大肠菌群检测
曹双：请综合看看各种方法，比较一下，有些内容是一致的，有些是
每种方法不同于其他方法的，注意比较。
第一篇
（蓝色部分为说明和附录，去掉这部分剩下的为连续文件）
大肠杆菌检验方法
SN 0169—92出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
GB/T 4789.6—1994食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希
氏菌检验（这两个检验方法另有完全的PDF文件，见文件夹）
以SN标准方法为例，进行说明。
样品制备：
以无菌操作取25 g样品,放入装有225 mL稀释剂的灭菌均质杯内,于8000 r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液,如10**-2、10**-3、10**-4……。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程不得超过15min。
附：这是一种9管MPN法测定方法，什么是MPN法（最近似法）？
MPN法简介
发布日期：2010-05-13 浏览次数：212
The Most Probable Number Method In the following example, a set of 3 tubes of an all purpose broth medium is inocu
The Most Probable Number Method
In the following example, a set of 3 tubes of an all purpose broth medium is inoculated from each of the ten-fold dilutions, with each tube being inoculated with one ml.
After incubation, the number of tubes showing growth is recorded. As the succeeding dilutions were made, the organisms were diluted to such an extent that none were in the inocula of seven of the tubes (marked negative). In order to estimate the number of organisms per ml of the sample which would cause this kind of growth response, we locate the three sets of tubes which show dilution of the organisms "to extinction" –i.e., those tubes which were inoculated from the 10–2, 10–3 and 10–4 dilutions.
附录
1g检样中最近似值(MPN)表 (补充件)
以0.1、0.01、0.001g各用3管。
━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━
阳性管数┃┃阳性管数┃
━━━━━━━━━┫MPN ┣━━━━━━━━━━┫ MPN
0.1 0.01 0.001┃｜0.1 0.01 0.001┃
━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
000┃＜3 ┃200┃ 9.1
001┃3┃201┃ 14
0 02┃6┃202┃ 20
0 03┃9┃203┃ 26
011┃ 6.1 ┃211┃ 20
0 12┃9.2 ┃212┃ 27 013┃12 ┃213┃ 34 020┃ 6.2 ┃220┃ 21 02 1 ┃9.3 ┃221┃ 28 022┃12┃222┃ 35 023┃16┃223┃ 42 030┃9.4 ┃230┃ 29 031┃13┃231┃ 36 032┃16┃232┃ 44 033┃19┃233┃ 53 ━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━
100┃ 3.6 ┃300 ┃ 23 101┃7.2 ┃301┃ 39 102┃11┃302┃ 64 103┃15┃303┃ 95 110┃7.3 ┃310┃ 43 111┃11┃311┃ 75 112┃15┃312┃ 120 113┃19┃313┃ 160 120┃11┃320┃ 93
122┃20┃322┃ 210
123┃24┃ 3 23┃ 290
130┃16┃330┃ 240
13 1 ┃20┃331┃ 460
132┃24┃332┃ 1100
133┃29┃333┃＞1100
━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━
LST和EC初步筛选：
对每个样品,选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤,每管接种1mL。将接种管置于36±1℃培养48±2h。
观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生,用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内,培养48±2h。
附：LST肉汤、EC肉汤有些什么？
LST肉汤和EC肉汤中有什么？
（发酵乳糖产气）
月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤
EC肉汤
胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase) 20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g 月桂基硫酸
钠 0.1g 蒸馏
胰蛋白(月示)或胰酪(月示) 20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 4.0g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏
水 1000.0mL
水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm
试管中,每管10mL 。121℃高压灭菌15min 。最终pH6.8±0.2。 将以上成分溶解于蒸馏水中,分装
16mm×150mm 试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL 。121℃高压灭菌15min,最终
H6.9±0.1。
EMB 平板：
取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃培养24±2h 。
检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
如有典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落,则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位,移种到营养琼脂斜面上,36±1℃培养18～24h 。
附：怎样进行平板划线分离？
平板划线分离的方法
发布日期：2010-09-01 浏览次数：202
1.斜线法
2.曲线法
3.方格法
4.放射法
5.四格法
1.斜线法
2.曲线法
3.方格法
4.放射法
5.四格法
平板划线示例
平板划线示例
发布日期：2010-09-01 浏览次数：612
平板划线示例
This is an example of a good stre
平板划线示例
This is an example of a good streak for
isolation using the "four corners"
method.
The small colonies here are of
Staphylococcus epidermidis
This is not a great streak plate but
it is serviceable, as there are a few
isolated colonies. This plate would
have been better if the loop had been
flamed between each sector.
This is an example of how NOT to streak for isolation. Scribbling is not streaking, and most likely will not result in isolated colonies
This plate isolates two different colonies: Escherichia coli (the cream-colored) colonies, and Serratia marcescens (the red colonies).(粘质沙雷菌）
This is a plate with Micrococcus luteus
滕黄微球菌 , the yellow colonies. While
this is a good streak for isolation, the
plate has been contaminated. The large
"fuzzy" colonies are fungal colonies.
The lid may have been lifted too far away
from the plate while streaking, or a draft
may have caused the spores to fall into the
plate.
EMB平板原理及照片
EMB平板照片及原理
发布日期：2010-05-13 浏览次数：238
This image illustrates the growth of gram-negative bacteria that cannot ferment lactose on eosin methylene blue (
This image illustrates the growth of gram-negative bacteria that cannot ferment lactose on eosin methylene blue (EMB) agar. EMB agar contains bile salts and dyes which inhibit growth of gram-positive bacteria. Growth on EMB agar is a useful diagnostic tool to distinguish between lactose fermenters and nonfermenters which will appear colorless. This image can be used to describe the use of metabolism in identification of bacteria. Salmonella and Shigella, both nonlactose fermenting pathogens, can be distinguished from the more common intestinal flora which ferment lactose.
lnfemb-an.jpg Lactose Nonfermenter on EMB
Pat Johnson, Palm Beach Community College, Lake Worth, Fla., USA
生化试验：
将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
1色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后,加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL,上层出现红色为靛基质阳性反应。
附：靛基质试验原理及照片
靛基质试验原理及照片
发布日期：2010-05-13 浏览次数：290
靛基质（Indole）试验：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基
靛基质（Indole）试验：
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs 氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结
果更为可靠。
Margaret (Peg) Johnson, Mesa Community College, Mesa, Ariz., USA
This image depicts the results of negative and positive indole tests. The indole test is frequently employed to distinguish Klebsiella or Enterobacter bacteria (indole negative) from Escherichia coli (indole positive). The presence of E. coli is used by public health officials as an indicator of fecal contamination of food and water supplies.
