确度实验(μmol／L)
总胆红素肌酐 Rate-B法原法样品空白本法
上生所 2.0 132.3 127 131.7 ＋2.7 129
自配 141.9 736.7 711 511.5 －197.1 708.6
自配62.7 368.3 350.3 267.9 －94.2 362.1
3.2 批内重复性选取肌酐正常和含量接近医学决定水平高值的混合血清各一份,用本法连续重复测定20次,均值分别为11
4.9、601.7 μmol／L,相应变异系数分别为6.21%、2.09%。
3.3 线性取1 473 μmol／L肌酐标准液倍比稀释,结果表明,在浓度1 393 μmol／L内呈线性。
3.4 对照实验对50例黄疸样品(Tbil 平均为153.3 μmol／L)和50例非黄疸样品(Tbil均小于20 μmol／L),利用原法、本法及Rate-B法进行对照实验。
并根据Barnett提出的肌酐在2.0 mg／dl(176.8 μmol／L)医学决定水平下的医学效用为0.4 mg／dl(35.4 μmol／L),对试验方法进行可接受性判断［2］。
结果黄疸组:原法(Y)与Rate-B法(X)比较,r=0.9799,比例误差0.81%,恒定误差－50.83,Y=1.0081X－50.83,P＜0.01,不可接受;本法(Y)与Rate-B法(X)比较,r=0.9974,比例误差1.96%,恒定误差－3.035,Y=1.0196X－3.035,P＞0.05,可接受。
非黄疸组结果:原法(Y)与Rate-B法(X)比较;r=0.9994,比例误差2.08%,恒定误差－8.611,Y=1.0208X－8.611,P＜0.01,可接受(其误差在允许范围内,因此在临床和方法学上可以接受)。
本法(Y)与Rate-B法(X)比
较,r=0.9991,比例误差0.83%,恒定误差－1.486,Y=1.0083X－1.486,P＞0.05,可接受。
本法可用于没有Rate-B法的全自动分析仪与半自动分析仪。
4 参考文献
1 石凌波,林龙顺等.用日立7150 Rate-B法程序消除胆红素对测定血清肌酐的干扰.临床检验杂志,1997,15(4)∶145
2 林龙顺等.实用医学检验计算.上海:上海科学技术文献出版社出
版,1990,139～186,213～247。