第二章 微生物的纯培养和显微技术
微生物学教案第二章微生物的纯培养和显微技术
微生物学教案第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。
实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。
第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1.微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。
培养微生物的营养物质（称为培养基（culture medium））可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
第二章 微生物的纯培养
干燥保藏法 将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料 上保藏。 如砂土管保藏法，适用于放线菌、芽孢菌和某些真 菌保藏，保藏时间几至几十年。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法 主要特点 传代培养，4℃保藏 石蜡油隔绝空气，室温或 4℃保藏 沙土管作载体，干燥器中抽 真空，室温或4℃保藏 适用范围 各种微生物的短期保藏。 各种微生物的中短期保藏， 不适用某些能分解烃类的菌 种。 产孢子微生物和芽孢细菌的 长期保藏，不适用对干燥敏 感的微生物 保藏期 1-6个月 1-2年
微生物学
第二章 微生物的纯培养和显微技术
基本概念
1、微生物的纯种分离：
将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离 或纯化的过程。
2、微生物的培养物（culture)：
在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物 群体。 纯培养物（pure culture)：在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的只有一种微生物的培养物。
方
法
1、传代培养保藏方法
①斜面低温保藏法
方法：菌种管置4℃冰箱保藏，定时传代 原理：低温下，微生物代谢强度明显下降 。 低温可减缓生长速度，单细胞仍有一定的活动条
件，一般4～6个月必须传代一次。
优点：方便，不受条件限制，各类微生物均可。 缺点：时间短、传代多、易退化。
②石蜡油低温保藏法：
原理：在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡， 达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态， 同时石蜡油还防止水分蒸发，
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术（aseptic technique）
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他
微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为
微生物学教案 第二章 微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术大多数动物植物的研究、利用都能以个体为单位进行，而微生物由于个体微小，在绝大多数情况下都是利用群体来研究其属性，微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存。
在微生物学中，在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物（culture），而只有一种微生物的培养物称为纯培养物（pure culture）。
由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果，因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。
相应的，微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。
显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。
实际上，正是由于显微技术及微生物纯培养技术的建立才使我们得以认识丰富多彩的微生物世界，并真正使对微生物的研究发展成为一门科学。
第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。
因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。
在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术（aseptic technique），它是保证微生物学研究正常进行的关键。
1.微生物培养的常用器具及其灭菌试管、玻璃烧瓶、平皿（culture dish，Petri dish）等是最为常用的培养微生物的器具，在使用前必须先行灭菌，使容器中不含任何生物。
培养微生物的营养物质（称为培养基（culture medium））可以加到器皿中后一起灭菌，也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。
最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。
第二章 纯培养和显微技术
3、单细胞（孢子）分离法
解剖显微镜下用吸管挑选单细胞（孢子） 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行； 操作难度与细胞或个体的大小成反比；