Prior to this test, Enterobacter aerogenes was used to inoculate one tryptone broth, while another tryptone broth was inoculated with Escherichia coli. The two broths were then incubated for 24 h and mixed with Kovas reagent
(p-dimethylamino-benzaldehyde). Tryptone broth is rich in the amino acid tryptophan. Tryptophanase, an enzyme, is capable of cleaving tryptophan and producing indole, pyruvic acid, and ammonia. Indole can be detected by the development of a red color after adding Kovas reagent. Organisms that do not produce tryptophanase will be indole negative, as no indole will be present to react with the Kovas reagent
2 MR-VP培养基：在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1 mL
至13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液0.6mL,40％氢氧化钾溶液0.2 mL和少许肌酸结晶,振摇试管后静置2h,如出现伊红色,为VP试验阳性。
将MR-VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5 滴甲基红溶液。如培养物变红色,为甲基红试验阳性,若变黄色则为阴性反应。
附：MR-VP试验原理及照片
MR-VP试验原理及照片
发布日期：2010-05-13 浏览次数：224
甲基红（Methyl Red）试验肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由
于糖代谢的途径
甲基红（Methyl Red）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
大肠杆菌：MR + /VP -
3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
附：枸椽酸盐利用试验原理及斜面显色照片
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
发布日期：2010-05-13 浏览次数：136
枸椽酸盐试验：某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于
枸椽酸盐试验：
某些细菌能利用枸椽酸盐作为碳源，及磷酸铵作为氮源，将枸椽酸盐分解为二氧化碳，培养基反应后成碱性，由于指示剂的作用，培养基变为兰色。
说明：
SN标准所用培养基是肉汤培养基，且不加指示剂，因此，只能观察是否浑浊生长。
Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 1.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g
硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g
枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g
蒸馏水 1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中,分装试管,每管10 mL,121℃高压灭菌15min。最终pH6.7
±0.2。
4 LST肉汤：于36±1℃培养48±2h,观察试管中是否产气。
5革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。
大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━
靛基质┃MR┃VP┃枸椽酸盐┃鉴定(型别) ━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋┃＋┃－┃－┃典型大肠杆菌
－┃＋┃－┃－┃非典型大肠杆菌
━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
＋┃＋┃－┃＋┃典型中间型
－┃＋┃－┃＋┃非典型中间型━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━
－┃－┃＋┃＋┃典型产气肠杆菌
＋┃－┃＋┃＋┃非典型产气肠杆菌
━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━
如出现上表以外的生化反应类型,表明培养物可能不纯,应重新划线分离,必要时做
重复试验。
结果报告：
大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC试验为＋＋
－－或－＋－－,再根据LST肉汤阳性管数查MPN表,报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN
值。
第二篇
大肠菌群测定的操作细则（MPN法）
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料
1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂
2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中
3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤
3.1 检样稀释
3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支
1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
3.2 乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL 及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
3.3 分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
3.4 证实试验
在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置
36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。
3.5 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
4 粪大肠菌群(faecal coliform)
4.1 用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物(见3.2条)转种于EC肉汤管内,置
44.5±0.2℃水浴箱内(水浴箱内的水面应高于EC肉汤液面),培养24±2h,经培养后,如所有EC 肉汤管均不产气,则可报告为阴性;如有产气者,则将所有产气的EC肉汤管分别转种于伊红美蓝琼脂平板上,置培养18-24h,凡平板上有典型菌落者,则证实为粪大肠菌群阳性。
4.2 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)粪大肠菌群的MPN值。
第三篇
出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法
Method for examination of coliform，fecal coliform and escherichia coli in food for export
SN 0169—92
代替ZB X09 002—86
1 主题内容与适用范围
本标准规定了出口食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的检验方法。
本标准适用于出口食品的检验。
2 设备和材料
2.1 吸管：1mL，具0.1mL刻度；5mL和10mL，具1mL刻度。
2 2 水浴箱：44.5±0.5℃。
2.3 培养箱：36±1℃，44.5±0.5℃。
