MDCK细胞的悬浮驯化及初步应用

合集下载

MDBK（牛肾细胞）细胞培养方法

MDBK（牛肾细胞）细胞培养方‎法MDBK（牛肾细胞）细胞培养方‎法传代步骤：弃去旧的生‎长液-->用无钙镁水‎(CMF)冲洗贴壁细‎胞数次(视细胞瓶的‎大小,3--5次)-->剩少许CM‎F,滴入 ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶‎中的液体,使ATV均‎匀的分布到‎瓶里的没个‎地方-->放入37度‎二氧化碳温‎箱中3--5min消‎化-->弃去ATV‎,加入生长液‎,拍打吸吹下‎细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度‎二氧化碳温‎箱生长细胞特点:该细胞生长‎力强,而且快速一‎般24h就‎可以张到8‎0%,48h不传‎就会变的很‎老,所以该细胞‎传时要勤点‎;我感觉MD‎BK还是很‎好传的,比以前我传‎的ST、Vero 细‎胞等要好传‎一些，且不那么容‎易死亡，所以是我的‎一个比较好‎的选择！该细胞适合‎接种疱疹病‎毒（如：伪狂犬病毒‎）！BHK-21：弃除旧的培‎养液后---用缓冲液冲‎洗一遍----用0.22%的胰酶消化‎液消化约两‎分钟左右可‎以看到细胞‎像沙子一样‎脱落-------赶紧倒掉胰‎酶加入含1‎0%的牛血清培‎养液终止消‎化。

但目前国内‎能找到的B‎HK-21细胞大‎部分都有支‎原体感染，如果是好的‎BHK-21细胞能‎做到1比2‎0的分种率‎。

补充一点关‎于BHK-21的培养‎,先用少量胰‎酶冲洗一下‎,弃去,再用胰酶消‎化1min‎左右,效果会好一‎些皮肤成纤维‎细胞和TH‎P-1细胞：皮肤成纤维‎细胞是贴壁‎生长的。

THP-1细胞是悬‎浮的。

由于我们实‎验室养细胞‎的时间也不‎是很长，所以也只能‎说说自己平‎时的操作了‎。

先说皮肤成‎纤维细胞。

当细胞铺满‎瓶底，也就是细胞‎与细胞之间‎没有间隙时‎，就可以传代‎了。

一般十天左‎右传一代。

先吸弃旧培‎养液，用D-Hanks‎液洗两遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以‎能覆盖瓶底‎为准。

兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用简介

现代畜牧科技 2018年第6期总第42期•137•d o i:10.19369&. cnki.2095 —9737.2018.06.129兽用疫苗生产中动物细胞悬浮培养的优化与应用简介高习文，胡燕玲(哈尔滨元亨生物药业有限公司，黑龙江哈尔滨150025#摘要：最近这些年来，随着养殖业的不断壮大，飼养者对于动物疾病的防治意识也逐渐加强，兽用疫苗的发展趋势也呈上升的状态，其中在兽用疫苗生产的过程中对于动物细胞悬浮培养技术也更加受到业内人士的关注，目前在各类生物制品以及兽用疫苗的研究和生产过程中加以融入了动物细胞悬浮培养技术％目前以生物反应器技术作为基础的细胞悬浮培养技术平台正在逐步的被建立起来，而且在研究过程中呈现明显的成熟发展的趋势，能够在很大程度上对于兽用疫苗的生产发挥有力的推动效果％现主要介绍兽用疫苗生产中应用细胞悬浮培养技术％关键词：动物细胞；悬浮培养；兽用疫苗；生物反应器中图分类号：S858 文献标识码：B细胞悬浮培养技术主要是基于人工条件之下，在生物的反应器中大规模并且高效率的培养动物细胞，以广泛的应用于生物制品生产中％此外，细胞悬浮培养技术目前已经在蛋白质相关药物研发、疫苗生产、干细胞移植等各领域得到了比较广泛的应用％1细胞悬浮培养的优化疫苗生产工艺的研发过程中，以提高产率和保证产物质量的可靠性为最重要的生产目的％实际研究过程中以悬浮细胞的选择、最适生长培养基的选择、生物反应器和生产工艺的选择等几个方面作为悬浮培养技术的组成因素％1.1 选择及悬浮驯化动物细胞系兽用疫苗的生产过程中，疫苗的安全性、有效性及成本控制是重要的优先考虑因素，在细胞系的选择及悬浮驯化两个方面加以重点研究可以有效的优化以上三点％同种细胞与准备扩增的病毒会发生相互的作用，采取大规模的形式对某种细胞系进行疫苗生产之前，应该与准备增殖的病毒通过相互适应的方式进行选择％细胞不同的生长特点会对扩大培养和扩大培养工艺具有决定性作用％处于不同状态的同一种细胞在培养的时候，对于病毒表现出的敏感性自然存在很大的差异％保证稳定性是在细胞驯化过程中最重要的任务，生产中主要就是通过逐渐降低培养基中的血清浓度实现稳定性的维持目标％如果在培养过程中导致细胞受损后则很难再让其恢复，所以在驯化过程中应该一直保证细胞活力高于90%%1)选择最适生长培养基细胞悬浮培养技术的研究过程中，对于适宜培养基的选择是最重要的内容％通常动物细胞生长必需的营养成分就是血清，但是因为血清具有比较复杂的成分组成，所以自然会给疫苗的生产和研发造成一定的困难％如今，在动物细胞悬浮培养过程中，以往使用的常规培养基已经逐步的被无血清培养基替代，这样就在很大程度上将血清培养基被污染的几率相应的降低，并且相应的降低了生产的成本％根据相关细胞悬浮培养技术的相关报道可知，无血清微载体细胞培养技术在多种疫苗的生产及组织工程细胞的扩大培养中已经文章编号：2095 —9737(2018)06 —0137 —01广泛的采纳应用，市场发展前景非常可观％但是在实际的研究过程中，采用仍然存在着需要解决的问题，即无血清培养而诱发的细胞凋亡问题％日后的相关研究中应该加以重视％1.3!择适的生物应生物反应器在细胞悬浮培养过程中是关键的设备％而生物反应器在研究中所具备的最重要的特点即逐级放大，因为实际疫苗生产的成本会直接的被细胞规模影响％目前，细胞培养技大培养是应器或加大反应器体积两种方式，增加小的反应器的数量在实际的研究中操作起来相对会更简化，但是却有很高的生产成本，所以研究中一般都是会通过增大反应器的体积而实现的％实际的生产研究中在选择反应器时应该经过综合的考量之后对生物反应器加以选择％1)选择生产工艺细胞悬浮培养工艺按照培养方式主要分为分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作％2细胞悬浮培养在猪用疫苗生产中的应用我国猪饲养逐渐呈现集约化、规模化的趋势发展，传染性疾病在猪群中流行会给饲养者带来比较大的影响％我国对于一些传染病的主要控制措施是接种疫苗，这样如果随着悬浮细胞培养技术的不断发展且趋于成熟，已经有很多种疫苗在大规模的生产％3小结生物应器培养技在在用疫苗的生产领域得到了非常广泛的应用％但是目前在我国，细胞悬浮技术起步较晚，但是目前已经得到了快速的发展％伴随细胞培养技的步，生物应器细胞高的培养以生产兽用和人用疫苗是发展的目标％随着深入的研究，细胞悬浮培养的生产工艺进一步完善，生物反应器也在很大程度上得以更加合理的设计，这样悬浮细胞培养技术的应用会相对容易些％如果在实际的应用生产中可以通过不断的对动物细胞培养技术展开大规模的生产，这即将在今后兽用疫苗规模化生产的发展道路上具有一定的推动作用％收稿日期2017—12 —25第一作者简介：高习文（1982 —），汉族，大专，助理工程师，研究方向：动物细胞培养（转瓶细胞、悬浮细胞）、细胞毒疫苗效价影响因素％。

动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产中的应用

２０２０年第６期（总第３７３期）畜禽业疫病防治动物细胞悬浮培养技术在兽用疫苗生产中的应用冯　婷，李海玉，周　祁（杭州佑本动物疫苗有限公司，浙江杭州３１００１８）摘　要：近年来，随着养殖业的发展壮大，进而也加快了兽用疫苗的发展与研究。

