基因工程中的_单酶切_和_双酶切_问题_宋光丽
双酶切实验
双酶切概述 双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“se q”标注。 [编辑本段] 双酶切的注意事项 1、做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度。 2、对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。 3、对照的设立：为验证双酶切是否成功，可做如下对照： 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功.做转化时，也要进行对照。 [编辑本段] 双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：
实验二 阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定
实验二阳性重组质粒的抽提及双酶切鉴定 实验目的：练习质粒的抽提及双酶切的实验过程，熟悉相关操作。 实验材料及设备 pMD-T重组质粒；内切酶Xba I 及Pst I；10×M Buffe r；琼脂糖；电泳仪及电泳所需试剂。 实验步骤 A 大肠杆菌的扩繁及质粒DNA碱裂解法抽提 挑取筛选平板上的白色菌落， 接种到5ml LB液体培养基(含100μg/ml Amp)中， 37℃振荡培养约12小时至对数生长后期 ↓ 取培养液倒入2 ml eppendorf管中，4℃下12000 rpm离心2分钟，去上清 ↓ 沉淀中加入150 μl溶液I（50 mmol/L 葡萄糖,25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0),10mmol/L EDTA (pH8.0)）， 剧烈振荡使菌体悬浮，室温下放置5分钟 ↓ 加入250 μl新配制的溶液II (0.2 mol/L NaOH, 1％SDS, 临用前配制) 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次， 以混匀内容物(千万不要振荡)，室温下放置5分钟 ↓ 加入180 μl预冷的溶液III （5 mol/L KAc 60ml, 冰醋酸11.5ml, H2O 28.5ml, 定容至100ml , 并高压灭菌） 盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀 ↓ 冰浴10分钟，4℃下12000rpm离心10分钟 ↓ 上清液移入干净eppendorf管中，计算体积 ↓ 加入各1/2体积的Tris-饱和酚以及氯仿/异戊醇(24：1)，混匀 20℃下12000 rpm离心10分钟，取上清, 计算体积 ↓ 加等体积的氯仿/异戊醇（24：1），12000 rpm离心10分钟 ↓ 将上清移入干净eppendorf管中，计算体积 ↓ 加入2倍体积的无水乙醇 ↓ 混匀后置于-20℃冰箱中30分钟
双酶切连接反应常见问题分析
前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1. 回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 2. 纯化问题： 纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 3. 酶量的问题： 对1单位酶的定义如下：在50μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 4. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接： 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PC R产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000（注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg，也可以直接用这个公式套。1pmol 1000bp DNA=0.66μg，如载体是5380b p，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 5. 测DNA浓度： 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 6. 连接反应： TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λD NA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNa段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 7.转化： ①全量（10 μl）加入至100μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 ②42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 ③加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题： 1 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度。
质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定
一、实验目的 1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法； 2、掌握碱裂解法提取质粒的方法； 3、了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法； 4、学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作。 二、实验原理 1.PCR： PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。 ①延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链； ②变性：加热使模板DNA在高温下90℃-95变性，双链解链； ③退火：降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃左右），与模板DNA互补退火形成部分双链。 2. 质粒DNA的提取与定量——碱裂解法： A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； B、高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性；
C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。 D、定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 3.酶切鉴定：利用限制性内切酶。 4、琼脂糖凝胶电泳： A、琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度； B、DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动； C、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系)。 三、材料与方法： (一)、材料 1、样品： 菌液(大肠杆菌DH5a菌株)、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5α 2、试剂： LB培养基、AXYGEN试剂盒(溶液S1、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱液EB)、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M酶切缓冲液Buf R、HindⅢ(15U/ul)、EcoR I (12U/ul) 3、仪器与器材： PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶成像系统、
双酶切连接反应之全攻略
双酶切连接反应之全攻略 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/ 微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约 为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算: 很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 测DNA浓度: 可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER 进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段 被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连 接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。 3、转化： a、全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。 b、42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。 c、加入890 μl AMP阴性培养基，37℃振荡培养60分钟。 取100μl铺板。也可离心后余100μl 几个非常重要的问题 1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般 连接3小时,16度.
