基因过表达和沉默稳转细胞株的应用
稳转细胞系
稳转细胞系稳定的转染细胞系: 提升科学研究的利器引言：在现代生命科学研究中，细胞系的使用是非常常见且重要的。
细胞系是从正常组织或肿瘤中获得的细胞，通过无限次传代的方法培养而来。
细胞系的使用可以为科学家提供一个可控的实验环境，以研究细胞行为、生物过程以及疾病进展等方面。
然而，细胞系的构建是一个繁琐的过程，涉及到细胞的分离、培养、转染等多个步骤。
在细胞系构建中，稳转细胞系的生成尤为重要。
稳定的转染细胞系是指在细胞中引入外源基因，并能够稳定地表达该基因。
相对于临时转染，稳定转染细胞系具有长期稳定的基因表达，可以为研究者提供持久且可重复的实验结果。
因此，稳定转染细胞系成为许多生物学研究的重要工具。
稳定转染的方法：稳定转染主要采用两种方法：病毒介导的转染和非病毒介导的转染。
病毒介导的转染包括使用逆转录病毒和腺病毒等病毒载体，将目标基因导入到细胞中。
由于病毒具有高效的感染性和稳定的基因传递性，因此病毒介导的转染方法常被用于构建稳定转染细胞系。
另外，非病毒介导的转染方法也被广泛使用。
这些方法包括钙磷共沉淀法、脂质体转染法和电穿孔法等。
这些方法通过物理或化学手段，将目标基因导入到细胞中。
与病毒介导的转染相比，非病毒介导的转染方法更加简便、安全，并且有一定稳定性。
然而，由于非病毒转染效率较低，通常需要进行筛选和扩增，以获得稳定的转染细胞系。
构建稳定转染细胞系的挑战：构建稳定转染细胞系并非一帆风顺。
在构建过程中会面临一些挑战和困难。
其中一个主要挑战是选择合适的转染方法。
由于不同的细胞系对转染方法的敏感性和效率不同，选择合适的转染方法至关重要。
此外，不同的细胞系之间还存在一定的差异，比如生长速度、对抗生素的敏感性等，这些因素也需要考虑在内。
另一个挑战是筛选稳定的转染细胞系。
在转染过程中，只有少数细胞能够成功地获得目标基因的稳定表达。
因此，筛选和识别这些稳定转染细胞系是一个困难、耗时的过程。
通常，研究者会使用抗生素抗性标记或荧光蛋白等标记基因，来筛选目标细胞。
基因沉默的原理及其应用
基因沉默的原理及其应用1. 基因沉默概述基因沉默是指通过特定的机制，使得基因表达降低或完全抑制的现象。
它是维持细胞内基因表达稳定性的重要机制之一。
基因沉默的方式主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、RNA干扰等。
基因沉默在生物学研究、基因治疗以及农业生产等方面具有广泛的应用前景。
2. 基因沉默的原理2.1 DNA甲基化DNA甲基化是一种通过在DNA分子上添加甲基基团来改变基因表达的方式。
在DNA甲基化过程中，甲基转移酶将甲基基团转移到DNA分子上，从而使得DNA的结构发生改变，导致基因的表达发生变化。
DNA甲基化通常会导致基因的沉默，而去甲基化则可以解除基因的沉默。
2.2 组蛋白修饰组蛋白修饰是一种通过改变染色质的结构和构象来调控基因表达的方式。
组蛋白是染色质的主要组成部分之一，它可以通过添加或去除特定的化学修饰基团来改变染色质的结构。
这些修饰可以影响DNA与组蛋白之间的相互作用，从而影响基因的转录和表达水平。
2.3 RNA干扰RNA干扰是一种通过引入外源性的RNA分子来抑制特定基因表达的方式。
在RNA干扰过程中，外源性的RNA分子与目标基因的mRNA序列互补配对，形成RNA复合体，并通过RNA酶的作用将目标基因的mRNA降解或抑制其翻译过程。
这种方式可以有效地沉默目标基因，从而改变基因表达的水平。
3. 基因沉默的应用3.1 基因功能研究基因沉默技术为研究基因的功能提供了重要的工具。
通过使用RNA干扰技术，可以特异性地沉默目标基因，然后观察沉默后的细胞或生物体的表型变化，从而揭示该基因在生物体中的功能和作用机制。
3.2 基因治疗基因沉默技术在基因治疗方面具有潜在的应用价值。
通过选择性地沉默致病基因，可以抑制其表达，从而达到治疗疾病的目的。
例如，通过沉默癌细胞的关键基因，可以达到抑制肿瘤生长的效果。
3.3 农业生产基因沉默技术在农业生产中也有广泛的应用前景。
通过沉默特定基因，可以改变农作物的性状，使其具有更好的抗病性、耐逆性以及产量的提高。
基因沉默的原理及应用
基因沉默的原理及应用一、基因沉默的原理基因沉默是指通过RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）技术，特异性地抑制特定基因的表达。