2.4 冰箱：0～5℃和-15～-20℃。
2.5 均质器。
2.6乳钵和研棒。
2.7 平皿：直径90mm。
2.8天平：感量0.1g。
2.9 显微镜。
2.10 稀释瓶：100mL、200mL和500mL三角烧瓶及广口瓶。
2.11 玻璃珠：直径约5mm。
2.12菌落计数器。
3 培养基及试剂
3.1 月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤。
3.2 煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。
3.3 EC肉汤。
3.4 伊红美蓝琼脂(EMB)。
3.5营养琼脂斜面。
3.6 色氨酸肉汤。
3.7 MR-VP培养基。
3.8 Korser氏枸椽酸盐肉汤。
3.9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。
3.10 Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液。
3.11 生理盐水。
3.12 革兰氏染色液。
3.13 Kovacs氏靛基质试剂。
3.14 甲基红指示剂。
3.15 V oges—pros kauer(V—P)试剂。
4 样品制备
4.1 以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。若不能及时检验，应将冷冻样品置于-15℃保存；非冷冻而易腐的食品，应置于4℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2—5℃18h内解冻，或在45℃以下15min内解冻。
4.2 不同食品样品匀液的制备
4.2.1 液体食品
以灭菌吸管取样25mL放入装有225mL稀释剂的灭菌玻璃瓶(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，
以30cm幅度、于7s内振摇25次(或以机械振荡器振摇)，制成1：10的样品匀液。
4.2.2 固体和半固体食品
以无菌操作取25g样品，放入装有225mL稀释剂的灭菌均质杯内，于8000r／min均质1～2min，制成1：10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。
4.3 稀释样品匀液根据对样品污染情况的估计，用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递增的样品稀释液，如10-2、10-3、10-4.………。从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不得超过15min。
5 大肠菌群的测定
5.1 大肠菌群MPN值的测定
5.1.1 对每个样品，选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液。每个稀释度接种三管月桂基硫酸盐胰蛋白(LST)肉汤，每管接种1mL。
5.1.2 将接种管置于36±1℃培养48±2h。
5.1.3 观察试管的产气情况：检查倒管内是否有气泡产生，记录在24h和48h内产气的LST 肉汤管数。如所有LST肉汤管均未产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则进一步作证实试验。
5.2 大肠菌群的证实试验
5.2.1 将所有产气管用直径为3mm的接种环移种到煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中。
5.2.2 置BGLB肉汤管于36±1℃培养48±2h。
5.2.3 记录所有BGLB肉汤管的产气管数。
5.2.4 结果报告：按BGLB肉汤产气管数，查MPN表(见附录B(补充件))报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN值。
6 粪大肠菌群测定
6.1 用直径为3mm的接种环将所有48±2h内产气的LST肉汤管培养物移种于EC肉汤管中。
6.2 将所有接种的EC肉汤管在30min内放入带盖44.5±0.5℃水浴箱内，培养24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培养基液面。应以已知为44.5℃产气阳性的大肠杆菌和44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性对照。
6.3 记录EC肉汤管的产气情况。产气管为粪大肠菌群试验阳性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。
6.4 结果报告：按产气管数，查MPN表报告每克(毫升)样品中粪大肠菌群的MPN值。
7 大肠杆菌测定
7.1 将6.3条中的EC肉汤管继续培养24h，取其产气管的培养物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板，36±1℃培养24±2h。
7.2 检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。
7.3 如有典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个典型菌落；如无典型菌落，则从每个平板上至少挑取2个可疑菌落。用接种针接触菌落中心部位，移种到营养琼脂斜面上，36±1℃培养18～24h。
7.4 将斜面培养物移种到下列培养基中进行生化试验。
7.4.1 色氨酸肉汤：在36±1℃培养24±2h后，加Kovacs氏试剂0.2～0.3mL，上层出现红色为靛基质阳性反应。
7.4.2 MR—VP培养基；在36±1℃培养48±2h。以无菌操作移取培养物1mL至13mm×l00mm 试管中，加5％ɑ—萘酚乙醇溶液0.6mL，40％氢氧化钾溶液0.2mL和少许肌酸结晶，振摇试管后静置2h，如出现伊红色，为VP试验阳性。
将MR—VP培养物的剩余部分再培养48h滴加5滴甲基红溶液。如培养物变红色，为甲基红试验阳性，若变黄色则为阴性反应。
7.4.3 Koser氏枸椽酸盐肉汤：于36±1℃培养96h记录有无生长。
7.4.4 LST肉汤：于30±1℃培养48±2h，观察试管中是否产气。
7.4.5 革兰氏染色：取18h营养琼脂斜面培养物作革兰氏染色。大肠杆菌为革兰氏阴性。7.4.6 大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：
靛基质MR VP 枸椽酸盐鉴定（型别）
+ + - - 典型大肠杆菌
- + - - 非典型大肠杆菌
+ + - + 典型中间型
- + - + 非典型中间型
- - + + 典型产气肠杆菌
+ - + + 非典型产气肠杆菌
如出现上表以外的生化反应类型，表明培养物可能不纯，应重新划线分离，必要时做重复试验。
7.5 结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌，发酵乳糖产酸产气，IMViC试验为++--或-+--，再根据LST肉汤阳性管数查MPN表，报告每克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。
8 大肠菌群固体培养基测定法
8.1 样品制备同第4章。
8.2 计数
8.2.1 选取适宜的三个连续稀释度的样品液，每个稀释度接种两个灭菌平皿，每皿1mL。另取lmL稀释剂加入一个灭菌平皿中，作空白对照。
8.2.2 将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀。
8.2.3 待琼脂凝固后，再加3～4mLVRBA覆盖平板表层。
8.2.4 翻转平板，置于36±l℃培养18～24h。
8.2.5 选用有30～150个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。
8.2.6 证实
8.2.6.1 从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，移种于BGLB肉汤管内，36±1℃培养24h和48h，观察产气情况。
8.2.6.2 将出现产气的肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管，应进行革兰氏染色，以便排除革兰氏阳性杆菌。
8.2.7 结果报告
经最后证实为阳性(产气，革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于8.2.5条中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。
