毛细管电泳出现问题分析
SSR标记荧光毛细管电泳在种子检测中常见问题分析
SSR标记荧光毛细管电泳在种子检测中常见问题分析李巧英（山西省种业发展中心，太原030006）摘要：SSR分子标记荧光毛细管电泳在农作物种子质量检测中常用于种子真实性检测、种子纯度鉴定和指纹数据库的构建。
试验过程中模板DNA浓度、特异峰型的统计分析以及仪器设备运行和维护、试验结果与指纹数据库的比对等关键环节都直接影响待测样品的结果判定。
就检测中遇到的问题进行分析，并提出相应的解决方法，以期为农作物种子质量检测荧光毛细管电泳技术平台提供参考。
关键词：SSR标记；荧光毛细管电泳；种子检测；问题；分析分子标记技术是近年来发展较快的基因检测技术，随着新标记方法的开发和试验技术的改进，在基因水平上检测农作物种子信息逐渐成为监控种子质量的一个重要手段。
由于分子标记法不受自然条件和表现性状的约束，实现了种子品种遗传信息室内快速检测，受到大家的青睐。
SSR作为第2代分子标记方法，是一种共显性标记，具有重复性好、等位变异多、数据分析简便、易操作等优点，在农作物种子质量检测中被广泛使用。
荧光毛细管电泳技术将荧光检测的高灵敏度和毛细管电泳的高效性结合，利用电泳和电渗流的电动力学原理，在毛细管中灌满胶分离PCR产物，检测荧光信号，数据软件分析系统将其转化成峰图，显示试验结果。
该技术自动化程度高，检测通量高，试验操作简单，数据统计程序化，避免人为估算的主观性，结果精确到1bp[1]，直接显示扩增产物片段的大小，实现了指纹图谱与碱基序列长短之间的对应转换，易于实验室间结果比对，常用GeneMapper 和GeneMarker分析SSR扩增片段[2]。
本文就试验中遇到的荧光信号强度、特异峰型的统计分析以及毛细管电泳仪运行和维护、试验结果与数据库比对等问题进行分析，为SSR分子标记荧光毛细管电泳检测农作物种子质量试验技术标准化提供参考。
拟，为所有专业方提供可控管、无破坏性、性价比高、低风险并允许反复运用的可行性方法。
BIM技术可以有效地提高施工技术水准，预防施工事故，减少施工成本浪费并缩短时程，强化施工过程中决策、控管能力。
毛细管电泳荧光检测中的异常电泳类型及原因分析
通讯 作者。ｉ ａ ＠２ ３ｎ ｔ ｊｕ ｎ ６ ． ｒ ｅ
摘
要
采用 毛 细管 电泳 荧光检 测 技 术进 行 玉米 Ｓ Ｒ标 记 的 片段 分析 。利 用 峰 型 、 Ｓ 峰面 积和 其 它荧 光 干扰
峰等 方 面 的特 征对 特异 峰和 非 特异 峰 进 行甄 别 。 分析 了特异 峰 的具 体 表现 类 型 及 原 因 ： Ｒ ． Ｓ ，
玉米标准 Ｄ Ａ指纹数据库的构建是一个 复杂 析 ， Ｆ Ｍ、 Ｎ 以 Ａ ⅥＣ、 Ｅ 和 Ｐ Ｔ４种 不 同颜 色 的荧 光 ＮＤ Ｅ
的系 统 工程 ， Ｐ Ｒ扩 增 产物 的分 析 方法 提 出 了更 染 料 标记 Ｓ Ｒ 引物 ， Ｉ 记 分 子量 内标 ， 不 同 荧 对 Ｃ Ｓ ＬＺ标 将
峰 、 续 多峰 、 峰和高 低 峰等 。 连 三 探讨 了片段扩 增 产物 大 小与异 常 峰型 的关 系 。 为保证 玉 米 品种 ＤＮ 指 纹库 Ａ
构建 的标 准化 ， 出了数据 统计 规 范化 的解 决方 案 。 提
关键 词 毛细 管 电泳， 荧光 检测 ， 米， Ｓ 玉 ＳＲ