尤其是目前所应用的动物细胞悬浮培养技术，引起了社会广泛关注。

目前该类技术主要应用于各类生物制品及兽用疫苗的研究和生产过程中，通过这种技术可以大大降低兽用疫苗的研究成本，因此以生物反应器技术为基础的细胞悬浮培养技术平台日趋成熟，从而能够有效的推动疫苗的发展与生产。

主要介绍了细胞悬浮培养技术以及该技术在兽用疫苗生产过程中的应用。

关键词：动物细胞；悬浮培养；兽用疫苗；生物反应器ＤＯＩ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２０．０６．０７５　引言细胞悬浮培养技术主要是以人工培养为基础，并将动物细胞放置在反应器中对其进行大规模以及高效率的培养，目前此技术已广泛的应用在生物制品生产、蛋白质相关药物研究、疫苗生产、干细胞移植等多个领域中。

　关于细胞悬浮培养的优化技术在对疫苗进行生产工艺研发的过程中，需要以提高生产产率和保证产物质量的可靠性是疫苗生产最主要目的。

因此在实际的生产研究过程中，需要对悬浮培养技术的组成因素进行选择，其包括悬浮细胞的选择、最适生物培养基的选择以及生物反应器和生产工艺的选择等几个方面。

１．１　关于动物细胞系的选择以及悬浮驯化在兽用疫苗的生产过程中，需要对疫苗的安全性、有效性以及成本控制这三方因素进行优先考虑，因此需要对细胞系的选择以及悬浮驯化这两个方面进行研究，以此来使疫苗的安全性、有效性以及成本控制等因素达到最优。

在进行细胞系的选择过程中，需要注意当同种细胞遇上准备扩增的病毒时，两者会发生相互作用，因此在通过某种细胞系进行疫苗生产之前，应该与准备增殖的病毒进行互相适应实验，以此来进行选择。

其次，对扩大培养和扩大培养工艺起决定性作用的是细胞不同时期的生长特点，对处在不同状态的同一种细胞进行培养的时候，可以观察到它对于病毒所表现出的敏感性存在不同的差异。

悬浮培养技术在猪圆环疫苗生产中的应用

养殖与饲料2020年第05期悬浮培养技术在猪圆环疫苗生产中的应用李少丽*邵攀峰朱国坡尹忠良杭州佑本动物疫苗有限公司，杭州310018摘要猪圆环病毒病是猪的一种非常重要的免疫抑制性疾病，可直接破坏猪的免疫系统，并引起其他疾病的并发或继发感染。

针对该病的疫苗主要为全病毒灭活疫苗和基因工程亚单位疫苗，基因工程亚单位疫苗一般利用生物反应器生产，而国内猪圆环全病毒灭活疫苗的微载体悬浮培养生产的工艺目前还处于研究阶段。

关键词悬浮培养；猪圆环病毒；疫苗收稿日期：2020-03-05*通讯作者李少丽，女，1983年生，博士，高级兽医师。

1猪圆环病毒概况猪圆环病毒（porcine circovirus ，PCV ）是目前发现的脊椎动物中最小的一种动物病毒，该病毒可分为PCV1和PCV2两种血清型。

PCV1对猪无致病性，广泛存在于猪体内和猪源传代细胞系中，PCV2可在猪群内引发多种传染病，如断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS ）、猪皮炎肾病综合征（PDNS ）等。