重组质粒DNA的提取及酶切鉴定
实验七重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 【实验原理】 分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。 本实验采用SDS碱裂解法提取重组质粒DNA，十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链DNA。限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。由于限制性内切酶的切割特性不同，分子生物学中主要用到Ⅱ型限制性内切酶（切割位置在识别序列内部）。 对质粒进行酶切，通过跑胶观察片段大小，从而鉴定质粒。 【实验步骤】 本次实验所用的质粒提取试剂盒为天根的质粒小提试剂盒，操作步骤按说明书进行。 1. 吸附柱中加500ul 平衡液(BL)，12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。 2.取1.5ml菌液至2ml离心管中，12,000rpm离心1min，弃上清。 3. 加250ul solution Ⅰ（P1），vortex。 4. 加250 solution Ⅱ（P2），上下颠倒混匀。操作时间不能超过5min 注：此步骤不宜超过5 min。 5. 加350 solution Ⅲ（P3），立即颠倒混匀几次。12000rpm离心10min。 6. 吸取上清加入吸附柱中，尽量不要吸出沉淀12000rpm离心1min ，弃收集管中的液体。注：此时4℃离心不利于沉淀沉降。 7. 加入600μL漂洗液（PW）于离心吸附柱中，12000rpm离心1min ，倒掉废液。 8. 重复上一步， 9. 空管离2min。将吸附柱放入1.5ml离心管中，在超净台中晾5min。10. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30 sec，弃滤液。 10. 滴加50ul elution buffer（EB）至膜中央，室温放置2min后，12000rpm离心1min。离心管中即为纯化后的质粒。 11.构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的15 ml PCR离心管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系（20 μl）
双酶切连接反应
【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创） 双酶切连接反应之全攻略 前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了很多次，不过很快改善了实验方法，用2周重组了14个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。 1、回收PCR产物：在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照： 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是TAKARA的纯化柱试剂盒 酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接 摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者，后者取。 pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=μg,如载体是5380bp，则为 ××=μg。 测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER每个条带约50ng。 连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
质粒DNA的提取、酶切与鉴定
实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定 一、质粒DNA的提取 [原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。 本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 [试剂] 1.溶液I： 50mmol/L葡萄糖、10mmol/L EDTA、25mmol/L Tris-HCl pH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。 2.溶液II： 200mmol/L NaOH 、1% SDS。 3.溶液III： pH4.8醋酸钾缓冲液（60 ml 5mol/L 醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml 蒸馏水） 4.TE缓冲液pH8.0 5.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/ml RNaseA。 6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。 7.1×LB溶液 8.100μg/ml氨苄青霉素 [器材] 1.TGL-16型台式高速离心机
2.1.5ml塑料离心管 3.离心管架 4.微量移液器 5.常用玻璃器皿 [操作步骤] 1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。 2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10 000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。 3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。 4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。 5.用台式高速离心机，10 000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。 6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10 000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。 7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 8.加0.5ml 70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。 9.加入50μl含RNase A 20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。 二、质粒DNA 的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定 [原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。 Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的