例：10-4样品稀释液lmL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：
100×6／10×104／g(mL)＝6.0×105／g(mL)
附录 A
培养基和试剂
(补充件)
A1 月桂基硫酸盐胰蛋白（LST）肉汤
胰蛋白或胰酪胨(Trypticase)
20g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2P04) 2.75g
月桂基硫酸钠0.1g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm试管中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.8±0.2。
A2 煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液200.0mL
0.1％煌绿水溶液13.3mL
蒸馏水
将蛋白胨乳糖溶于约500mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200mL(将20.0g脱水牛胆粉溶于200mL蒸馏水中，pH7.0～7.5)，用蒸馏水稀释到975mL，调pH7.4。再加入0.1％煌绿水溶液13.3mL，用蒸馏水补足到1000mL，用棉花过滤后，分装到20mm×l50mm试管(管内有倒立的小发酵管)中，每管10mL。121℃高压灭菌15min。最终pH7.2±0.1。
A3 EC肉汤
胰蛋白或胰酪
20.0g
3号胆盐或混合胆盐 1.5g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾(KH2P04) 4.0g
磷酸二氢钾(KH2P04) 1.5g
氯化钠 5.0g
蒸馏水1000.0mL
将以上成分溶解于蒸馏水中，分装16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管)，每管8mL。121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0。1。
A4 伊红美蓝琼脂(EMB)
蛋白胨10.0g
乳糖10.0g
磷酸氢二钾(KH2P04) 2.0g
琼脂15.0g
伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL
美蓝0.065g或0.5％水溶液13mL
蒸馏水1000.0mL
在1 000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂，加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL或200mL，高压灭菌15min。最终pH7.1±0.2。使用前将琼脂融化，于每100mL琼脂中加5mL灭菌的20％乳糖水溶液、2mL的2％伊红γ水溶液和1.3mL0.5％的美蓝水溶液，摇匀，冷至45～50℃倾注平皿。
A5 营养琼脂斜面
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 5.0g
琼脂15.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解。分装合适的试管。121℃高压灭菌15min。最终pH7.3±0.1。灭菌后摆成斜面备用。
A6 色氨酸肉汤
胰胨或胰酪胨10.0g
蒸馏水1000.0mL
加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管，每管5mL。121℃高压灭菌15min。最终pH6.9±0.2。
A7 MR-VP培养基
胨
7.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 5.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶于蒸馏水中，分装试管，121℃高压灭菌15min，最终pH6.9±0.2。
A8 Koser氏枸椽酸盐肉汤
磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4?4H2O) 1.5g
磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0g
硫酸镁(MgSO4?7H2O)0.2g
枸椽酸钠(含2H2O) 3.0g
蒸馏水1000.0mL
将各成分溶解于蒸馏水中，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。最终pH6.7±0.2。A9 结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)
蛋白胨7.0g
酵母膏 3.0g
乳糖10.0g
氯化钠 5.0g
胆盐或3号胆盐 1.5g
中性0.03g
结晶紫0.002g
琼脂15～18g
蒸馏水1000.0mL
将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调至pH7.4±0.1。煮沸2min，将培养基冷45～50℃倾注平板。临用时制备，不得超过3h。
A1O Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液
贮存液
磷酸二氢钾(K2HPO4) 34.0g
蒸馏水500mL
将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，用lmol／L氢氧化钠约175mL调至pH7.2。用蒸馏水加至1000mL贮存于冰箱。稀释液取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于合适容器后，121℃高压灭菌15min。
A11 生理盐水
氯化钠8.5g
蒸馏水1000.0mL
将氯化钠溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。
A12 革兰氏染色液
结晶紫染色液：
结晶紫 1.0g
95％乙醇20.0mL
1％草酸铵水溶液80.OmL
将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
革兰氏碘液：
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水300.0mL
将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液：
沙黄0.25g
95％乙醇10.0mL
蒸馏水90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
染色法
a. 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。
b. 滴加革兰氏碘液，作用lmin，水洗。
c. 滴加95％乙醇脱色约15～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。
d 滴加复染液，复染lmin，水洗、待干、镜检。
结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。
A13 Kovacs氏靛基质试剂
对二甲氨基苯甲醛 5.0g
戊醇75.0mL
盐酸(浓) 25.0mL
将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸即可。
A14 甲基红指示剂
甲基红0.1g
95％乙醇300mL
将甲基红溶解于300mL乙醇中，加水稀释至500mL。
A15 V oges—Proskauer(V—P)试剂
甲液
a-萘酚 5.0g
无水乙醇100.0mL
乙液
氢氧化钾40.0g
用蒸馏水加100.OmL
附录 B
1g检样中最近似值(MPN)表
(补充件)
使用三管法，接种量分别为0.1，0.01和0.00lg。
阳性管数MPN 阳性管数MPN
0.1 0.01 0.001 0.1 0.01 0.001
0 0 0 <3 2 0 0 9.1
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6.1 2 1 1 20
0 1 2 9.2 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6.2 2 2 0 21
0 2 1 9.3 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9.4 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 3.6 3 0 0 23
1 0 1 7.