基因沉默在生物学研究中具有重要的应用价值，其原理主要包括以下几个方面：1. siRNA的合成与靶向短干扰RNA（short interfering RNA，简称siRNA）是基因沉默的关键分子。
在细胞内，siRNA会与RNA诱导靶向耗竭（RNA-induced silencing complex，简称RISC）结合，形成RNA-蛋白复合体，然后通过匹配特定序列，将复合体定位到目标mRNA上，最终导致mRNA降解、剪接或抑制翻译。
2. miRNA的生成和功能微小RNA（microRNA，简称miRNA）是一类长度约为21-23个核苷酸的非编码RNA分子。
miRNA产生于细胞内，通过与RNA诱导靶向耗竭结合，实现对mRNA的调控。
miRNA主要通过与mRNA的3’非翻译区域互补配对，诱导mRNA的降解或抑制翻译，从而实现目标基因的沉默。
3. RISC的功能和调控RISC是RNA干扰过程中的一个重要复合体，其主要成员包括siRNA或miRNA，以及相关的蛋白质。
RISC在基因沉默中起到关键的作用，通过与靶向RNA结合，实现对mRNA的调控。
RISC中的蛋白质能够辅助siRNA或miRNA与靶向RNA的杂交，并促进靶向RNA的降解或抑制翻译。
二、基因沉默的应用基因沉默技术已经在许多领域展现出广阔的应用前景，一些典型的应用包括：1. 研究基因功能基因沉默可以通过抑制特定基因的表达，来研究该基因在生物体中的功能。
通过沉默特定基因后，研究人员可以观察到沉默基因对生物体的影响，从而揭示出特定基因在生物体发育、代谢、免疫等方面的作用，为相关研究提供有力的证据。
2. 治疗基因相关疾病基因沉默技术在治疗基因相关疾病方面具有巨大的潜力。
通过针对病因基因进行沉默，可以有效地抑制病因表达，从而达到治疗目的。
Piwil2调控宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制探讨
921《中国癌症杂志》2017年第27卷第12期 CHINA ONCOLOGY 2017 Vol.27 No.12基金项目：国家自然科学基金面上项目(81372779；81372777)。
通信作者：凌 斌 E-mail ：lingbin.ling@Piwil2调控宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制探讨冯定庆，闫克芹，张 筱，邓 琳，凌 斌中日友好医院妇产科，北京 100029［摘要］背景与目的：Piwil2在肿瘤干细胞及癌前干细胞中高表达，通过转录和转录后调控机制调控多种基因表达，与肿瘤发生、发展密切相关。
该研究探讨Piwil2与宫颈癌细胞恶性生物学行为之间的关系及可能的调控机制。
方法：构建慢病毒载体pLenti-CMV-Piwil2-SV40-EGFP 和shPiwil2质粒，分别转染HeLa 和SiHa 细胞，建立过表达/沉默Piwil 2表达稳转细胞株，反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction ，RT-PCR)及蛋白［质］印迹法(Western blot)鉴定转染效果；采用CCK-8法检测细胞增殖能力；PI 染色后，流式细胞术(fluorescence-activated cell sorting ，FACS)检测细胞周期；Western blot 检测细胞增殖及周期相关调控蛋白表达；采用维拉帕米(verapamil)处理细胞，Hoechst 33342染色，FACS 检测侧群(side polulation ，SP)细胞比例；CCK-8法检测顺铂对细胞的杀伤活性。
结果：过表达Piwil2上调HeLa 和SiHa 细胞S 期及G 2/M 期细胞比例，进而促进细胞增殖，与对照组比较差异均有统计学意义(P 均<0.05)；沉默Piwil2表达则细胞发生G 0/G 1期阻滞，抑制细胞增殖(P <0.05)；Piwil2上调cyclin D1表达，提高Stat3磷酸化水平，下调p53表达；Piwil2显著上调HeLa 和SiHa 细胞中SP 细胞比例(P <0.01)，提高宫颈癌细胞对顺铂的耐药性(P <0.01)；沉默Piwil2则相反，显著提高对顺铂的敏感性。
沉默基因的原理及应用
沉默基因的原理及应用1. 沉默基因的定义沉默基因（Silencing Gene）是指可以通过RNA干涉（RNA interference, RNAi）技术降低或消除目标基因表达的基因。