PCV2不仅可造成仔猪生长缓慢，而且还会侵害猪的免疫系统，导致猪群免疫抑制，影响其他疫苗的免疫效果，并引发其他病原的继发感染。

PCV2基因组大小为1766~1768bp ，共包括ORF1和ORF2在内的11个ORF 。

ORF2编码病毒衣壳蛋白（Cap 蛋白），Cap 蛋白为病毒的主要结构蛋白，是刺激机体产生免疫应答的主要抗原，也是基因工程亚单位疫苗研究的热点。

目前，针对圆环病的商品化疫苗国内已有30多家，主要为全病毒灭活疫苗和亚单位疫苗。

目前，国内疫苗企业上市的全病毒灭活疫苗均为转瓶工艺。

2悬浮培养技术在猪用疫苗生产中的应用随着细胞培养技术的不断发展成熟，许多细胞已从传统的转瓶培养被驯化为悬浮培养。

悬浮培养技术具有病毒产量高、生产周期短、污染小、批间稳定、操作方便、可自动化控制、劳动成本低等优势，其可分为微载体悬浮培养和全悬浮培养2种方式。

微载体培养是以细小的颗粒作为细胞载体，通过搅拌使细胞悬浮在培养液内，细胞在载体表面生长成单层的一种细胞培养方式。

[教学]MDCK细胞培养技术

[教学]MDCK细胞培养技术孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,培养液的量2ml, 12孔板底面积4.5cm2,加24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。

在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml.附件1:GIBCO BRL Cat. # EDTA处理胰酶 15400GIBCO BRL Cat. # HEPES 缓冲液 1 M 母液 15630-080GIBCO BRL Cat. # D-MEM培养基 11965-092GIBCO BRL Cat. # 青、链霉素母液 10,000 U/ml 15140-122/100mlGIBCO BRL Cat. # 牛血清白蛋白组分V 7.5%溶液 5260-037/100ml三、MDCK细胞培养技术(一)生物安全级别和生物安全规定1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别:正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。

2. MDCK细胞培养实验室生物安全规定:遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。

(二)MDCK细胞的传代培养步骤1. 细胞培养所需的材料(部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择):(1) 生长成片的MDCK细胞;(2) T-75细胞培养瓶,颈口有倾角;(3) D-MEM培养液;(4) 青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G;10,000µg/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20?;(5) HEPES缓冲液，1M母液;(6) 胎牛血清;(7) EDTA-胰酶(0.05,胰酶;0.53mMEDTA?4Na)(Gibco CatNo.25300-062)，分装后保存于-20?;(8) 牛血清白蛋白组分V，7.5,溶液(GIBCO CatNo. 15260);(9) 1mL和10mL无菌移液管等;(10) 70,,75,的酒精。

MDCK细胞培养技术

孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml,12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml,24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml,96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml,24孔板底面积2cm2,一般加培养液的量1ml,在接种病毒的时候一般病毒用量为添加培养液的5%-20%。

在做咽拭子标本时应视标本的采集质量而定，如果标本采集质量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果标本采集的不够好，则应相对加大标本接种量，可以加到1ml.附件1：三、MDCK细胞培养技术（一）生物安全级别和生物安全规定1. MDCK细胞培养实验室生物安全级别：正常MDCK细胞培养在生物安全二级实验室进行。

2. MDCK细胞培养实验室生物安全规定：遵守生物安全实验室相应的生物安全规定。

（二）MDCK细胞的传代培养步骤1. 细胞培养所需的材料（部分试剂在此列出生产厂家货号仅供参考，可自行选择）：（1）生长成片的MDCK细胞；（2）T-75细胞培养瓶,颈口有倾角；（3）D-MEM培养液；（4）青、链霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000µg/mL硫酸链霉素)，分装后保存于-20℃；（5）HEPES缓冲液，1M母液；（6）胎牛血清；（7）EDTA-胰酶(0.05％胰酶；0.53mMEDTA·4Na)（Gibco CatNo. 25300-062），分装后保存于-20℃；（8）牛血清白蛋白组分V，7.5％溶液（GIBCO CatNo. 15260）；（9）1mL和10mL无菌移液管等；（10）70％～75％的酒精。

建议：经常检查试剂使用的有效期和MDCK细胞的代数。

2. 培养基和试剂的准备:（1）500mL的D-MEM液中加入a) 青、链霉素母液5mL(终浓度达:100U/mL青霉素和100µg/mL 链霉素)；b) H EPES缓冲液12.5mL(终浓度:25mM)；c) 7.5％牛血清白蛋白组分V12.5mL。

MDCK无血清培养基说明书(2015.9.16)