2
3 0 1 39
1 0
2 11
3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7.3 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1
2 15
3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3
2 24
3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 >1100
注：①本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.0lg(mL)和0.001g(mL)]，每个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用1g(mL)、0.18(mL)和0.01g(mL)时，表内数字应相应降低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)时，则表内数字应相应增加10倍，其余类推。附加说明：
本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。
本标准由中华人民共和国秦皇岛进出口商品检验局、安徽进出口商品检验局、山西进出口商品检验局负责起草。
本标准主要起草人李桂生、汤鹏飞、于桂华。
本标准主要参考美国公职分析化学家协会(AOAC)法定分析方法第14版第46章(1984年)。
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
菌落总数、大肠菌群测定方法
菌落总数和大肠菌群测定（固体样品） 药品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃 棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定 将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加 200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支（18*180规格）试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST （合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。
3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸 或布包好，再用橡皮筋扎紧；同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌 1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。 2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。 3、盖上火菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。 4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP（兆帕）时，灭菌维持15分钟后（温度和压力不能过高或者过低），断电自然冷却到接近“ 0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作 进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等
大肠菌群测定方法
大肠菌群及检验 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工
作中。 二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。两个标准方法在检测程序上略有不同。 （一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h，观察菌落形态。证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h，观察产气情况。报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。 具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验大肠菌群测定》 （二）原国家商检局制订的行业标准，等效采用美国FDA的标准方法，用于对出口食品中的大肠杆菌进行检测。本方法采用两步法：推测试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管LST肉汤。36±1℃培养48±2h，观察是否产气。证
大肠菌群检测方法
大肠菌群检测方法 进入无菌室步骤 1．进入无菌室前应打开紫光灯进行灭菌，时间为0。5—1小时。 2．关灯后0?5小时后放可进入。 3．进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1，进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2，准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3，直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4，再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5，再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6，再吸取原液1ml放入盐水管中制成－1梯度的样液 7，更换一根吸管，从－1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8，再吸取－1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9，再把每个培养皿中到入营养琼脂平铺底部摇允（注另作3个培养皿：空气空白，把培养皿打开十分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中，倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10，把全部作好的放入培养箱中，温度36C＋－1×C，大肠24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培养皿中的琼脂凝固后反转过来放入培养箱中） 11，梯度：－1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 －2梯度为1ml－1梯度样液加入9ml生理盐水配成 －3梯度－4梯度配制方法和－1、－2梯度的配制方法一样 12，如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36C，24H＋－2H 。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之形不能划破伊红美兰琼脂表面） 13，取出后在用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36C＋－1C，24H＋＋－2H。 14，再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15，只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。16，清洗消毒这根试管前必须进行消毒霉菌，121C，0。5小时同时不能放气。
水的大肠菌群检测方法
4．1 在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100mL。 4．2 在10支装有5mL三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10mL。 4．3 轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。 4．4 观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。 5 证实试验 5．1 平板分离 自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。 5．2 复发酵试验 挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。5．3 凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，为大肠菌群阳性。记下证实实验的阳性管数，查最大可能数（MPN）检索表得出1000mL水样中总大肠菌群的MPN值。 总大肠菌群（MPN）检索表 二、大肠菌群膜法测定 1 定义 大肠菌群（coliform bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。 2 仪器 2．1 滤器 2．2 滤膜，孔径0．45μm。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。 2．3 抽滤设备 2．4 无齿镊子 2．5 其它仪器见《GB/T ××××－××公共场所茶具微生物检验方法，大肠菌群测定》中第3章。 3 培养基 3．1 品红亚硫酸钠培养基 3．1．1 成分：蛋白胨10g 酵母浸膏5g 牛肉膏5g 乳糖10g 琼脂10～20g 磷酸氢二钾3．5g
总大肠菌群数量测定
总大肠菌群 在饮用水的微生物安全监测中，普遍采用正常的肠道细菌作为粪便污染指标，而不是直接测定肠道致病菌。 总大肠菌群系指一群需氧及兼性厌氧的，在37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革氏阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群系指每升水样中所含有的总大肠菌群的数目。 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。 一多管发酵法 1应用范围 1.1本法适用于饮用水、水源水，特别是浑浊度含量高的水质中总大肠菌群的测定。 1.2水样中总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在。 2原理 根据总大肠菌群应具有的生物特性， 产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。 3仪器 3.1显微镜 3.2革兰氏染色用有关器材。 3.3高压蒸汽灭菌器。 3.4干热灭菌箱。 3.5恒温箱。
3.6冰箱。 3.7放大镜。 3.8试管、平皿（直径 4培养基 4.1乳糖蛋白胨培养液 4.1.1成分 蛋白胨10g 牛肉膏3g 乳糖5g 氯化钠5g 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 蒸馏水1000ml 4.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏、 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液， 灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.2三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液 按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。4.3品红亚硫酸钠培养基（供多管发酵法用）4.3.1成分 蛋白胨10g
乳糖10g 磷酸氢二钾3.5g 琼脂15~30g 蒸馏水1000ml 无水亚硫酸钠5g左右 5%碱性品红乙醇溶液 4.3.2储备培养基的制备如革兰氏阴性无芽胞杆菌， 9cm）、刻度吸管等，置于干热灭菌箱中 1ml 1000ml蒸馏水中加热溶解， 充分混匀，分装于装有倒管的试管中，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸160℃灭菌2h 调整pH为7.2~7.4，再加入1ml置高压蒸汽灭菌器中，以115℃乳糖及氯化钠置于 20ml 先将琼脂加至900蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾及蛋白胨，混匀使之溶解，再以蒸馏水补足至1000ml，调整PH值为7.2~7.4，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内，置高压蒸汽灭菌中以115℃灭菌20min，贮存于冷暗处备用。 4.3.3平皿培养基的配制 将上法制备的储备培养基加热融化，根据烧瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例吸取一定量的5%碱性品红乙醇溶液，置于灭菌空试管中。再按比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个灭菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解后，置于沸水浴中煮沸10min以灭菌。
大肠菌群检验操作规程
大肠菌群计数检验操作规程 一、目的 建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。 二、适用范围 适用于大肠菌群计数的检验操作。 三、职责 1.检验人员 严格按检验操作规程进行检验。 2.QC主管 监督检查执行情况。 四、程序 1.范围 本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定 2.术语和定义 2.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性 无芽胞杆菌。 3. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。 3.2冰箱：2℃～5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4天平：感量为0.1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。 3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸
头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11菌落计数器。 4.培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2 4.3磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.3。 4.4无菌生理盐水：见附录 A中 A.4。 4.5无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A中 A.5。 4.6无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.6。
5.检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN计数法检验程序 6.操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～ 7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl 调
colitag大肠菌群和埃氏大肠杆菌快速检测方法.
Colitag大肠菌群和埃氏大肠杆 菌快速检测方法 主要内容 ?基本概念 ? Colitag方法特点 ?基本介绍 ?检测过程 |?第三方认可
基本介绍 ?总大肠茵群醉底物法 在选择性培养基上能产生半乳辖并酶的细菌群落，请细茵群落能分解色廉底物释放色廉体使培养基呈现颜色査化，以此技术来检测水中总大肠茁影的方法称为总大肠茵群髓底场法 ?埃氏大肠杆茵酶底物法 在选择性培养基上能产生半乳罄昔酶，分解色孫底物，释放出色原体，从而使培菲基颜色发生变化.同时，酸酶分解产生荧光物质，便苗落能够在紫外光照射下产生特征桂荧光，以此技术检测埃氏大肠杆苗的方法称为埃氏大肠杆繭酶底物法. Coli tag方法特点 ?可以检测到受损大肠苗群和埃氏大肠杆菌。其它方法检测这些受损酋时常会遗漏. ?操作过趕简单.检测准确度高，假阳柱和假阴性是目前最低的. ?检测时间短于传统方法.
