植物快速繁殖技术实验指导

《植物快速繁殖技术》

实验指导

李国平编

生态与资源工程系

2014年1月8日

目录

前言错误!未定义书签。

学生实验守则错误!未定义书签。

实验一观赏植物种子无菌萌发与试管开花技术错误!未定义书签。实验二金线莲的快速繁殖技术错误!未定义书签。

实验三铁皮石斛的快速繁殖技术错误!未定义书签。

实验四一种植物的组织培养与快速繁殖错误!未定义书签。

前言

植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。近40年以来，植物组培技术已渗透到植物生理学、病理学、遗传学、药学、育种以及生物化学等各个研究领域，为快速繁育优良品种，培育无毒苗木，进行突变筛选培育，药用植物工厂化生产，种质保存和基因库建立等方面开辟了新途径，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一。现如今，植物组织培养技术具有保持花卉优良性状、培育脱毒苗木、保存种质资源等优势，根据这些优势，植物栽培技术也被广泛应用于花卉的种苗繁殖与生产之中。

学生实验守则

一、自觉遵守纪律和各项规章制度，保持室内安静，注意环境卫生，不吸烟、不随地吐痰、不乱扔纸屑杂物，爱护公务。

二、实验过程中应严肃认真，严格遵守操作规程。贵重、精密仪器的使用须在专人指导下进行。

三、爱护实验仪器设备，厉行节约。仪器若有损坏，应如实报告，填写登记表。凡损坏、丢失的仪器设备，均应查清原因，按仪器设备损坏、丢失赔偿制度处理。

四、实验物品不得随意翻动，严禁携出室外。若需借用应办理借物手续。

五、注意实验室安全，易燃易爆品的操作应远离火源。

六、实验结束，由实验指导教师和管理人员检查清点仪器设备，学生应办好交接手续，做好清洁卫生，及时关好水电阀门，保持实验室和仪器的清洁整齐。

实验一观赏植物种子无菌萌发与试管开花技术

一、实验目的

掌握利用种子作为外植体进行快速繁殖的方法；掌握试管花卉的培养技术；了解植物开花的影响因素。

二、实验原理

试管开花是指用组织培养的方法，使植物开花的过程在培养容器中完成。一般情况下，植物必须达到某种成熟阶段时才能开花。自1946年罗士韦在对菟丝子茎尖培养时发现了花器官的形成后，植物组织培养技术已用于植物离体开花的研究。影响试管开花的因素主要有外植体，外源植物激素，营养水平和环境因素等4个方面。通过改变培养基中外源植物激素、营养水平和培养环境条件，可以诱导培养物在试管内开花。

试管花卉作为高新技术与工艺生产相结合的新生物, 不仅在理论研究上有重要作用, 而且可以利用成花决定因素的研究来培养能迅速进入生殖阶段的试管苗或有观赏价值的试管花卉, 并将这一技术直接应用于花卉生产。试管花卉有较大市场前景,

目前可以做成试管花卉的植物有石斛兰、龙角、波露、短叶芦荟、美丽十二卷、鸡冠花、玫瑰、红莲、凤梨、大花蕙兰、狼牙掌、燕尾芦荟、非洲紫罗兰、下城芦荟、金线莲、迎春、六月雪、红叶李、无刺火棘、紫薇、情人草、康乃馨、幸运草、草莓、非洲菊、文心兰等。

三、实验器具与药品

①器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅、超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿。

②试剂：MS培养基各种母液、PP333、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞。

③以矮生鸡冠花品系的种子为试材。

四、实验内容与操作步骤

1、培养基的配制

①种子萌发培养基：ＭＳ基本培养基

②增殖培养基：MS+NAA ·L-1+6-BA ·L-1+ 蔗糖20 g·L-1+ 琼脂10 g·L-1

③试管开花诱导培养基：MS+ PP333 ·L-1+NAA ·L-1+ 蔗糖20 g·L-1+ 琼脂10g·L-1

2、种子灭菌

先用洗洁精洗净种子，用自来水流水沖洗干净；再用% HgCl

浸泡10 min，

2

最后用无菌水反复冲洗5 遍。在超净工作台上将灭菌后的种子接种到MS 培养基上，每三角瓶接种5-10个外植体。培养室条件为：光照12h·d-1、光照强度1500Lx、温度25～26℃。14d 后统计种子发芽率和污染率。

3、增殖培养

当无菌苗长到约2cm 时，取其中约1cm 芽段，接种到②增殖培养基上，培养26 d 后统计其增殖倍数。

4、开花诱导

将高约２～３ｃｍ的试管苗，转到③试管开花诱导培养基中，培养条件：日温（２５±２）℃，夜温（２０±２）℃，光照强度１５００～3０００ｌｘ，光照时间１２ｈ／ｄ，接种30d后观察统计试管内开花情况。