Ａｎ ｌ ｓｓｏ ｅＡｂ ｏ ｍ ａ ｅ ｋ Ｔｙ ｅ ｐ ｌ ｒ ｅ ｔｏ ｈ ｒ ｓｓｗｉ ｌ — ａｙ ｉ ｆ ｈ ｎ ｒ ｌ ａ ｐ ｓｉ Ｃａ ｉ ａ ｙ Ｅｌｃｒ ｐ ｏ ｅ ｉ ｔ Ｆ ｕ ｔ Ｐ ｎ ｌ ｈ ｏ ｅ ｃ ｎ 一 ｂ ｌｄ ｒ ｓ ｅ ｔ１ ｅｅ ａ
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Ｃ ｒ ｓｏ ｄｎ ｕｈｒｊｕａ ＠２ ３ｎｔ ｏｒ ｐ ｎ ｉｇａｔｏ，ｉ ｎ ６ ． ｅ ｒ ｅ
毛细管电泳出现问题分析
一、无样品峰出现A、检查电流是否稳定：①没有电流。
可能原因——毛细管堵塞或断裂。
解决方法——用水冲洗毛细管，并观察是否有水流出，若无水流出请拆下卡盒检查毛细管两端和窗口是否断裂；毛细管没有断裂的话可以用水反向高压冲洗以试图解决此问题。
缓冲溶液需要过滤，将样品过滤或者离心去除其中的颗粒。
②电流波动很大，直至几乎消失。
可能原因——缓冲溶液中有气泡产生或者区带中样品析出。
解决方法——将缓冲溶液超声脱气，如果还有此现象发生，则可能是样品区带有析出，可以通过降低样品浓度/延长ramptime来试图解决这一问题；对于在缓冲溶液中溶解度不高的样品则需要在缓冲溶液中加入添加剂以解决此问题。
③电流初始值较小，后逐渐增大。
可能原因——样品进样量过大。
解决方法——减少进样量，通常进样参数设置在0.5psi,5sec 左右。
④电流正常。
可能原因：a样品浓度过低：使用高浓度样品测试，如果无法解决则有可能是以下其他原因。
b检测波长设置不正确：请确认被分析物的特征吸收，检查方法中的检测波长设置。
c分离极性错误：对于蛋白样品，请注意蛋白在分离条件下其PI及所带电荷；对于核酸样品，通常条件下会带负电荷。
d样品在毛细管内壁吸附：对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分离，或采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。
e光学检测器或光纤损坏：进行标准样品的测试，如果没有对应的结果出现，则有可能存在硬件问题，请联系工程师。
B、检查毛细管窗口，是否有透明窗口：可能原因——忘记开毛细管窗口或窗口位置不正。
解决方法——重新开毛细管检测窗口，或将窗口调整到正确位置。
二、样品峰出现拖尾可能原因——样品在毛细管内壁吸附。
解决方法——对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分离，或采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。
三、样品峰形不对称A、检查毛细管入口：可能原因——毛细管入口切口不平齐。
解决方法——重新切割毛细管入口，注意毛细管切割方法，不可以用力过猛或反复刮擦。
多重荧光PCR-毛细管电泳进行微卫星不稳定性分析中的常见问题
PCR
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扩增有效 种情况
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来茂 德 男 博 士 教 授 通 讯 作 者
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临 床 与 实验 病 理 学 杂 志
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扩 增 目标 位 点 无 荧 光 信 号