双酶切编辑
双酶切编辑 做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP 时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。 目录1简介 2连接反应 3注意事项 1简介编辑双酶切反应(Double Digests) 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer 的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切（图） 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的活性。 注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出现星号活性，详见《星号活性》。可通过增加反应体系的总体积的方法实现这一要求。 某些内切酶的组合不能采用同步双酶切法，只能采用分步法进行双酶切。上表中这些组合以“seq”标注。 2连接反应编辑1、回收PCR产物： 在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，如BamHI，HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，我一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。 纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基
双酶切(1)
③双酶切处理目的片段和带有GFP的质粒并纯化 一、实验原理 1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的一类专一识别双链DNA中特定 碱基序列的核酸水解酶，他们的功能类似动物的免疫系统，用于抗击外来DNA的侵袭。现已发现几百种限制性内切酶，他们以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH，由于限制性内切酶能识别DNA特异序列并进行切割，因而在基因重组、DNA序列分析、基因组甲基化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技术上受到广泛应用。在酶切反应中，DNA的纯度、缓冲液中的离子强度、Mg2+等因素均可影响反应，一般可通过增加酶的用量，延长反应时间等措施以达到完全酶切。 2.DNA的酶切反应 II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端，通过电用酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。 3.DNA的连接 在T4 DNA连接酶的作用下，平端或带有相同粘末端的DNA分子可以连接上。DNA连接酶的作分三步： ①T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。 ②酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切口的DNA分子上，使DNA腺苷 化 ③产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。 二、实验器材与处理方法（参照） 1、限制性内切酶酶BUFFER GFP质粒 2、T4 DNA连接酶连接酶缓冲液 3、电泳缓冲液（0.5×TBE或1×TAE）10×电泳加样缓冲液 4、溴酚蓝琼脂糖溴化乙锭（工作浓度0.5ug/ml）EcoR I 5、酚氯仿无水乙醇70%乙醇灭菌双蒸水 6、1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭 菌）电泳仪电泳槽紫外检测仪摄影设备 7、恒温水浴槽 三、实验步骤 先将步骤②扩增的目的片段进行纯化（柱层析或电泳割胶法） 1.酶切反应（按情况加大反应体系） 取GFP质粒（DNA）样品于合适的离心管中，按照表1加入试剂 ↓ 混匀；4000rpm离心30s,甩至管底 ↓ 37℃（限制性内切酶最适水温）,保温1~3h酶切（酶切过夜则建议用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多酶切体系各组分浓度改变过大，记得根据不同酶切位点加保护碱基）
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告
质粒 DNA 的提取、定量、酶切与PCR 鉴定 一、实验目的 1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法； 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法； 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法； 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法； 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。 二、实验原理 1.PCR(多聚酶链式反应 ) 在 DNA 聚合酶催化下，可以 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，以 dNTP 为原料，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外（缓冲液中）复制DNA ，使目的 DNA 按 2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反应步骤为： A. 变性：加热反应系统至95℃，使模板 DNA 在高温下完全变性，双链解链。 B. 退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温（ 35－70℃, 一般低于模板 Tm 值的 5℃ 左右），与模板DNA 互补退火形成部分双链。 C. 延伸：溶液反应温度升至中温72℃，在Taq 酶作用下，以dNTP 为原料，引物为复 制起点，模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒 DNA 的提取与制备 (1). 碱裂解法： 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异： A. 高碱性条件下，染色体DNA 和质粒 DNA 均变性；