RNA干涉是一种细胞内天然的基因调控机制，通过降解特定的mRNA分子来抑制目标基因的表达。
沉默基因技术的出现为基因功能研究和遗传改良提供了有力的工具。
2. 沉默基因的原理沉默基因的原理主要基于RNA干涉技术。
在细胞中，RNA干涉主要分为两个步骤：siRNA的合成和RISC（RNA-Induced Silencing Complex）的形成与作用。
2.1 siRNA的合成siRNA（small interfering RNA）是由双链RNA酶（Dicer）作用下产生的双链小分子RNA。
siRNA可以由来源于细胞内的长串RNA、预先合成的siRNA或经过外源RNA病毒转染所合成。
在细胞中，长串RNA被Dicer酶切割成约21-25个碱基对的双链siRNA，在此过程中Dicer酶与合成的siRNA共同组成RISC。
2.2 RISC的形成与作用RISC是由特殊的蛋白质组成的复合物，其中包含一个Dicer蛋白和一个Argonaute蛋白。
RISC能够识别并结合与siRNA序列互补的靶基因mRNA，在结合的过程中RISC将mRNA分子切割并降解，从而阻断目标基因的正常表达。
3. 沉默基因的应用沉默基因技术在多个领域都有重要的应用价值，主要包括基因功能研究、生物医学研究、农业遗传改良等。
3.1 基因功能研究沉默基因技术可以通过特异性地降低或消除目标基因的表达来研究基因在生物体内的功能。
通过沉默某个特定基因，研究人员能够观察到该基因缺失或受抑制后生物体的表型变化，并进一步了解该基因在生物体发育、代谢、免疫等方面的作用机制。
3.2 生物医学研究沉默基因技术在生物医学研究中的应用十分广泛。
研究人员可以通过沉默特定的致病基因来研究该基因与疾病之间的关系，并探索新的治疗方法。
构建稳定的敲除和过表达的方法
构建稳定的敲除和过表达的方法
在生物学研究中，稳定的敲除和过表达是常用的实验方法，用于研究基因的功能和影响。
通过敲除或过表达特定基因，研究人员可以揭示该基因在生物体内的作用和相互关系。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，需要采用稳定的敲除和过表达方法。
下面将介绍一些构建稳定的敲除和过表达的方法。
1. 选择合适的载体，在进行敲除和过表达实验时，选择合适的载体是非常重要的。
常用的载体包括质粒、病毒载体和转基因动植物。
选择合适的载体可以确保基因的稳定表达和传递。
2. 优化转染条件，对于细胞实验，优化转染条件可以提高敲除和过表达的效率。
包括转染试剂的选择、转染时间和细胞密度等因素。
3. 使用适当的筛选方法，在进行敲除实验时，需要使用适当的筛选方法来筛选出敲除目标基因的细胞系。
常用的筛选方法包括抗生素筛选和基因编辑技术。
4. 确定稳定的过表达细胞系，在进行过表达实验时，需要确保
过表达基因的稳定性和可靠性。
可以通过PCR、Western blot等方法来鉴定过表达细胞系。
5. 确保实验重复性，为了确保实验结果的可靠性，需要进行多次重复实验，并对实验结果进行统计分析。
总之，构建稳定的敲除和过表达的方法是生物学研究中非常重要的一步。
通过选择合适的载体、优化转染条件、使用适当的筛选方法和确保实验重复性，可以确保敲除和过表达实验的准确性和可靠性，为研究人员揭示基因功能和相互关系提供可靠的实验手段。
基因过表达的原理步骤应用
基因过表达的原理、步骤与应用原理基因过表达是一种常见的分子生物学技术，其原理是在细胞中引入大量目标基因的转录产物，从而达到增加特定基因或蛋白质表达水平的目的。
基因过表达技术广泛应用于众多研究领域，包括基因功能研究、蛋白质表达和纯化、疾病模型构建等。
步骤以下是基因过表达的常见步骤：1.选择目标基因：首先，在进行基因过表达之前，需要选择合适的目标基因。
通常情况下，选择的基因应与研究的问题相关，并且具有较高的表达水平。
2.构建表达载体：将目标基因插入到适当的表达载体中。
表达载体通常包括启动子、转录终止信号以及可能的附加元素，如标签、启动子增强子等。
3.转染或转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常见的方法包括细胞转染和细菌转化。
这些方法中的选择取决于宿主细胞类型以及实验需求。
4.筛选并鉴定正突变体：在宿主细胞中，筛选出含有目标基因的正突变体。
这一步骤可通过对细胞进行抗生素选择或其他筛选方法来实现。