可 能 原 因及 解 决 方 案 ： ( 1 )
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3 收稿 1 期
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此 种情 况 表 现 为 G e n e
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基 金 项 目 ：浙 江 省 科 技 厅 国 际 合 作 项 目 ( 2 0 0 7 C2 4 0 0 9 ) 浙 江 省 科 技 厅 重 大 科技专 项 和 优先 主 题 项 目 ( 2 0 0 7 C 1 3 0 2 0 )
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微卫 星 不 稳定性 ( m
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电泳中断原因分析
电泳中断原因分析毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high perform ance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。
毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。
毛细管电泳技术的不断发展，毛细管电泳仪也越来越多的得到了大家的认同，但往往我们在试验的过程中经常会遇到一些问题，如样品的重现性，运行时的电流波动，阻碍电泳进一步发展的重要问题，及时的解决电泳的相关问题，对电泳的发展乃是分析化学的未来有这重要的现实意义。
毛细管电泳是在高压的作用下，以毛细管为分离通道，柱子中充满着缓冲溶液，毛细管两端浸泡在缓冲溶液的小瓶中，如图1所示，这样就构成了回流，对应的回流也就有了电流，但往往在试验的过成中电流并不像我们想的那样稳定，甚至有断流的现象，接下我们分析一下产生这种现象可能的原因。
图1 毛细管电泳仪示意图可能导致断流的原因：1、毛细管电泳柱子1.1柱子断裂毛细管柱子外壁涂有聚亚酰胺涂层，有很好的韧性，一段这层涂层脱落，毛细管柱子将失去原有的韧性，变得很脆，很容易折断。
取毛细管柱子时千万不要用利器划柱子，否则柱子很容易在划痕处断开。
毛细管柱子断裂后，缓冲溶液从断裂处流出色谱柱子，进而不能构成回路，从而导致电流迅速下降，致使电流中断，分离分析中断。
解决方法：更换柱子（平时更换柱子特别注意，不要用利器划到柱子）图2 断了柱子的毛细管电泳示意图1.2毛细管电泳柱子堵了常用的毛细管电泳柱子内径有50微米、75微米及100微米，内径很小，如果我们在试验的过场中不注意缓冲溶液及样品的纯度，或是使用了粘度很大的缓冲溶液，很容易堵死毛细管柱子，造成电流的中断。
图3柱子被堵后毛细管电泳示意图解决方法：压力反向冲洗柱子、样品及缓冲溶液使用前过滤2、气泡问题2.1缓冲溶液中的气泡我们在配置缓冲溶液时，所选用的水及在配置的过程中会使缓冲溶液溶解少量的气体，当这部分缓冲溶液进入到毛细管柱子内部时，两端加高压，运行一段时间会是缓冲溶液中的气体溢出，使柱子内产生气泡，从而使电流中断。
Sebia MINICAP毛细管电泳仪的常见故障及维护
