免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点摘要：1.免疫组织化学染色的基本概念2.免疫组织化学染色的原理与应用3.免疫组织化学染色的操作步骤4.免疫组织化学染色中的关键试剂与技术5.免疫组织化学染色在医学诊断与研究中的应用6.免疫组织化学染色的优缺点及改进方向正文：免疫组织化学染色是一种检测组织切片或细胞样本中特定抗原或抗体的方法，它结合了组织学、免疫学和化学技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和药物研发等领域。
免疫组织化学染色的基本原理是基于抗原与抗体之间的特异性结合。
在染色过程中，首先将待检测的组织切片与特定抗体结合，然后加入抗原-抗体复合物，最后通过化学反应显色。
根据显色结果，可以判断组织中特定抗原或抗体的存在与否，从而为临床诊断、疾病研究提供重要依据。
免疫组织化学染色操作步骤主要包括以下几个方面：1.抗原修复：通过加热或酸碱处理，使组织中的抗原决定簇暴露，便于抗体结合。
2.切片：将组织样本切割成薄片，便于后续染色和观察。
3.脱蜡：将切片脱去脂肪和蜡质，使抗原抗体更容易结合。
4.抗原处理：对切片进行抗原修复，增强抗原性。
5.抗体染色：将切片与特定抗体结合，孵育一段时间，使抗体与抗原发生反应。
6.冲洗：去除未结合的抗体，防止背景染色。
7.显色：加入显色剂，使抗原-抗体复合物呈现特定颜色。
8.复染：为了更好地观察细胞结构和核染色，可以进行复染。
9.封片：用封片剂固定切片，便于长期保存和观察。
在免疫组织化学染色过程中，关键试剂与技术包括：1.抗体：针对特定抗原的抗体，如单克隆抗体和多克隆抗体。
2.抗原修复液：用于修复组织中的抗原决定簇。
3.显色剂：如DAB、HRP等，能使抗原-抗体复合物呈现特定颜色。
4.酶标二抗：用于检测抗原-抗体复合物的酶标二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）等。
5.酶标仪：用于检测酶标二抗的活性，从而判断抗原或抗体的表达水平。
免疫组织化学染色在医学诊断与研究中的应用主要包括：1.肿瘤诊断：通过检测肿瘤标志物，如CEA、AFP等，辅助临床诊断肿瘤。
免疫组织化学染色原理
免疫组织化学染色原理
免疫组织化学染色是一种常用的实验技术，用于检测组织中特定分子的存在和定位。
它基于免疫反应的原理，即针对特定抗原的特异性结合。
免疫组织化学染色的步骤包括固定、抗原解脱、抗原检测和染色四个主要步骤。
首先，需要将组织固定在载玻片上，通过化学处理来保留组织结构和抗原的位置。
然后，通过抗原解脱的步骤，去除组织中的其他成分，使得需要检测的抗原能够更好地暴露出来。
接下来，进行抗原检测。
这一步骤在免疫组织化学染色中非常关键，它使用特异性的抗体来与待检测的抗原结合。
抗体可以来源于动物、人类或是由基因工程技术合成。
最后，进行染色步骤。
常用的染色方法有酶标记技术和免疫荧光染色。
在酶标记技术中，抗原和抗体结合的位置会形成反应物质，如染色剂或显色物质，使得抗原的位置能够被视觉观察到。
而在免疫荧光染色中，抗体通常会被标记上荧光物质，其发出的荧光信号能够在显微镜下被观察到。
免疫组织化学染色的原理是利用抗体与抗原特异性结合来检测特定分子在组织中的存在和定位。
这种技术被广泛应用于医学研究、疾病诊断和药物研发等领域，为我们提供了对组织内分子进行定性和定量分析的重要工具。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学和HE（Hematoxylin and Eosin）染色是常用的组织学研究技术。
免疫组织化学用于检测组织中特定抗原的表达，可以帮助研究者了解细胞和组织的功能和性质。
HE染色则是常用的常规组织染色方法，用于观察组织的形态学特征。
下面将分别介绍免疫组织化学和HE染色的实验步骤。
1.获取组织标本：首先，需要获取要研究的组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
固定的组织标本一般使用10%缓冲福尔马林进行固定。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，使组织切片恢复水化。
4.抗原修复处理：将切片放入抗原修复液中，通过高温或酶解方法进行抗原修复处理，使细胞或组织中的抗原保持完整。
修复液的选择和具体实验要求有关。