MDCK细胞传代 1. 细胞长至融合度达到80％-90％时，弃去培养液，用PBS或不含钙镁的Hank’s液清洗细胞2-3遍。 2. 加入适量0.25%的EDTA-胰酶，37℃，5%CO 2培养箱中孵育至细胞收缩变圆，轻拍培养瓶可见细胞移动即可。 3. 加入无血清培养基终止消化，用吸管轻轻吹打，使细胞分散。 4. 细胞悬液转入离心管中，800 rpm离心5分钟，去除上清液，重新加保存有效期12个月
产品特性
1. MDCK细胞无血清培养基化学成分限定，不含胎牛血清。 2. MDCK细胞无血清培养基培养MDCK细胞，连续传代50代，细胞特性无改变。 3. MDCK细胞无血清培养基培养MDCK细胞的倍增时间是17.1小时。
使用说明
MDCK细胞复苏 1. 从液氮罐中取出冻存管直接置于37℃温水中，并不断地轻轻摇动，使管中的液体迅速融化。 2. 用吸管吸取10 ml 预温的MDCK无血清培养基到15 ml离心管中，冻存管用75%酒精擦拭表面后，将细胞悬液吸到15 ml离心管中，混匀。 3. 800 rpm离心5分钟，除去上清液，用适量预温的无血清培养基重悬细胞，接种于细胞培养瓶中。 4. 37℃，5%CO2培养箱中培养，次日更换一次培养液，继续培养1-2天至细胞铺满瓶底的 80%-90%进行传代。
2 5. 以（1-5)×10 cells/cm 接种于细胞培养瓶内，置37℃ 5%CO2 培养箱中培养，细胞长满 4 2
瓶底80%-100%后进行下一次传代（一般2-3天传代一次）。 MDCK细胞冻存 1. 选取融合度达80%的MDCK细胞用于冻存。 2. 依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，800 rpm离心5分钟。 3. 去除上清液，加入商品化的细胞冻存液或无血清配制的冻存液（冻存液需要提前预冷），冻存液中细胞的最终密度为（5-10）×10 cells/mL。用吸管轻轻吹打是细胞混匀，然后分装至无菌冻存管中，每只冻存管加液1-1.5 mL。 4. 细胞经过程序降温后置于液氮中保存。流感病毒的分离与培养 1. 选取融合度75％-90％的MDCK细胞，弃去培养液，PBS或不含钙镁的Hank’s液清洗细胞2-3遍。 2. 加入200 uL的流感病毒标本，温和摇动数次。 3. 放于37℃、5% CO2培养箱中吸附1-2小时。 4. 加入6 mL流感病毒分离无血清培养基于培养瓶中。放置于35℃，5%CO2培养箱中培养。 5. 每日观察细胞病变情况。无血清培养基培养的MDCK细胞，病毒侵染后释放快，请及时收获病毒。