盘 的 １号 位 必 须是 空 的 ． 转 盘 的 ２号 位 放 １ 不 带 条 形 码 在 个
的试 管 ： ３ 检 查 ＭＩ Ｉ Ａ （） Ｎ Ｃ Ｐ的 转 盘是 否正 确 放 置 了 。
２ 定 标 （ ） 择 ‘ ３ ａ ｌ ｕ ｅＳ ｎｏ ｌ ｒｔ ｎ’ １选 Ｃ ２ Ｓ ｍｐｅ Ｔ ｂ ｅ ｓ ｒＣａｉ ａｉ ： ｂ ｏ
・
２ ７４ ・
第 ２ 卷 第 ３期 ８ ２１ ０ ０年 ６月
实 验 与 检 验 医 学
ＥＸＰ ＲＩ ＮＴ ＡＮＤ Ｅ ＭＥ ＡＬ Ｌ ＯＲＡ ＡＢ Ｔ０Ｒ Ｙ ＭＥ Ｃ ＮＥ ＤＩ Ｉ
Ｖ １ ８Ｎ ． ｏ ． ｏ３ ２
Ｊｎ ２ １ ｕ．００
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实验室管・
ＳｂａＭＩ ＩＡ ｅｉ Ｎ Ｃ Ｐ毛细管 电泳仪的常见 故障及维 护
供参 考
１ ５ｌ 个 ｍ 的试 管 ．在 此 管 中放 １个 加 有 ｌ ｏ １ 馏 水 的 子 弹 ｏ￣ 蒸
头。 ２ 定标 （ ） 择 Ｃ ７ ‘ａ ｐｅ Ｐｏ ｅ Ｃ ｐ ｃｔ ｅ Ｄ ｔ ｔ ｎ １选 ２ Ｓ ｍ ｌ ｒｂ ａ ａ ｉ ｖ ｅ ｃ ｏ ｉ ｅｉ
Ｃ ｌ ｒｔ ｎ（ Ｃ ）；２ 检 查 并 选 上 ‘ａｔ１ ｙｌ’（ ） 查 并 ａ ｂａ ｏ Ｄ Ｎ ’（ ） ｉ ｉ ｓ ｒ ｃｅ ；３ 检 ｔ ｃ
１ 准备
（ ） 行 １ Ｃ ｐｃ ａ １运 次 ａ ｉ ｅ ｎ循 环 清 洗 取 样 针 ； ２ 进 入 ｌ （）
测 试 模 式 ， 择 ‘ ｅｔ ｙ ｌ ’ 口 ； ３ 在 转 盘 的 ２ 选 Ｔ ｓ Ｃ ｃｅ 窗 （） ８号 位 ， 上 放
白 电泳 该 仪 器设 计 理 念新 。 度 快 ， 果 精 确 ， 定 性 好 并 速 结 稳 且 维 护 简单 ． 一款 理 想 的 电泳 仪 。对 该 仪 器使 用 近 一 年 来 ． 是 总 体 运行 良好 ．然 而在 日常 工 作 中 也 出现 一些 报警 和 故 障 。 现 将 使 用 过程 中 出 现 的 故 障 和处 理 方法 及 经 验 介 绍 给 大 家 ．
影响毛细管电泳分析结果精密度的因素及其控制-中国现代应用药学
石英毛细管的清洗 毛细管首次使用或长时间不用后重新使用 应清洗毛细
管内壁表面并用稀碱液活化 因为迁移时间的精密度与分析 前或分析中毛细管内表面的预处理有关 ∀ 一般使用浓度为
∗ #
≈
的盐酸 !氢氧化钠溶液和高纯水按一定程序 因为酸液中的 对管壁上吸附的阳离子有很
冲洗即可
6 2
强的置换能力 碱液对去污及活化管壁作用显著 ∀ 石英毛细管的冲洗 石英毛细管内壁具有硅羟基 它是构成氢键吸附并使毛 细管内电解质产生电渗流的重要原因 ∀ 电泳分析过程中的 管壁吸附现象通常不可避免并具有很大的随机性 ∀ 当吸附 发生时 被吸附的分子影响毛细管的表面性质 使电渗流改 变 液流紊乱并影响到组分的峰形 出现谱带展宽 !响应及分 离度下降 !迁移时间改变等现象 ∀ 冲洗程序可以清除记忆效 应 使管壁状态复原 ∀ 具体的冲洗程序应根据实验情况灵活 设计 ∀ ∞ 等 ≈ 系统地研究了不同冲洗技术在多种离子 测定中对迁移时间和校正峰面积精密度的影响 结果表明 冲洗操作可稳定和改善迁移时间的重复性 ∀ 通过选择合适 的冲洗措施 毛细管内表面被恢复 吸附的溶质分子被消除 从而提高了迁移时间的重复性 ∀ 采用 氧化钠溶液 !