五、实验结果

观察试验结果，报告种子发芽率和污染率、增殖倍数和试管开花情况。

六、思考题：

什么是试管花卉有何开发价值影响试管开花的主要因素有哪些

实验二金线莲的快速繁殖技术

一、实验目的

掌握利用组织培养方法进行金线莲快速繁殖的技术；了解影响金线莲快速繁殖的各种因素。

二、实验原理

金线莲为兰科开唇兰属花叶开唇兰((Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.)，又名金线兰、金丝草。主要种植于我国福建、台湾、广东等亚热带及热带地区，素有“金草”、“神药”等美称。金线莲喜欢生长在潮湿、阴凉的环境中，温度需要控制在20 ～ 28 ℃之间，喜散射光，最忌阳光直射，对环境的要求比较严格。近年来，由于其药用价值不断被发掘，金线莲人工环境中的量产也逐步实现。特别是在福建、广东等华南地区，应用金线莲组织培养技术生产商品金线莲的模式不断兴起。

野生金线莲自然繁殖是用种子繁殖的，其人工繁育技术难度较大。应用组培繁殖可大大缩短金线莲成苗时间，显著提高培养效率，降低育苗成本，是金线莲种苗生产的重要方法。

三、实验器具与药品

①器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅、超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿。

②试剂：MS培养基各种母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞、香蕉汁、活性炭等。

③金线莲野生种苗或试管苗。

四、实验内容与操作步骤

1、培养基的配制

①茎段诱导培养基：MS + BA + NAA 0. 5 + 香蕉汁100 g/L

②继代增殖培养基：12MS + BA + NAA + 香蕉汁100 g/L + AC %;

③生根培养基:12MS + IBA + NAA + AC %

2、茎段诱导

将带芽的金线莲茎段剪成2 ～ 3cm 长的茎段用自来水冲洗，置饱和漂白粉上清液中浸泡15 min，并用软毛刷轻轻刷洗，冲洗干净; 在自来水下滴冲1 ～ 2 h，双蒸水冲洗2 ～ 3 次，置超净工作台用75% 酒精消毒30 s，0. 1% 氯化汞溶液消毒10 ～ 13 min，无菌水冲洗3 ～ 5 次; 取出要接种的材料放在灭过菌的培养皿上，用手术刀切掉与氯化汞接触的切口，然后将材料平放在诱导培养基面上进行诱导。每瓶接种带侧芽的茎段数5个，每隔一周观察污染情况和记录侧芽发芽状况，30 d 后记录发芽个数，并算出侧芽的出芽率。

3、丛生芽的增殖培养

将诱导产生的高1. 0 ～1. 5 cm 的丛生芽从瓶中取出，切去叶片和基部褐化部分，转接到增殖培养基中，每瓶接种3-5个不定芽，每隔一周观察其污染情况及记录增殖培养过程中丛生芽的增殖状况，50 d 后记录增加的不定芽的个数，计算增殖倍数。

4、生根培养

当丛生芽长至1. 5 ～ 3. 0 cm 高，2 ～3 片叶时，将其分成单个植株，接入生根培养基中诱导生根。每瓶培养基接种5 株，每隔一周观察其污染情况及记录丛生芽的生根状况，30 d 后记录生根株数及每株的生根数，并计算生根培养基下幼苗的生根率及平均生根数。

五、实验结果

观察试验结果，报告侧芽诱导率和污染率、丛生芽增殖倍数、试管苗生根率及平均生根数；总结金线莲的工厂化育苗技术。

六、思考题：

阐述金线莲的生物学特性、价值和育苗技术。

实验三铁皮石斛的快速繁殖技术

一、实验目的

掌握利用组织培养方法进行铁皮石斛快速繁殖的技术；了解影响铁皮石斛快速繁殖的各种因素。

二、实验原理

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是一种生长缓慢、自然繁殖率很低的兰科附生植物, 具有很高的药用价值,为传统名贵中药, 有“救命仙草”、“药中黄金”之美称。自然资源将近枯竭,已列入濒危保护植物。铁皮石斛种质资源的保护和开发离不开植物组织培养技术,组培工厂化生产是铁皮石斛种植规模化的基础。铁皮石斛目前关于其组织培养及快速繁殖的研究颇多,用于外植体的有种子、无菌苗幼苗茎段、原球茎及人工种子等;再生植株的获得途径主要有种子→原球茎→小植株,种子→原球茎→无菌苗茎段→小植株,种子→愈伤组织→原球茎→小植株等。由于铁皮石斛组培周期长,如何有效解决快繁中存在的组培苗生产成本高、移栽苗成活率低、标准化生产程度低等问题是维持铁皮石斛产业健康发展的基石，是开发利用铁皮石斛资源的一个重要方面。

三、实验器具与药品

①器材：电子天平、托盘天平、烧杯（50ml, 100ml, 500ml, 1000ml）、量筒（1000ml,100ml, 25ml）、容量瓶（1000ml,500ml,100ml）、药勺、称量纸、玻璃棒、滴管、电炉、冰箱、移液枪、pH计、高压灭菌锅、超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿。