5.阻断非特异性结合：将切片浸入阻断液中，阻断非特异性结合位点，减少假阳性结果。
6.一抗孵育：将合适浓度的一抗溶液加到切片上，使其孵育一段时间。
根据要检测抗原的性质选择合适的一抗。
7.二抗孵育和信号增强：将与一抗结合的二抗溶液加到切片上，同时可以加入信号增强剂，提高检测灵敏度。
8.反应显色：将切片加入显色液中，使阳性细胞或组织部分显示出颜色反应。
常用的显色方法有原位杂交、过氧化物酶法和碱性磷酸酶法等。
9.脱水和封片：经过显色后，将切片在酒精中进行脱水处理，然后用透明介质嵌片，并保护封片，以便于观察。
HE染色的实验步骤如下：1.获取组织标本：同样，首先需要获取组织标本，可以是活体组织或固定的组织。
2.制备标本切片：将标本切割成适合光镜观察的薄片。
切片厚度一般为3-5微米。
3.去蜡和水化：将蜡包埋组织切片放入蜡溶液中，加热脱蜡，然后用醇和水进行水化，使组织切片恢复水化。
4.酸性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用血红素作为酸性染料，将细胞核染成蓝色。
5.碱性染料处理：将标本切片放入染色液中，使用溴化钡和噻唑蓝作为碱性染料，将细胞质和胞浆染成红色。
免疫组织化学染色实验步骤
免疫组织化学染色实验步骤1. 实验准备确保所有实验所需的试剂、器材和设备都已准备齐全。
主要试剂包括抗体、抗原、染色液、封闭液等。
器材包括显微镜、离心机、微量移液器、培养箱等。
设备应进行适当的清洁和消毒，保持实验环境的无菌状态。
2. 组织样本的准备选择合适的组织样本并进行固定处理。
通常使用10%中性缓冲福尔马林固定液进行组织固定，固定时间一般为24小时，固定后应将组织转移至PBS缓冲液中保存。
固定后的组织样本需经过脱水、透明化和浸蜡等步骤，进行切片。
切片厚度通常为46微米，将切片放置于玻片上，进行后续的处理。
3. 切片的脱蜡和再水化4. 抗原修复抗原修复是提高抗体特异性的重要步骤。
选择适当的抗原修复液（如柠檬酸缓冲液或EDTA缓冲液），将其加热至沸腾并保持一定时间（通常为1020分钟），以去除固定过程中可能产生的抗原遮蔽效应。
之后将切片转移至冷却缓冲液中，待其冷却至室温。
5. 封闭非特异性结合位点用封闭液（如含有5%牛血清白蛋白的PBS溶液）处理切片，以封闭组织中可能存在的非特异性结合位点。
封闭液通常需要在室温下孵育30分钟。
6. 加入一抗（初级抗体）将一抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
抗体稀释液的选择应根据抗体的说明书进行，常见的稀释液包括PBS或含有0.1% TritonX100的PBS。
覆盖切片后，置于湿箱中在4°C下孵育过夜，以保证抗体与抗原充分结合。
7. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的一抗。
洗涤液的选择应为无菌PBS，洗涤次数通常为3次，每次5分钟。
8. 加入二抗（次级抗体）将二抗稀释至适当浓度，滴加在切片上。
二抗应选择针对一抗的相应标记抗体，常用的标记物包括荧光素、酶（如HRP、AP）等。
孵育时间为30分钟，孵育条件为室温，避免光照。
9. 洗涤切片用PBS洗涤切片，去除未结合的二抗。
洗涤操作与步骤7相同。
10. 显色反应根据使用的标记物不同，选择相应的显色试剂进行显色反应。
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免疫组组织化学染色操作过程
1.接蒸馏水1L2.PBST配置：PBS ：Tween20=1000：1 （PBS 2000mL-其中用1000mL配PBST）3.30%的过氧化氢配成3%的过氧化氢(200ml）4.配DAB 第二天配(1滴:1000ul)5.一抗稀释（当天用当天配）第一天1．烤片：石蜡切片，烘烤箱内60度，3到5小时（目的使组织与玻片牢固结合）2．脱蜡：二甲苯(10min×3)3．复水：无水乙醇5min×3，然后95%，75%，50%乙醇各5min。
(目的是利用乙醇的双溶性，使得切片跟后续的水溶性实验体系相容）4．自来水冲洗5min，蒸馏水浸泡5min5．抗原修复：热修复（目的是将抗原表位暴露，使得后续的一抗可以结合上去）。
①配置修复液：修复液主要有柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0），EDTA（pH=8.0）和TE（pH=9.0）三种，其酸碱度不同，不同抗体的要求不同，要根据抗体和试剂的说明书来配；②高压锅：半锅抗原修复液，蒸汽鸣笛开始算时间，进行3min，5mim，10min，15min进行摸索时间（如果是电热锅从沸腾开始算时间，修复时间要久一些）。