B. 当以高盐缓冲液调节其pH 值至中性时，变性的质粒DNA 复性并保存在溶液中，染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。 (2). 离心层析柱： A. 硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA ，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质； B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； C.低盐，高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。 3.质粒 DNA 的定量分析（紫外分光光度法）： A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性； B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱 : DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C. A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应DNA 的纯度； A260/A280=1.8DNA 纯净 A260/A280<1.8表示样品中含蛋白质（芳香族）或酚类物质 A260/A280>1.8含 RNA 杂质，用 RNA 酶去除。 4.质粒 DNA 的酶切鉴定： 限制性内切酶是DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA 序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并 在结合位点切割双链DNA 。
重组质粒酶切鉴定及PCR实验
重组质粒的酶切鉴定及PCR实验 一．实验目的 1．检验重组质粒的插入片段的大小 2．学习PCR技术的使用 二．实验原理 （一）重组质粒酶切鉴定 将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。 （二）PCR PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析等方面。本次实验旨在通过学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术，以验证重组质粒插入片段大小。 1.聚合酶链式反应原理 PCR是一种利用两种与相反链杂交并附着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物，经酶促合成特异的DNA 片段的体外方法。反应过程由高温变性，低温退火和适温延伸等几步反应组成一个循环，然后反复进行，使目的的DNA 得以迅速扩增。置待扩增DNA 于高温下解链成为单链DNA 模板，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温条件下分别与目的片段两侧的两条链互补结合，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3'端开始掺入，沿模板5'—3'方向延伸，合成DNA 新链。由于每一循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，所以PCR 产物以指数方式增加，经25—30次周期之后，理论上可增加109倍，实际上可增加107倍。 PCR 技术具有操作简便、省时、灵敏度高特异性强和对原始材料质量要求低等优点，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏5'—3'核酶外切酶活性，不能纠正反应中发生的错误核苷酸掺入，估计每9000个核苷酸会导致一个掺入错误，但是错误掺入的碱基有终止链延伸的作用倾向，使得错误不会扩大。 2．PCR的反应动力学 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA
双酶切连接反应的注意要点
双酶切连接反应的注意要点 双酶切： 1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。 2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。 3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。 4、两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同，先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 5、若质粒是在TE中保存的，TE 中的EDTA可能与酶的激活因子螯合，影响酶切效果，可放大酶切体积或重新浓缩质粒。 6、限制酶的选择非常重要，尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。 7、纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。 8、酶量的问题：以TAKARA的为例，其对1单位酶的定义如下：在50 μl 反应液中，30℃温度下反应1小时，将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。而该酶浓度约为15单位/微升，在除外酶降解的因素外，该酶可分解15μg的DNA，而一般从1-4ml 菌液提出的DNA约为3μg，而PCR纯化后的产物（50体系）约为3μg，所以即便全部加进去，只要纯化的质量好，酶切完全切得动。 9、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接：摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol 为0.03×5.38×0.66=0.106524?g。测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的MARKER 每个条带约50ng。 10、连接反应：TAKARA的连接酶上的说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间3个小时足已。
双酶切反应
双酶切buffer的选择： 1、U ：Supplied with its own unique reaction buffer that is different from the four standard NEBuffers. Its compatibility with the four standard NEBuffers is indicated by the chart. 2、BSA ：Supplied with a separate vial of bovine serum albumin (10 mg/ml). To obtain 100% activity BSA should be added to the 1X reaction mix to a final concentration of 100 μg/ml. 3、SAM ：Supplied with a separate vial of S-adenosyl-methionine (SAM). To obtain 100% activity, SAM should be added to the 1X reaction mix as specified on the product data card. 4、dd ：When performing a double digest with this enzyme, this NEBuffer is recommended because it minimizes star activity. Purified by scientists at SibEnzyme and supplied with a SibEnzyme buffer (B, K, O, W or Y) which ensures 100% activity. Its compatibility with the NEBuffer System is indicated on the chart. 