基本介绍 ?检测时何：24小时 *羹国国家环保蜀等权嵐机构测试站匙：佩阴柱lb假朋性小于 ?检测At生勒种矣：可同时栓测大厢荀祥和埃氏大麟轩罠感同时隆测龔丸騰杆36和疑氏丸肠打歲 ] ＜楼测结杲更迟方式；可绘测有#无，也可检剧瑕可能鈿苗数（MPN〕 ?检测所需配舍谊备：可调恒涅培拓箱（蛋少可必控制.禎口拓振氏度 ^44.5+0.2 ）T专刑玖管（鈕果只检测山有喷T则不宵要此 确）* M6nm UV灯（用366 nm匸￥灯照射观蔡灵龙｝? ?方法权威性：其吗国事环保局认可的标准快速检测方法：中圍国曩标准中規定的*＜屣*T法；日本、韩国*法国和名西等国家的国素折准* 拥有Fi：j（l refiusviuidim^if 41 - 檢测下喂；MFI /10（hnl.液俸 检测过程1.取一包检测试剂，与100 mL被测液体混合；2.摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在35摄氏度的环境下培养22-26小时。培养后的水样进行以下认定： A :如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在；B:如果用366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在。3.如果检测粪大肠菌，则先在35度环境下培养4小时后，改成44.5度培养20小时，进行以上第3项观测。A:如果水样呈黄色，说明有粪大肠菌存在；B:如果用366 nm UV 灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在 第三方认可（1）美国EPA认可：美国EPA目前已经认可10种用于检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌的方法，其中Co litag是美国EPA认可的检测数据最好的 一种。Colitag通过美国国家环保局严格的检测程序，结果表明：colitag检测大肠 菌群和大肠杆菌的假阴性为0%，假阳性小于5%。这个结果首先是由美国国家环保局的生物学家以正式信函的形式通知CPI公司。后来这一结果在2002年3月的 《联邦登记》（Federal Registe）上发表，具体请见67卷45期第10538页（Page 10538, Vol. 67 N O. 45）。同时，美国国家环保局对另一方法的检测报告显示，该法检
饮用水中大肠杆菌的检测方法
饮用水中大肠杆菌的检测方法 (一)水样的采集 供细菌学检验的水样，必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证再运送、贮存过程中不受污染。水样从采集到检验不应超过4h，在0～4℃下保存不应超过24h ，如不能在4h 内分析，应在检验报告上注明保存时间和条件。 1、自来水取样：应在水龙头打开放水5min，再用无菌容器接取水样，待分析。如水样内含有余氯，则采样瓶灭菌后按每500mL水样加3%Na2S2O3.5H2O溶液1mL。 2、江、河、湖、池自然水体取样：可用采样器，采样瓶应先灭菌。采样后，瓶内应留有空隙。如果与其他化验项目联合取样，细菌学分析水样应采在其他样品之前。 (二)初发酵试验 1.水样稀释：制备水样10-1、10-2的稀释液，方法为用无菌移液管吸取水样10mL放于盛有90mL无菌水和若干玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡使混合均匀，并使其中的细菌尽量呈单个存在，即为10-1稀释液;再从10-1制备10-2稀释液。以此类推，稀释到所需倍数。 2.接种和培养：以无菌操作于5支三倍浓缩培养基(接种前一定应先检查杜汉氏小管内有无气泡)中各加入水样10mL，5支普通培养基试管中加入水样1mL，5支普通培养基试管中加入10-1稀释液1mL，小心混匀放入37℃培养箱中培养24h 。此即5管法。 3.结果观察：37℃中培养24h后取出观察，观察有无气体(杜汉氏小管内有无气体)和酸产生(培养基有无变色)。在48h之间，培养管内倒置的杜汉氏小管内有任何量的气体积累，或培养基颜色从紫色变为黄色，便可初步断定为阳性反应。 若所测定的15支管中均为阳性反应，说明浓水样污染严重，可将样品进一步稀释后，再按上述方法接种、培养和观察。
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
大肠杆菌的检测(MPN计数法)
食品微生物检验技术课程综述大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号：114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟
大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂
2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。 2.81mol/L 盐酸（HCI ) ：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml。3检验程序 4.样品稀释
水中大肠杆菌的检测办法
附件水中大肠杆菌群检测方法－多管发酵法 NIEA E201.54B 一、方法概要 本方法系用以检测水中革兰氏染色阴性，不产生内生孢子之杆状好氧或兼性厌氧菌，且能在35 ± 1 ℃、48 ± 3小时发酵乳糖并产生酸及气体之大肠杆菌群（Coliform group）；在不同体积或不同稀释度之水样所产生之结果， 二、 三、 (一) (二) 四、 (一) (二) (三) (四) (五) (六) 锥形瓶：200至2000 mL之可灭菌硼硅玻璃制品。 (七) 采样容器：容量120 mL以上无菌之硼硅玻璃瓶或无菌塑料有盖容器，或市售无菌袋。 (八) 冰箱：温度能保持在4 ± 2℃者。 (九) 天平：待测物重量大于2 g时，须能精秤至0.01 g；待测物重量不大于2 g时，须能精秤至0.001 g。 (十) 培养箱：温度能保持在35 ± 1℃者。
(十一) 高压灭菌釜：温度能维持在121℃（压力约15 lb/in2或 1.1 Kg/cm2）灭菌15分钟以上者。 (十二) 高温干热烘箱：如用于玻璃器皿等用具之灭菌，温度须能保持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。 (十三) 接种环：为白金或镍铬合金制，适用于细菌接种或移植，亦可使用无菌塑料制品。 (十四) pH计：精确度达0.1 pH单位。 五、试剂 (一) 试剂水：蒸馏水或去离子水，导电度在25 ℃时小于2 μ mho / cm（μS / cm）。 (二) 5.0g 2.75g 2.75g 配成2倍浓度（取71.2 g LST培养基粉末溶于1 L试剂水），完全溶解后，分取10 mL注入装有倒置发酵管之试管内，经121℃灭菌15分钟，冷却后备用，灭菌后培养基之pH值应在 6.8 ± 0.2。灭菌后培养基若未当日使用，应保存在4 ± 2℃，保存期限为14天。可根据检验需求量，依配方配制培养基。 ２、煌绿乳糖胆汁培养基（Brilliant green lactose bile broth，简称BGLB） 1公升的BGLB 培养基中含有下列成份： 蛋白胨（Peptone）10.0g
大肠菌群检测方法