煮完自然冷却。
6.洗涤：①蒸馏水5min，②PBST：3min × 2 ③ PBS：3min× 17.免疫组化笔画圈：切片置于湿润操作盒上。
（若要破膜的话，移液枪滴0.3%Triton溶液于标本上45min）8.淬灭（阻断）:（目的去除内源性过氧化物酶），30%过氧化氢加蒸馏水配成3%溶液，切片浸泡15min。
9.洗涤：①PBST：3min × 2 ② PBS：3min× 110.生物素阻断，依次滴A，B剂切片浸泡，各10min，依次洗涤：①PBST：5min × 2 ，②PBS：5min× 111．封闭（目的为了减少二抗与组织的非特异蛋白结合，需用二抗来源的血清进行封闭）。
羊血清，移液枪。
免疫组织化学及HE染色实验步骤
免疫组织化学及HE染色实验步骤免疫组织化学（immunohistochemistry，简称IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质的方法，其原理是通过特异性抗体识别目标蛋白质并将其可视化。
本文将介绍IHC实验的基本步骤和HE染色实验的步骤。
IHC实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.抗原修复：将组织切片放入含有钠胼胝土缓冲液或其它抗原修复液中进行抗原修复。
可以选择使用高温或酶解等方法。
3.阻断非特异性结合：将组织切片浸泡在阻断液中，如BSA、牛血清蛋白等，以防止抗体与非特异性的蛋白质结合。
4.一抗孵育：将含有一抗的抗体溶液滴在组织切片上，孵育一段时间，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
5.二抗孵育：选择与一抗宿主不同的二抗标记物，如荧光素、过氧化物酶等，将含有二抗的溶液滴在组织切片上进行孵育。
6.吸附剂清洗：将组织切片用洗涤缓冲液洗去未与标记物结合的二抗。
7.标记物检测：根据所选择的标记物，可以进行荧光显微镜观察、酶反应等，将目标蛋白质可视化。
8.盖片封装：将组织切片用适当的缓冲液封装至玻璃盖片上。
HE染色实验步骤：1.组织切片制备：从取材到固定、包埋和切片，保证组织样本的质量和完整性。
2.脱蜡：将组织切片放入甲醇中脱去石蜡包埋。
3. 染剂处理：将组织切片依次浸泡在嗜铬酸钾溶液中，漂洗后浸泡在碱性染剂中，如伊红（Eosin）染料。
4. 酸性染剂处理：将组织切片浸泡在酸性染剂中，如苏木红（Hematoxylin）染料。
5.脱染：将组织切片用酒精和醋酸溶液进行脱染。
6.脱水：将组织切片依次浸泡在酒精梯度中，脱去水分。
7.透明化：将组织切片逐渐浸泡在透明剂中，如苯酚乙醇、二甲苯等，使组织切片透明。
8.盖片封装：将组织切片用适当的透明剂封装至玻璃盖片上。
以上是免疫组织化学和HE染色实验的基本步骤。
通过这些步骤，可以标记和可视化组织切片中的特定蛋白质，进而获得研究和诊断所需的信息。
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色步骤
免疫组织学化学染色是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它可以用于检测细胞和组织中的特定蛋白质或其他分子。
这种技术主要基于抗体与抗原之间的特异性结合，通过标记抗体或抗原来实现染色。
下面是免疫组织学化学染色的步骤：
1. 取样：首先需要从组织或细胞中取得样品。
这可以通过活体组织切片、细胞培养等方法来实现。
2. 固定：将样品进行固定处理，以保持其形态和结构不变。
常用的固定剂包括甲醛、乙醛、乙酸等。
3. 脱水：将样品逐渐浸泡在不同浓度的乙醇中，以去除水分，使其逐渐变得透明。
4. 渗透：将样品逐渐浸泡在不同浓度的蜡中，使其逐渐渗透并浸润其中。
5. 切片：将样品切成非常薄的切片，通常为3-5微米。
6. 抗原修复：对切片进行抗原修复处理，以恢复抗原的免疫原性。
常用的抗原修复方法包括加热、酶解、酸解等。
7. 阻断：将切片浸泡在蛋白质阻断剂中，以防止非特异性结合发生。
8. 一抗：将特异性的一抗加入到切片中，使其与目标抗原结合。
9. 二抗：加入与一抗结合的标记二抗，以形成一抗-二抗复合物。
10. 染色：加入染色剂，使标记二抗发生染色反应，从而可视化目标抗原的分布和定位。