②试剂：MS培养基各种母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞、香蕉汁、活性炭等。

③铁皮石斛野生种苗或试管苗。

四、实验内容与操作步骤

1、培养基的配制

①茎段启动诱导培养基为: ( 1) MS+ 6 BA L，单位下同) + NAA + 2g/ L 活性碳； (2) MS+ 6 BA1. 0+ NAA 0. 1+ 2g/ L 活性碳。

②石斛继代增殖培养基为: ( 3) 3g/ L 花宝3 号+ 6-BA + NAA + 2g/ L 活性碳；( 4) 3 g/ L 花宝3号+ 6-BA 2. 5+ NAA + 2g/ L 活性碳。

③生根培养基为: ( 5) 1/ 2MS+ IBA 0. 5+ 2g/ L 活性碳。

以上培养基均加%蔗糖, %琼脂, ~5. 4, 培养温度( 25 ±2℃),光照度1500~ 2000 lx, 光照时间12h/ d。

2、无菌材料的处理

从植株上切下长2~ 5cm 的幼嫩茎段, 在流水下冲洗, 用刷子蘸少许洗衣粉水轻轻刷洗, 并经自来水充分洗净。在超净工作台上将茎段放置在75% 的酒精中消毒30s 后, 再用0. 1%的升汞水溶液浸泡8~10min,无菌水冲洗5~ 6次。

3、原球茎的诱导

用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下, 接种在诱导培养基(1) 中培养，每瓶接种带侧芽的茎段数5个，每隔一周观察污染情况和记录原球茎诱导状况。15~ 20d 后, 外植体开始萌动,茎段膨大, 切面及顶部组织形成疏松组织。继续培养20d 后, 转入培养基(2) 中, 切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物, 随着培养时间的延长, 颗粒物长大形成直径约1~2mm 的原球茎颗粒物，30 d 后记录原球茎个数，并算出原球茎诱导率。

4、原球茎的增殖

将培养基( 2)中形成的原球茎转入到培养基(3) 、(4) 中, 30 d 后记录原球茎个数，并算出原球茎增殖率。

原球茎在培养基(3) 、(4) 中都有增殖, 培养基(4) 增殖速度很快, 增殖倍数可达3~ 4 倍, 同时, 部分原球茎开始分化出芽点并长出1~ 2 片小叶, 原球茎的增殖与芽分化同时进行, 表明高浓度的激素组合可促进原球茎的增殖与分化。待芽数量较多时, 将高1~ 2cm、带有2~3 片叶的小芽切下转入生根培养基(5)上进行生根培养。

5、生根与移栽

小苗在生根培养基(5) 进行不定根的诱导。培养30d 左右, 基部开始出现2~ 3 条约1cm 长的白色根,随后逐渐伸长, 45d统计生根率当苗高3cm 以上、具3~ 4 片叶时, 便可出瓶移栽。移栽前, 将生根瓶苗打开瓶盖, 移至常温下炼苗7d, 然后, 将瓶苗取出,洗去附着在根部的培养基, 用0. 01%的高锰酸钾溶液浸泡8~ 10 min, 栽种于已灭菌的碎树皮基质中( 移栽前浇透水) , 放置在遮光度50% ~ 60%、湿度达80% 以上的温室中, 2 个月后统计成活率

五、实验结果

观察试验结果，报告原球茎诱导率和污染率、原球茎增殖倍数、试管苗生根率及平均生根数；总结铁皮石斛的工厂化育苗技术。

六、思考题：

阐述铁皮石斛的生物学特性、价值和育苗技术。

实验四一种植物的组织培养与快速繁殖

本实验要求选择一种植物作为培养的对象，设计一个实验方案，以获得再生植株为目标开展离体培养研究，并报告实验结果。实验方案需要说明以下内容：（1）选择的是什么植物选择该种植物的理由是什么（2）植株再生的途径是什么（3）各阶段培养基配方是什么（4）外植体如何消毒（5）接种过程是怎样的（6）培养条件是怎样的（7）预期结果是怎样的

一、实验目的

依据已掌握的植物组织培养技术，对一种有开发价值的植物进行离体培养，获得其试管苗，形成该种植物的组织培养与快速繁殖技术。

二、实验要求（设计要求）

1、要求学生首先查资料，熟悉该植物的生物学特性和开发利用价值；

2、查阅资料，了解该类植物（相近物种）的组织培养研究概况；

3、根据研究资料，选择外植体种类、拟定植株再生途径、拟定各培养阶段培养基配方、培养条件等实验方案；并及时与老师沟通、调整培养方案，直至培养成功。

4、认真观察、记录实验过程，用照片记录组织培养全过程，以论文形式报告实验结果。

三、实验报告要求

1、本实验以小组为单位进行，但每人写一份实验报告。

2、严格按照实验步骤、所记录的实验数据，叙述实验过程和结果，分析试

验结果。

3、指出试验过程中存在的问难，并提出相应的改进方法方案。