4、选择培养分离法
原理：
创造适于目的微生物生长条件； 使待分离的目的微生物成为优势菌； 抑制大多数其它非目的微生物；
• 方法：
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 2. 富集培养
三、显微观察样品的制备
• （1）光学显微镜制样 • 有活体直接观察和染色观察 • 悬滴法
• 活体观察
• •
压滴法
菌丝包埋法
（2）细菌染色法:
种类
细菌染色
活菌染色
死菌染色
正染色
负染色
普通染色
特殊染色
简单染色法ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
复杂染色法
芽孢染色法
荚膜染色法
细胞壁染色法
抗酸染色
革兰氏染色
• 步骤： • 固定（加热固定、化学剂固定） • 染色
第二章思考题： 1、利用选择培养基如何筛选： （1）抗链霉素（str）细菌？ （2）降解利用尿素的细菌？ （3）分解利用纤维素的细菌？ 2、利用富集培养和选择培养如何分离： （1） 如何从土壤中分离筛选高温（70℃）解烃细菌？ （2） 如何从污染废水中分离筛选苯胺降解细菌？
• 1、利用选择培养基直接分离目的微生物 • 抑制性选择培养基（selective medium）:
•
根据某种微生物的特殊营养要求或对某化学、 物理因素的抗性而设计，只允许特定微生物生长， 而同时抑制或阻止其它微生物生长的培养基。
•
例一：从土壤中分离筛选蛋白酶产生细菌
含牛奶选择培养基目的菌的平板
常用的灭菌方法：
沈萍微生物学第二章
放线菌形态
放线菌生活史
放线菌孢子丝
2、古细菌
3. 原核生物的细胞大：纳米（nm10－9m） 细胞大小的形象比较
大肠杆菌：0.5×2um 芝麻：3mm
常见细菌的大小
球菌：直径 0.5×2um 杆菌：宽×长 0.5～1×1～5um 螺形菌：宽×长 0.5～1×1～50um
六，微生物的保藏技术 1.保藏的目的 2.保藏的原理 3.保藏的方法 传代培养 4℃ 冷冻保藏 -196℃， - 70℃ ， -20~-30℃ 干燥保藏 沙土管，安瓿管 其他方法
第三节
显微镜下的微生物
一， 细菌
细菌的定义： 以二分裂为主要繁殖方式的单细胞原核 微 生物。 1.细菌的形态和排列 三种基本形态：
杆菌
杆菌的基本形态
短杆状、长杆状、棒杆状、梭状杆状、月亮状、竹节状 等；按杆菌细胞繁殖后的排列方式则有链状、栅状、 “八”字状等
杆菌细胞的排列方式
链杆、栅状、八字状、鞘衣包裹的丝状等
短杆菌
长杆菌
梭状芽孢杆菌
Scanning electron micrographs illustrating external features of the rodshaped bacterium E. coli.
球状
一个分裂面 二个分裂面 三个分裂面 无定向分裂面
单杆，链杆，栅状 ，八字 弧菌，螺旋菌
杆状， 螺旋状
单球菌
细胞分裂沿一个平面进行， 新个体分散而单独存在. 如尿素微球菌
显微镜下示意图
双球菌
细胞沿一个平面分裂， 新个体成对排列. 如肺炎双球菌
四联球菌
细胞分裂是沿两个相垂直的平 面进行，分裂后每四个细胞特 征性地连在一起，呈田字形. 如四联微球菌
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[精品]微生物的纯培养和显微镜技术第2章微生物的纯培养和显微镜技术重点、难点剖析1(无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。
2(分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。
获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2—1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。
此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。
表2-1 获得微生物纯培养的方法比较方法特点应用菌落分离较为均匀，进行微生这3种方法可用于所有在固物计数结果相对准确。
但操作体培养基表面形成菌落的稀释倒平板法相对麻烦，热敏感菌有时易被微生物的纯培养分离。
并烫死，而严格好氧菌也可能被且，通过选用适当的选择平固体培养基分离固定在培养基中生长受到影响板及培养条件可直接分离各种具有特定生理特征的操作相对简单，是较常使用的微生物。
和厌氧罐或厌氧手常规方法。
但有时会因涂布不套箱技术结合，这3种方法涂布平板法均匀使某些部位的菌落不能分也可用于获得各种厌氧开，进行微生物计数时需对稀菌的纯培养释和涂布过程的操作特别注意，否则不易得到准确结果平板划线法操作简单，多用于对已有纯培养的确认和再次分离稀释倒平板的一种变通形式，在缺乏专业的厌氧操作设稀释摇管法但由于菌落形成在琼脂柱的中备的情况下对严格厌氧菌间，观察和挑取都相对困难进行分离和观察工作量大，是否获得纯培养需不能或不易在固体培养基稀释法依靠统计学的推测上生长的微生物进行纯培养分离或数量统计一般不能直接获得微生物的纯1)根据某种微生物的特殊液体培养基分离培养，在通过富集培养使原本生长要求，按照意愿从自然在自然环境中占少数的微生物界中对这种微生物进行有富集培养的数量大大提高后，需再通过针对性的有效分离;2)分离平板法进行相应富集培养微生培养出由科学家设计的特物纯培养的分离和检测定环境中能生长的微生物，尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长分离过程直观，可靠，但对仪从样品中直接分离所需的器和操作技术要求较高，多限微生物细胞或孢子，获得其单细胞(孢子)于高度专业化的研究，而挑取纯培养显微操作挑取的微生物单细胞或孢子需经固体或液体培养基培养后才能获得其纯培养物3(保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