大肠菌检测方法 1.进入无菌室前应打开紫外线灯消毒时间为0.5-1小时。 2.关灯后0.5小时后方可进入。 3.进入更衣间更换衣服，佩带口罩、帽子、鞋套 实验步骤 1.进入无菌室后，先把酒精灯点燃，然后在用酒精棉进行手部消毒。（酒精棉是 用75%的酒精加入脱脂棉中制成） 2.准备双料管3根，单料管6根，培养皿7个。 3.直接从原液中吸取10ml放入双料管，（3根每根各10ml） 4.再吸取原液1ml放入单料管中（3根每根各1ml） 5.再吸取原液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 6.再吸取原液1ml放入盐水管中制成-1梯度的样液 7.更换一根吸管，从-1梯度的样液吸取1ml样液放入单料管中（3根每根各1ml） 8.再吸取-1梯度样液1ml放入培养皿中（2个培养皿各1ml） 9.再把每个培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀（注：另作3个培养皿：空气 空白，把培养皿打开10分钟倒入营养琼脂平铺底部摇匀。琼脂空白，把培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。盐水空白，吸1ml生理盐水放入培养皿中倒入营养琼脂平铺底部摇匀。） 10.把全部做好的放入培养箱中，温度36±1℃，大肠24小时±1小时，菌落48 小时±2小时（待培养皿中的琼脂凝固后翻转过来放入培养箱中） 11.梯度：-1梯度为1ml原液加入9ml生理盐水配成 -2梯度为1ml-1梯度样液加入9ml生理盐水配成 -3梯度-4梯度配制方法和-1、-2的配制方法一样 12.如果大肠初发酵产生气泡，用接种笔沾一个产气的液在伊红美兰平板上画之字形然后放入培养箱中36℃，24±2小时。（接种笔在每次使用前必须在酒精灯上消毒。所画之行不能划破伊红美兰琼脂表面） 13.取出后再用接种笔在伊红美兰平板之字形上挑菌，放入乳糖复发酵管中，然后再培养36±1℃，24±2小时。 14.再在伊红美兰平板之字形上挑菌，放到载玻片上作镜检。（方法见标准） 15.只有镜检成紫红色和乳糖复发酵管产气同时成立的情况下，才能断定这根管是不合格。 16.清洗消毒这根管前必须进行消毒霉菌，121℃，0.5小时同时不能放气。
大肠杆菌检测
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。1.2 冰箱:0～4℃。1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。1.4 天平。1.5 显微镜。1.6 均质器或乳钵。1.7 平皿:直径为90mm。1.8 试管。1.9 吸管。1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。1.13 酒精灯。1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。 3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置 36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。 3.3 分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36±1℃温箱内,培养 18-24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。 3.4 证实试验 在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36±1℃温箱内培养24±2h,观察产气情况。凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。 3.5 报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数,查MPN检索表,报告每100mL(g)大肠菌群的MPN值。
食品中大肠菌群的测定附mpn检索表)
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
大肠菌群的检测
我国的国家标准对绝大多数食品都制订了 菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了 详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安 全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度关注，菌落总 数的报告单位是cfu/g（ml），大肠菌群的报告单 位是mpn/100g（ml），那么cfu，mpn是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高 但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。 1菌落总数（cfu） 菌落总数是用来判定食品在被加工过程中 被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的 生产加工过程中，卫生质量的高低首先决定食 品原料的来源，原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料 来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生 要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的 优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的 繁殖动态，以便于对被检样品进行卫生评价时 提供科学依据。 菌落总数中的菌落英文意思是（colony），定 义为细菌和其他几种微生物在固体培养基上生 长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它 是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有 细菌集落之称。各种细菌的菌落各自具有一定 的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴 别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量（g），体积（ml）或表面积（clni）内所含能于某种固体培养基上在一定 条件下培养后所生成的细菌集落的总数。其培 养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸 取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基 混合后，每个细菌细胞都形成一个肉眼可见的 菌落的假设为基础的，由于检验中采用的是 37℃有氧条件下培养，因而并不能测出每克或 每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制， 因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育
colitag大肠菌群和埃氏大肠杆菌快速检测方法.