悬浮细胞培养技术课件

悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术.进一步掌握细胞培养的操作技术.实验原理：培养细胞生长一定时间后,需别离再培养,否那么细胞因生存空间不够,细胞密度过大,致营养缺乏而引起细胞发老、停止生长甚至死匚.为了维持细胞的存活和生长,必须进行再培养,即将原培养瓶内细胞别离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱；〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、废液缸、〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架〔四〕其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪〔五〕试剂1640培养液、PBS操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.3 .首先观察培养板孔中培养液量.用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液, 转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.4,离心,设置离心机1000转/分,4-5分钟.5,取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.吸取培养液约7ML放入离心管, 轻轻吹打细胞,使之均匀悬浮.6,吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中,备计数用.7.其余的细胞分别放入六个孔中,每孔约1ML8,吸取培养液参加板孔中至1/3孔容量.9.镜下观察细胞是否分布均匀,放入培养箱培养.二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期-指数增生期-停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体外表,称贴壁,悬浮期结束,细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关.一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期,原代培养细胞潜伏期长,约24-96小时或更长,连续细胞系和月中瘤细胞潜伏期短,仅需6-24小时.(2)指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段,分裂相细胞增多.指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志.通常以细胞分裂相指数( Mitotic index, MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞和月中瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%.指数增生期的细胞活力最好时期,是进行各种实验最正确时期, 也是冻存细胞的最好时机.在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3-5天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触集合成片.正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象(contact inhibition).而恶性月中瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled up).细胞接触集合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多. 但是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Density Inhibition ).(3)停滞期(Stagnate phase)细胞数量到达饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期. 此时细胞数持平,故也称平台期(Plateau phase ).停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动.如不进行别离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代.实验目的：1 .能独立的进行细胞技术,会绘制生长曲线,了解细胞生长的发育特性.2 .学习在科研中如何应用生长曲线实验原理：生长曲线的测定(计数法)是测定细胞绝对生长数的常用方法,也是判定细胞活力的重要指标,为培养细胞生物学特性的根本参数之一. 一般细胞传代之后,经过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期.在细胞到达饱和密度后, 停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡.为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化, 需连续对细胞进行计数,通常计数7天.为精确起见,一般每次计数三瓶细胞并取平均值. 典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期,成平台状的平顶期及退化衰亡四个局部.以存活细胞数对培养时间做图,即生长曲线.生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响.一般在对数期的1/3-1/2处加药.细胞技术的时间和次数依实验目的而定.另外,测定生长曲线的常用方法还有MTTWo计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时, 通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目.操作步骤：1 .将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板,放在镜下观察.2 .制备细胞悬液：细胞从培养板孔转移到离心管, 离心1000转4-5分钟,弃去上清,参加PBS至一定体积(1MD.3 .将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静置3min,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中.4 .计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的.然后按公式计算：细胞数加1二四大格细胞总数/4 X 104说明：公式中除以4,由于计数了4个大格的细胞数.公式中乘以104由于计数板中每一个大格的体积为：1.0mm (长)x 1.0mm (宽)x 0.1mm (高)=0.1mm3而1ml=1000mm3(注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团, 应按单个细胞计算,假设细胞团10%Z上,说明分散不好,需重新稀释制备细胞悬液)台盼兰染色操作步骤：1、制备细胞悬液,放入EP管中.2、以1: 1的比例参加0.4%台盼兰染7取,染色2 — 3分钟.3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片.4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计算细胞活力.冻存与复苏一、哺乳动物细胞冷冻保存实验目的：(1)保存种子细胞,以便随时取用.这是保存细胞的最主要目的(2)减少细胞被微生物污染的危险性.(3)减少细胞之间交叉污染的危险性.(4)减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变.(5)防止有限细胞系出现衰老或恶性转化.实验原理：细胞冻存及复苏的根本原那么是慢冻快融,实验证实这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚碉作保护剂,这两种物质能提升细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,防止由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱.〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、玻璃瓶〔250ml、100ml〕、废液缸；〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管〔10ml〕、15ml离心管、冻存管〔1〜2ml〕〔四〕其他物品微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪.〔五〕试剂1640培养液、DMSO〔分析纯〕K562细胞,慢性粒细胞白血病细胞系中的一种.操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .配制冻存液：吸取9ML培养液放入离心管,用移液枪吸取1MLDMSO?液,逐滴缓慢参加离心管中.最好把离心管插在冰中.3 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.4 .吸出1个孔中的细胞连同培养液,转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.5 .离心,设置离心机1000转4-5分钟.取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.轻轻吸出余下的培养液,注意勿吸出细胞沉淀.6 .吸取1ML配制好的冻存液参加离心管,与细胞混匀后,转入冻存管.7 .标注：标明细胞种类、冻存日期,冻存人.8 .在4 c冰箱中放置30分钟；然后转入-20 C ,放置30分钟；然后再转入-80 C 放置16- 18小时(或过夜)；最后放入液氮中长期保存.有条件的地方, 可用冻存盒. 考前须知：(1)冻存过程需缓慢(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90% ,无微生物污染.(3)细胞浓度限制在：1 X 107 — 5 X 107/ml.(4)使用适宜的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是DMSOf甲基亚碉),使用终浓度为5—10%.但是, 有些细胞系不能用DMSO为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.由于,DMSC^ 诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele ), 羟乙基淀粉等.(5) DMSO释时会释放大量热量.因此,DMSO^能直接加到细胞液中,必须事先配制.细胞复苏操作步骤：(一)准备工作1、37c水浴2、准备一个内装5-10 ml细胞完全培养液离心管.(二)复苏1、带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,迅速放入37c水浴中,手持冻存管不断摇动.观察完全解冻后移入超净台.冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否那么,易发生污染.2、翻开冻存管,迅速将细胞悬液吸到离心管中,轻轻混匀.3、1000rpm离心5 min ,弃去上清液.4、沉淀中参加适当培养基,37c常规培养,第二天观察生长情况.考前须知：1 .解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.2 .解冻时务必注意平安,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,切不可直接用手,以免冻伤.。