微生物的纯培养和显微技术
只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物， 这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。
选择培养基分离法
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105
106
107
高氏培养基 土豆培养基 牛肉膏培养基
7.微生物保藏技术
微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内 不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生 物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护 微生物资源的一项重要基础工作。
(1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人 工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的 休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。
（2）保藏方法 ①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷 藏。
②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。
③真空冷冻干燥法保藏
④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养 物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。
日本大阪发酵研究所(IFO)
斜面低温保藏法－－常用保藏法
• 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。
培养平板（culture plate，也称平板或平皿）：溶化的培 养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。
（1）涂布平板法（Spread plate method） 适于大多数好氧微生物。
（2）稀释倒平皿法（Pour plate method）
第二章微生物的纯培养和显微摄影技术
色差是透镜成像的一个严重缺陷，发
生在多色光为光源的情况下，单色光
不产生色差。白光由红 橙 黄 绿 青 蓝
紫 七种组成，各种光的波长不同 ，所
以在通过透镜时的折射率也不同，这 样物方一个点，在象方则可能形成一
个色斑
显微镜的重要光学技术参数
显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、
分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、 它们之间是相互联系又相互制约的，在使用
光学显微镜在使用最短波长的可见光
（＝450nm)作为光源，在油镜下可以达 到的最大分辨率是0.18μm,
光学显微镜的放大倍数只能达到
1000－1500倍
三． 放大率 放大率就是放大倍数，是指被检验物体 经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看 到的最终图象的大小对原物体大小的比 值，是物镜和目镜放大倍数的乘积。 放大率也是显微镜的重要参数，但也不 能盲目相信放大率越高越好，在选择时 应首先考虑物镜的数值孔径。
如果培养物中只有两种微生物，而且
是有意识的保持二者之间的特定关系
的培养物称为二元培养物。 是保存病毒的最有效的途径
大约在16世纪末，荷兰的眼镜商詹
森（Zaccharias Janssen）和他的儿 子把几块镜片放进了一个圆筒中，
结果发现通过圆筒看到附近的物体
出奇的大，这就是现在的显微镜和
望远镜的前身。
第二章
微生物的纯培养和显微技术
微生物的分离和纯培养
显微镜和显微技术
本讲结束
本讲结束
培养物 ———— 在微生物学中，在人为条件下培养、 繁殖得到的微生物群体称为培养物 （culture)。
纯培养物———— 只有一种微生物的培养物称为纯培养 物，又称纯培养（pure culture)
南开大学微生物-第二章纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术微生物学特有的实验技术微生物如何纯培养？研究其群体如何分离微生物纯种？小！镜下微生物形态多样显微镜观察各种显微技术第一节微生物的纯种分离和纯培养菌种是宝贵的天然资源，生境中多种微生物混杂群居，以纯种进行研究、应用和繁衍。
因此，纯种分离、培养是最基础的工作。
一、纯种分离、培养“特有的实验技术”微生物的纯种分离将多种混杂的微生物，经某种技术或方法分离或纯化的过程。
纯培养（pure culture)：在适宜条件下培养纯化获得的培养物（群体）。
纯种分离、培养所用器具及操作要“严格无菌”（一）无菌技术（aseptic technique)在分离纯种、转接纯种、培养纯种过程中，为保持纯种的“纯洁”性而防止其它微生物污染的技术。
1、所用物品的灭菌技术A、玻璃或金属器皿灭菌干热灭菌：干燥箱（160－170 °C 干热空气2小时灭菌）B、培养基或溶液灭菌湿热灭菌：高压蒸汽灭菌器（121 °C 热蒸汽30分钟灭菌）干燥箱高压自动灭菌锅压力表C、血清或生长因子溶液灭菌过滤除菌：细菌滤器滤膜(孔径小于细菌细胞的大小)C、无菌室UV杀菌、超净工作台火焰区操作。
“树立无菌意识，规范无菌操作、保证纯种培养”B、超净工作台无菌操作----移液2、无菌操作A、火焰旁无菌操作----接种（二）固体培养基分离纯种菌落（colony) ---琼脂营养平板菌落单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成的肉眼可见、有一定形态结构的子细胞生长群体。