5.验证基因过表达：使用适当的技术（如PCR、Western blot或免疫组化）验证目标基因的过表达。
这一步骤可以确保构建的表达载体在宿主细胞中成功表达目标基因。
应用基因过表达技术在科学研究和工业领域有着广泛的应用，包括但不限于以下方面：1.基因功能研究：通过过表达特定基因，研究人员可以深入了解该基因在生物体内所起的作用。
通过观察基因过表达后的表型变化，可以推断该基因可能参与的生物过程和途径。
2.蛋白质表达与纯化：基因过表达技术常用于产生大量表达目标蛋白质的工具。
过表达的蛋白质可以用于下游研究，如蛋白质结构解析、酶活性检测等。
3.疾病模型构建：通过过表达与疾病相关的基因，研究人员可以构建疾病的细胞或动物模型。
这些模型可以用于深入研究疾病的发生机制、病理生理过程以及新药的筛选。
4.基因治疗：基因过表达技术在基因治疗中也有广泛应用。
通过过表达具有治疗效果的基因，可以治疗某些遗传性疾病和恶性肿瘤。
结论基因过表达技术是一种常用的分子生物学工具，可以用于研究基因功能、产生大量表达蛋白质、构建疾病模型以及基因治疗等方面。
USP47通过促进抗凋亡蛋白表达介导头颈鳞癌细胞顺铂耐药
Vol.41No.4Apr.2021上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)USP47通过促进抗凋亡蛋白表达介导头颈鳞癌细胞顺铂耐药童桐，秦星，谢非，蒋英英，石剑波，张建军上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面头颈-肿瘤科，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海200011［摘要］目的·探讨去泛素化酶47（ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 47，USP47）对头颈鳞癌细胞顺铂耐药的影响及潜在机制。
方法·通过梯度增加顺铂浓度，构建头颈鳞癌顺铂耐药细胞株；通过实时定量PCR 和蛋白免疫印迹实验检测耐药株中USP47的表达情况；利用慢病毒载体构建USP47基因过表达或敲除的稳转细胞株，MTT 法检测USP47表达升高或降低对头颈鳞癌细胞顺铂耐药性的影响；并检测USP47对癌细胞增殖、克隆形成和凋亡等生物学行为的影响；通过免疫印迹实验检测USP47对抗凋亡蛋白X-连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein ，XIAP ）和重组人B 细胞淋巴瘤因子2xL （recombinant human B-cell leukemia/lymphoma 2xL ，Bcl-xL ）的表达及泛素化水平的影响。
结果·USP47在头颈鳞癌顺铂耐药细胞株中显著高表达；过表达USP47后，顺铂对头颈鳞癌细胞的半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration ，IC 50）明显升高，而敲除USP47可以降低头颈鳞癌顺铂耐药细胞株的IC 50；过表达USP47的头颈鳞癌细胞，其增殖和克隆形成能力均被抑制，而抗凋亡能力明显增强。
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基因过表达和沉默是研究基因功能的常见手段，基因过表达/沉默指的是在目标细胞中过量
选等手段来来获得目的基因稳定过表达的细胞株。
1、技术原理：
将外源DNA克隆到具有抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选，得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。
通过选择不同的启动子，可以调控目的蛋白的表达时间、空间和强度。
2、技术优势：
①源井生物过表达载体经过优化，整合效率高，可以实现长达10kb的目的片段整合。
②实验前进行严格的预实验（包括验证细胞单克隆形成率，最佳电转效率条件
摸索，细胞最小全致死浓度，靶位点附近序列验证等），提高项目一次通过率，大大缩短实验周期。
③除了DNA水平的验证，源井生物还可以进行QPCR验证阳性克隆目的基因
表达情况。
3、质量控制：
过表达载体经过测序验证，阳性克隆经过QPCR验证表达效果后交付。
4、应用：
上调目的蛋白表达量，研究基因功能；模拟人类疾病；进行药物筛选等。