什么是CHO细胞、MDCK细胞、Vero细胞和EB66细胞

CHO细胞，即中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。

全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都是由CHO细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如EPO)，而CHO却具有如上的功能，因此CHO成为表达复杂生物大分子的理想宿主。

另外CH0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利。

MDCK细胞的来源：MDCK是S.H.MADIN于1958年9月建成，来源于考克斯班尼犬肾脏，该肾脏细胞原代培养时其形态类似于成纤维细胞，经过胰蛋白酶和EDTA混合消化液的连续6次消化法纯化而上皮样细胞，每次纯化间隔时间为7D。

培养中MDCK细胞具有远段肾小管与集合管，来源细胞的分化特性。

MDCK细胞株至少有两种细胞类型，一种命名为C5A，其在含I型胶原的培养物中生长时，能分泌液体，导致囊肿形成，但在塑料面的培养低物上培养时，能分泌液体，却不能形成囊肿，另一种细胞正好相反。

2.MDCK细胞的用途：MDCK细胞被广泛用作远曲小管或集合管的模型，还可用于代谢研究和Pg级药物与药物相互作用研究以及观察流感病毒株对细胞功能的影响。

3.MDCK细胞的培养，的确有的用DMEM培养基，有的用MEM培养基，培养某一类型细胞没有固定的培养条件。

在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199等培养基中同样很容易生长。

所以我认为你可以任意选择。

我过去比较喜欢用DMEM培养基。

4.高糖DMEM与低糖DMEM的区别是：高糖DMEM的葡萄糖含量是25.5mmol/L,而低糖DMEM的糖含量是5.5mmol/L,其中低糖DMEM的糖含量与一般的培养基相同，所以可以和其他一般培养基通用，而高糖DMEM主要用在肿瘤等特殊细胞的培养，如何选择需要依照要求而定。

第11章细胞悬浮培养和突变体筛选

相对于采用固体培养基的培养，液体悬浮培养体系在取得状态比较一致的细胞群体，进行突变个体的筛选、以及进行大规模的培养以生产有重要价值的次生物质（药用物质）方面有重要的应用。
2
第一节
细胞悬浮培养的方法和特点
1，细胞悬浮培养的方法
1.1，摇床和三角瓶一般细胞增殖、营养生理等研究、细胞分裂同步化、细胞再分化（胚胎发生）的研究、原生质体供体材料的准备等。 1.2，转轮和试管液体培养与1.1相似但较少用 1.3，悬滴培养单细胞或少量的原生质体或原生质体融合后的杂种细胞等； 1.4，发酵罐培养用于进行次生代谢物质生产的悬浮培养；
抑制法是加入一些抑制性的物质使细胞分裂停止进行，然后除去这些物质使细胞同时重新开始分裂。
23
第一节
细胞悬浮培养的方Leabharlann 和特点5，悬浮培养体系的应用
5.2，细胞无性系突变筛选涉及到细胞工程的另一个重要内容，合并到下一节中进行讲解。
24
第二节无性系变异及突变体的用途
1，无性系变异
1.1，基本概念
25
第二节无性系变异及突变体的用途
1，无性系变异
无性系变异的本质是细胞的遗传物质或遗传物质的表达产生了变化，由这些细胞再生的植株是变异植株，也称为变异体或变异个体（variant）。和变异的定义很接近（但不完全等同）的是突变（mutation）,发生突变的个体称为突变体 (mutant)。
结合的产物，主要研究离体条件下的体细胞在
有丝分裂过程中的遗传规律。
30
第二节无性系变异及突变体的用途
3，突变体的用途
3.1，基础理论研究
遗传学研究：例如基因定位；基因分离 (克隆)；功能基因组研究；等生物学以及生物化学研究：例如发育生物学；代谢途径与调控；等 3.2，实际生产育种（食品、医药、工业上的应用）