一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落，在液体培养基中不会形成菌落。
微生物样品多种混杂某种方法培养分散成单个微生物平板单菌落每个菌落为纯种（纯培）纯种（纯培养）单菌落转接培养1、微生物纯种分离的原理和方法2．纯种平板分离的不同方法99ml无菌水试管10倍稀释图从土壤中分离细菌纯种方法10倍稀释1：100 1克土壤（1）涂布平板法（spread plate method）（2）稀释倒平板法（pour plate method）涂布平板法稀释倒平板法稀释菌落在表面菌落在表面下含培养基（3）平板划线法（streak plate method ）蛇形线法操作图平行线法操作图“在平板表面长出的菌落是需氧菌”（4）厌氧细菌的纯种分离厌氧培养箱图平板放在厌氧罐内培养（三）液体培养基分离纯培养个别较大细菌原生动物、藻类固体平板不能长菌落如何分离纯培养？接种物液体培养基顺序稀释法分离。
微生物学[第二章微生物的纯培养和显微镜技术]山东大学期末考试知识点复习
第二章微生物的纯培养和显微镜技术一、要点提示1．由于微生物个体微小，在绝大多数情况下对微生物的研究、利用都是使用其群体，称为培养物。
由于一般情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果，因此从混杂的天然微生物群中分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的最重要的环节之一。
采用稀释涂布或平板划线技术在琼脂平板上得到微生物的单菌落是最常用的纯种分离手段，而在分离、转接及培养微生物纯培养时防止被其他微生物污染的无菌操作技术是进行微生物学研究的基础，并广泛地被其他学科和生产实际所利用。
2．通过分离纯化得到的微生物纯培养物，必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡、不会因发生变异而丢失重要的生物学性状、不会被其他微生物污染或因自身泄漏而污染环境，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。
传代培养、冷冻真空干燥保藏、低温冰箱保藏及液氮保藏是通常使用的微生物菌种保藏技术。
3．微生物个体微小，通常必须通过显微镜才能观察到其个体形态，而进行显微观察时，分辨率和反差是决定显微观察效果的两个最重要的因素。
它们与显微镜的特性有关，也取决于样品的制备与观察技术。
无论是光学显微镜还是电子显微镜，其设备和技术发展迅速，应用面越来越广泛和深入。
4．在显微镜下微生物的大小与形态千差万别，丰富多彩，是区分不同微生物和对其进行分类、鉴定的重要依据之一。
二、重点、难点剖析1．无菌技术是最基本的微生物学实验操作技术，其核心是无菌概念的建立，以及正确而严格地按实验教材和实验课的要求，掌握在各种情况下的具体应用原则和操作规范。
2．分离获得某特定的微生物纯培养，是研究和利用微生物的基础。
获得纯培养的方法有固体培养基分离、液体培养基分离和单细胞挑取3大类(表2-1)，其中用固体培养基获得单独的微生物菌落是最常用、最基本的方法。
此外还有活细胞或活体分离法，如噬菌体和动植物病毒纯培养的分离等。
3．保证所用菌种性状的稳定是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
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第二章微生物的纯培养和显微技术
第一节微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被
称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌
（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破
坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作
无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养
1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼
可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法
3、稀释倒平板法
4、平板划线法
5、稀释摇管法
对氧气更加敏感的厌氧型微生物。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后
冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合
物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养
对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配
不到一个微生物。经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到
的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单
细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养
根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大
多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方
法进行纯培养分离。
1、选择平板培养
2、富集培养