检测过程 1. 取一包检测试剂，与 100 mL 被测液体混合； 2. 摇匀混合，充分溶解，若要定量则转移溶液至定量盘，在 35 摄氏度的环境下培养 22-26 小时。培养后的水样进行以下认定： A：如果水样呈黄色，说明有大肠菌群存在； B：如果用 366 nm UV灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在。 3. 如果检测粪大肠菌，则先在 35 度环境下培养 4 小时后，改成 44.5 度培养 20小时，进行以上第 3项观测。 A：如果水样呈黄色，说明有粪大肠菌存在； B：如果用 366 nm UV 灯照射呈现明显蓝色荧光，说明埃氏大肠杆菌存在 第三方认可（1）美国 EPA认可：美国 EPA目前已经认可10种用于检测大肠菌群和埃氏大肠杆菌的方法，其中 Co litag 是美国 EPA 认可的检测数据最好的一种。 Colitag通过美国国家环保局严格的检测程序，结果表明：colitag检测大肠菌群和大肠杆菌的假阴性为0%，假阳性小于5%。这个结果首先是由美国国家环保局的生物学家以正式信函的形式通知CPI 公司。后来这一结果在2002年3月的《联邦登记》（Federal Register）上发表，具体请见67卷45期第10538页（Page 10538, Vol. 67 N O. 45）。同时，美国国家环保局对另一方法的检测报告显示，该
法检测大肠杆菌出现9%的假阴性，检测大肠菌群出现13%的假阳性，此结果发表于 1989 年 7 月 17 日的《联邦登记》（第 29998页，第二段，B部分第三行）和1992年6月10日的《联邦登记》（第 27475 页，第一列的第一整段）。（2）美国 Wisconsin 州卫生实验室验证：美国 Wisconsin 州卫生实验室通过大量不同实际样品对美国EPA认可的10种该类方法进行了检验，发现只有两种方法分析采样结果完全正确。Colitag是其中一种。
大肠杆菌的检测方法
大肠杆菌的检测方法 一、大肠杆菌的生物学特性 大肠杆菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约50%的菌株有周生鞭毛，但多数只有1-4根，一般不超过10根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。 二、培养特性： 大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为37℃，在42-44 ℃条件下仍能生长，生长温度范围15-46 ℃。 在普通营养琼脂上有3中菌落形态： 1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、 光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝； 3）黏液型：常为含有荚膜的菌株 三、大肠菌群及大肠杆菌测定——MPN法检验流程（FDA BAM）检样50g+450ml稀释液，适当十倍稀释样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），每管接种1mL，如没有产气，则报告为阴性；如有产气，
则分别接种BGLB肉汤管（35 ±℃，48 ± 2h）和EC肉汤（44.5±0.5 ℃（水浴培养）24 ± 2h ~48 ± 2h ），对于接种BGLB肉汤管的查MPN表报告结果，验证是否为大肠菌群；对于接种EC肉汤的产气管接种EMB平板（35℃、18~24h）从EMB平板上挑取5个可疑菌转接到PCA斜面，进行革兰氏染色、IMVC生化鉴定、接种LST复检产气查MPN表报告结果验证是否为大肠杆菌。
食品中大肠菌群检测方法的比较
食品中大肠菌群检测方法的比较 【摘要】随着近年来食品安全问题的突出，作为食品检测的重要检测对象，食品中大肠杆菌群检测也变得越来越重要。目前检测大肠杆菌群的方法随着技术进步也越来越多。本文比较了三中检测大肠杆菌群的方法，即发酵法、平板计数法、测试片法三种大肠杆菌群的检测方法，分析其优缺点，以便对大肠杆菌群的不同检测方法形成比较全面系统的认识，对以后的食品检测中检测大肠杆菌群有所帮助。 【关键词】大肠杆菌群；检测方法；比较 食品安全与人们的健康紧密相关，食品检测已经成为反映食品加工、运输、贮存等各个环节卫生和侵权状况的重要手段。大肠杆菌群作为食品、饮用水以及其他公共卫生的重点检验对象，其检测方法的有效性将大大提高食品检测的效率。随着近年来科学技术的进步，大肠杆菌群的检测方法也不断发展，各国建立了大肠杆菌群的标准检测方法和快速检测方法。但是不同方法其检测原理和检测手段的不同，都会影响检测的灵敏度、准确性和快速性。为此在本文中，我们比较了发酵法、平板计数法、测试片法三种大肠杆菌群的检测方法，分析其优缺点，以便对大肠杆菌群的不同检测方法形成比较全面系统的认识，对以后的食品检测中检测大肠杆菌群有所帮助。 1.发酵法 发酵法是检测食品中大肠杆菌群的一种比较传统的方法，这种技术已经得到世界各国的普遍认可。最具有代表性的是美国环保局（EPA）和法国标准化联合会（FSA）分别早在20世纪90年代就已批准在本国实施该技术，并为此制定了相应的判别标准[1]。 目前发酵法检测食品中大肠杆菌群主要采用的是国标GB4789.3-2010大肠菌群测定，是用月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）配置的肉汤管放在温度为（36±1）摄氏度的恒温培养箱中培养（24±2）小时，先观察倒管内是否有气泡产生，然后（24±2）小时后进行产气复发酵试验，如果未产气则需要继续培养（48±2）小时，产气者进行复发酵试验。在复发酵试验中，用接种环从产气的LST肉汤管中各取取培养物1环，移到含有煌绿乳糖胆盐（BGLB）的肉汤管中，放在（36±1）℃恒温培养箱中培养（48±2）h，观察产气的情况。产气的就计为大肠菌群阳性管。由于该方法操作繁锁，耗费较大的物力财力人力，所以不太适应大量检测工作的需求[2]。 2.平板计数法 大肠杆菌平板计数法检测分为两个阶段。在初培养中，选取2～3 个适宜的连续稀释度，每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿接种1mL。同时取1mL生理盐水加入另外的无菌平皿作阴性对照。迅速将15mL～20mL冷却至46℃的结晶
大肠菌群测定的操作细则
大肠菌群测定的操作细则 大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。 1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。 1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂 2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。 2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。 2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中 3.22规定。 2.6 生理盐水。 2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。 3 操作步骤 3.1 检样稀释 3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。 3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL 灭菌吸管。 3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。 3.2 乳糖发酵试验 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内,接种量在1mL以上者,用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1mL以下者,用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管,置36±1℃温箱内,培养24±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
大肠杆菌检验
第三章 大肠菌群测定 一、大肠菌群检验 (一)检验方法 (二)培养基 (三)检验时应注意事 二、大肠菌群的卫生学意义 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。 在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。 大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。 一、大肠茵群检验 (一)检验方法 1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。 2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。 3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色，同时