5、NR :This buffer is not recommended for use with with this enzyme。 6、Buffer Compositions ：(1X): NEBuffer 1 (yellow): 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7.0 at 25℃). NEBuffer 2 (blue): 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). NEBuffer 3 (red): 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). NEBuffer 4 (green): 20 mM Tris-acetate, 10 mM magnesium acetate, 50 mM potassium acetate, 1 mM DTT (pH 7.9 at 25℃). 双酶切连接反应的经验谈： 双酶切： 1、在双酶切载体时如果2个酶切位点靠得很近，必须注意酶切顺序。因为有的限制性内切酶要求其识别序列的两端至少保留有若干个碱基才能保证酶的有效切割。有的酶要求识别序列两端有多个碱基的，则必须先切，否则就可能造成酶切失败。 2、回收PCR产物：回收的PCR产物片段=1：10，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。pmol为单位的DNA转换为为?g单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为?g,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp，则0.03pmol为0.03×5.38×0.66=0.106524μg。 3、双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，对于PCR产物，可以过夜酶切，效果会很好。酶切体系不宜过大，会影响质粒和酶的碰撞机会，效果降低；质粒量不应该超过酶切要求的最大量，否则酶切不完全，酶的用量控制在1U酶在15-20ul体系中酶解1ugDNA。
双酶切
做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干；对照的设立：为验证双酶切是否成功。 1、同步双酶切 同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。NEB每一种酶都随酶提供相应的最佳NEBuffer，以保证100%的酶活性。NEBuffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性见《内切酶在不同缓冲液里的活性表》及每支酶的说明书。能在最大程度上保证两种酶活性的缓冲液即可用于双酶切。由于内切酶在非最佳缓冲液条件下的切割速率会减缓，因此使用时可根据每种酶在非最优缓冲液中的具体活性相应调整酶量和反应时间。 2、分步酶切 如果找不到一种可以同时适合两种酶的缓冲液，就只能采用分步酶切。分步酶切应从反应要求盐浓度低的酶开始，酶切完毕后再调整盐浓度直至满足第二种酶的要求，然后加入第二种酶完成双酶切反应。 3、使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切 如图 使用配有特殊缓冲液的酶进行双酶切也不复杂。在大多数情况下，采用标准缓冲液的酶也能在这些特殊缓冲液中进行酶切。这保证了对缓冲液有特殊要求的酶也能良好工作。由于内切酶在非最佳缓冲液中进行酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长反应时间。通过《内切酶在不同缓冲液里的活性表》可查看第二种酶在特殊缓冲液相应盐浓度下的作用活性。 双酶切建议缓冲液 注： 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反应体系中加入BSA。BSA 不会影响任何内切酶的活性。
基因克隆技巧之---双酶切系统的具体应用实例
双酶切系统(DDDesigner)的具体应用实例 DDDesigner group 1. 避免浪费限制性内切酶 双酶切系统能够避免限制性内切酶的浪费，因为很多限制性内切 酶在实际应用中所需的用量极少。如： 利用NEB公司的PstI-HF和EcoRV-HF两种酶消化长度为3000bp的1ug质粒DNA，当这两种酶在质粒上各只有一个切点时，完全消化质粒DNA所需要的PstI-HF仅为1.2U，需要的EcoRV-HF也仅为1.5U。 由此可见，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者 20IU）消化1ug质粒DNA，你将浪费了大约5-10倍的酶。这种浪费在一些特别贵的酶上面可能体现得更明显。
2.确保质粒载体的完全酶切，降低载体自连而出现的背景克隆 由于单位定义时底物选择的不同，以及酶在底物上识别位点的数 目的差别，导致在实际工作中，切割相同的质粒DNA时，不同的酶所需要的酶量（单位数）有很大的差别，有时能够相差近30倍。如： 利用NEB公司的PstI-HF和NheI-HF两种酶消化长度为3000bp的 1ug质粒DNA，当这两种酶在质粒上各只有一个切点时，完全消化质粒DNA所需要的PstI-HF仅为1.2U，需要的NheI-HF则高达32U，两种酶的用量相差近30倍。 因而，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者20IU）消化1ug质粒DNA，那么PstI-HF会出现浪费，但同时，NheI-HF的 用量则不能保证质粒DNA的完全酶切。此种情况下，在进行载体和外源片段的连接时，就会出现大量的载体自连，导致阳性克隆率低，或 者克隆失败。
3.确保PCR产物的完全酶切，提高克隆成功率 对同样质量(如1ug)的不同DNA样品，长度短（分子量小）的DNA样品中的分子数多，因而如果这些DNA样品分子上的酶切位点数是一样的，那么完全消化较短的DNA分子所需要的酶量将会比完全酶切较大的质粒DNA多。如： 用Takara的EcoRI和XbaI完全酶切1ug纯化的短PCR产物（300bp），且此两种酶在该分子上各有一个识别位点，那么需要大约64U的EcoRI和323U的XbaI。 因而，如果按照该酶所附的使用说明用1ul酶（10或者15IU）消化1ug DNA,那么就会导致大量的PCR产物酶切不完全，进而无法成功克隆至载体上，导致克隆失败。这个现象也提示：在进行较短的PCR产物酶切时，可以DNA的起始量，一般0.3—0.5ug就能满总克隆的需求，从而及可以节省酶的用量，也可以保证完全酶切。