11. 脱色：将多余的染色剂去除，使切片变得清晰可见。
12. 封片：将切片用透明胶封装，以保护其结构和形态。
以上就是免疫组织学化学染色的步骤，这种技术可以用于研究细胞和组织中的蛋白质、细胞因子、核酸等分子，为生物医学领域的研究和诊断提供了重要的工具。
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法)
免疫组织化学染色诊断(液盖膜涡流混匀法) 免疫组织化学染色诊断是一种常用于病理学研究和临床诊断的技术，可以通过对组织切片中的特定抗原进行染色，来确定细胞或组织中的特定蛋白质分子的存在、分布和表达水平。
液盖膜涡流混匀法是一种常用的免疫组织化学染色方法，其基本步骤如下：
1. 组织标本的制备：取得需要检测的组织标本，经过处理后制备成切片。
2. 抗原解析：将切片进行抗原解析处理，使得目标蛋白质在切片上暴露出来。
3. 抗体处理：将特异性抗体添加到切片上，并进行孵育，使得抗体和目标蛋白质结合形成免疫复合物。
4. 二级抗体处理：添加与特异性抗体结合的二级抗体，并进行孵育，使得二级抗体与特异性抗体结合。
5. 染色处理：使用染色剂进行染色处理，使得免疫复合物能够被可视化。
6. 直接涡流混匀：将液盖膜盖在切片上，使用混匀仪进行混匀。
该方法主要优点是操作简便、染色效果较好、敏感性和特异性高等，适用于多种组织和细胞的检测。
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免疫组织化学技术：染色步骤
免疫组织化学技术:染色步骤
一、免疫荧光法
１．直接法
（1）冰冻切片、涂片、印片或单层细胞培养物按要求进行固定，石蜡切片常规脱蜡后用酶消化处理，然后水化，用0.01mol/L PH7.2---7.4PBS洗5分钟，冷风吹干，放入湿盒中。
（2）滴加经稀释的荧光抗体，37℃ 30-60分钟或4℃过夜
（3）PBS 洗2次，蒸馏水洗1次
（4）50%甘油缓冲液封片
（5）荧光显微镜下检查
（6）对照染色
①阳性对照，用已经证实的含有靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阳性。
②阴性对照，用确知不存在靶抗原的组织切片与待检标本同样处理，结果应为阴性。
③空白对照，用免去特异性抗体或用PBS替代特异性抗体，结果应为阴性。
④抑制试验，将标记抗体(例荧光抗体)和未标记的抗体或血清等量混合后，按上述步骤处理切片，结果应为阴性（一步法）。
或将待检切片两张，一张加未标记特异性血清，另一张加未标记同种正常血清，孵育后冲洗，再加入标记的特异性血清（例如特异性荧光标记抗体），加了未标记特异性血清的切片因抗原抗休已结合，故染色被抑制，呈阴性结果，而加同种正常血清的切片则呈阳性反应（二步法）。
对照染色非常重要，开始试验时应做全面对照，每次试验时应做阳性和阴性对照。
2．间接法
（1）标本处理同直接法。
（2）滴加适当稀释的特异性抗体于标本上，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟或４℃过夜。
（3）滴加适当稀释的间接荧光抗体，置湿盒中，３７℃３０～６０分钟。
（５）ＰＢＳ洗２次，双蒸水洗１次。
（６）甘油缓冲液封片，荧光显微镜下观察。
（７）对照染色：可用空白对照和阴性对照等。
３．补体法
（１）标本处理同直接法。
（２）滴加适当稀释的特异性抗体及补体的等量混合液，置湿盒中，３７℃３０分钟，ＰＢＳ洗３次。
（３）滴加适当稀释的抗补体荧光抗体，置理盒中，３７℃３０分钟。
ＰＢＳ洗２次，蒸馏水洗１次。
（４）甘油缓冲液封片。
（５）对照染色，可作正常血清替代，灭活补体对照即经５６℃３０分钟灭活处理后，将灭活的补体与特异性抗体等量混合，进行染色，结果均应阴性。
４．双重色疫荧光法
在同一标本上有两种抗原需要直接显示时，可用不同的荧光素分别标记抗体进行染色。
一步法双染色：先将两种标记抗体按适当比例混合，按直接法步骤进行。
二步法双染色：先用一个标记抗体孵育，不必洗，再用另一个标记抗体孵育，按间接法步骤进行。
５．注意事项
（１）免疫荧光法最适宜进行冰冻切片的染色，因为此种切片一般抗原保存得较好。
若是石蜡切片则应首先选用免疫酶法等染色技术。
（2）使用商品的荧光标记抗体，在进行染色前应作抗体效价的测定，找出合适的稀释度后再进行成批染色。
一般而言，在阳性物质发出明亮荧光而背景又较暗时的稀释度是较为合适的。
高稀释度的荧光抗体可以减少非特异性着色使染色结果更具特异性，但稀释度过高会。