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｖｅｒｔＭＤＣＫｃｅｌｌｌｉｎｅｔｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｈｕｒｅ，ａｎｄｕｓｅｔｈｅｓｕｓｐｅｎｓｅｄｃｅｌｌｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅ
ＺＨＡＮＧＬｉａｎｇ－Ｙａｎ，ＹＡＯＺｈｉ－Ｄｏｎｇ，ＸＩＮＧＬｉ，ＧＵＣｈａｏ —Ｙｉ，ＬＩＵＫｕｎ，ＷＡＮＧＸｉ－Ｌｉａｎｇ
ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰａｔｈｏｇｅｎａｎｄＢｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
１０００７ｌ，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏ — ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒｓ，ＬＩＵＫｕｎ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｋｕｎｃｎ＠１２６．ｃｏｎ；ＷＡＮＧｒＸｉ — Ｌｉａｎｇ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉｌｉａｎｇｗ＠１２６．ｃｏｎ
３８２
生物技
ＬＥＴＴＥＲＳＩＮＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＶｏｌ・斗２４Ｎ。－ｏ・３ｊＭａＭａｙ，～ＺＵ１ｌ３ｊ
．
术通讯 …
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－０００２．２０１３．０３．０２０
ｉｎｌｆｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ。ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｉｎｌｆｕｅｎｚａｖｉｒｕｓｉｎｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＭＤＣＫｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｉｎｓｅｒｕｍ— ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｄｉｒｅｃｔｌｙｏｒｇｒａｄｕａｌｌｙ．ｔｈｅｎｔｈｅｓｅｒｕｍ— ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ— ａｄａｐｔｅｄｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｈｕｒｅｄｉｎｌａｂ — ｓｃａｌｅｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｗｉｔｈｓｐｉｎｎｉｎｇｔｏａｃｑｕｉｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｄｃｅｌｌｓ，ａｎｄｔｈｅｓｅｃｅｌｌｓｗｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｔｏｐｒｏｄｕｃｅｉｎｌｆｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＭＤＣＫｃｅｌｌｓｗｅｒｅａｄａｐｔｅｄＳＵＣＣＥＳＳｆｕｌｌｙｉｎｓｅｒｕｍ— ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ．ａｎｄｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｈｏｓｔｃｅｌｌｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｉｎｌｆｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｄＭＤＣＫｃｅｌｌｓｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄ
研究报告
ＭＤＣＫ细ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胞的悬浮驯化及初步应用
张良艳，姚志东，邢丽，顾超逸，刘坤，王希良
军事医学科学院微生物流行病研究所，北京１０００７１［摘要］目的：驯化ＭＤＣＫ细胞使之适应悬浮培养，以之作为生产流感病毒疫苗的介质，为以细胞代替鸡胚制备流感病毒疫苗提供保证。方法：通过直接法和间接法分别驯化ＭＤＣＫ细胞，放大培养能悬浮生长的ＭＤＣＫ细胞，并以之作为介质培养流感病毒。结果：获得了能悬浮培养的ＭＤＣＫ细胞，其在悬浮条件下生长良好；以之作为载体培养流感病毒，可获得较高产量的病毒。结论：建立了悬浮培养的ＭＤＣＫ细胞，以之作为载体培养流感病毒可获得较高病毒滴
度，为细胞培养生产流感病毒疫苗奠定了基础。
［关键词］ＭＤＣＫ细胞；流感病毒；悬浮培养；生长曲线；病毒滴度［中图分类号］Ｑ８１３．１＋１［文献标识码］Ａ［文章编号］１００９ — ０００２（２０１３）０３ — ０３８２ — ０３
ＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆＭＤＣＫＣｅｌｌＬｉｎｅｔｏＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎＣｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｔｓＡｐｐｌｉ－
ｃａｔｉｏｎｆｏｒＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