4 3
进样的影响
≤ ∞ 的进样方式有流体动力学进样和电迁移进样 前者
值可起到
是最常用的进样方法 它主要是压力进样 当用压力进样时 进样体积是样品缓冲液黏度 !所用压力及进样时间的函数 进样量与淌度无关 所用压力的变化通过调整进样时间自动 补偿 ∀ 文献 ≈ 给出了三种进样时间进样重复性的比较 结 果表明 进样 的重复性优于 及
的吸收低 ≈ 自身的淌度低 即分子大而荷电小 以减少电流 的产生 …为了达到有效的进样和合适的电泳淌度 缓冲液 的 位∀ 值至少必须比被分析物质的等电点高或低 个 单 只要条件允许就尽可能采用酸性缓冲液 因在低 缓冲体系 ∀ 的
毛细管电泳实验报告（含预习报告）
毛细管电泳实验报告（含预习报告）
系别____________ 学号 ________ 姓名 _________
组别 ____ 同组姓名 ___________________
实验日期年月日星期____ 得分____
1 实验目的
2 实验原理
3 预习报告
3.1请试回答以下问题
试列举影响电渗流(大小和/或方向)的几个主要因素：___________________；
决定离子电泳淌度的参数：，，。
3.2 查找下列物质的pKa值，并初步判断出峰顺序
苯甲醇：，苯甲酸：，水杨酸：，对氨基苯甲酸：
预测出峰顺序：
3.3进样前使用三种溶液对毛细管冲洗的目的分别是什么？
3.4 试列举毛细血管电泳的主要优势和劣势。
4 实验仪器及条件
仪器型号：
毛细管总长：毛细管有效长度：检测波长：
分析电压：进样压力：进样时间：
5 实验内容
6 数据处理
6.1 数据记录
6.2 各组分浓度计算(单点外标定量法)
计算公式：
6.3 各组分淌度计算
表观淌度计算公式：
有效淌度计算公式：
7 结论及讨论
（试讨论：1.判断在另外两种缓冲液下，各个峰的归属，并对各个组分迁移时间的变化做出合理分析和讨论;2. 判断哪个组分可以作为电渗流标记物，并试根据淌度结果说明之)
8 参考文献
（附：电泳谱图）。
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无样品峰出现
A、检查电流是否稳定：
①没有电流。
可能原因——毛细管堵塞或断裂。
解决方法——用水冲洗毛细管，并观察是否有水流出，若无水流出请拆下卡盒检查毛细管两端和窗口是否断裂；毛细管没有断裂的话可以用水反向高压冲洗以试图解决此问题。
缓冲溶液需要过滤，将样品过滤或者离心去除其中的颗粒。
②电流波动很大，直至几乎消失。
可能原因——缓冲溶液中有气泡产生或者区带中样品析出。
解决方法——将缓冲溶液超声脱气，如果还有此现象发生，则可能是样品区带有析出，可以通过降低样品浓度/ 延长ramp time 来试图解决这一问题；对于在缓冲溶液中溶解度不高的样品则需要在缓冲溶液中加入添加剂以解决此问题。
③电流初始值较小，后逐渐增大。
可能原因——样品进样量过大。
解决方法——减少进样量，通常进样参数设置在0.5psi,5sec 左右。
④电流正常。
可能原因：a 样品浓度过低：使用高浓度样品测试，如果无法解决则有可能是以下其他原因。
b 检测波长设置不正确：请确认被分析物的特征吸收，检查方法中的检测波长设置。
c 分离
极性错误：对于蛋白样品，请注意蛋白在分离条件下其PI及所带
电荷；对于核酸样品，通常条件下会带负电荷。
d样品在
毛细管内壁吸附：对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分
离，或采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。
e光学检测器或光纤损坏：进行标准样品的测试，如果没有对应的结果出现，则有可能存在硬件问题，请联系工程师。
B、检查毛细管窗口，是否有透明窗口：
可能原因一一忘记开毛细管窗口或窗口位置不正。
解决方法一一重新开毛细管检测窗口，或将窗口调整到正确位置。
二、样品峰出现拖尾
可能原因一一样品在毛细管内壁吸附。
解决方法一一对于蛋白及核酸样品应尽量采用涂层毛细管分离，或
采用极端pH条件或动态涂层防止样品吸附。
三、样品峰形不对称
A、检查毛细管入口：
可能原因一一毛细管入口切口不平齐。
解决方法一一重新切割毛细管入口，注意毛细管切割方法，不可以
用力过猛或反复刮擦。
B、检查更改样品溶剂：
可能原因——缓冲溶液与样品溶液电解率差别过大。
解决方法一一可采用缓冲溶液作为样品溶剂
四、样品峰过宽
降低样品进样量：
a有改善：可能原因一一样品浓度太大。
解决方法一一可降低样品浓度或减少进样量。
b无改善：可能原因一一样品本身性质不均一。
解决方法一一此原
因主要是针对蛋白样品，小分子样品发生的概率较低。
五、迁移时间不稳定
①出峰时间不稳定且无规律：可能原因一一缓冲溶液与毛细管内壁
平衡较慢。
解决方法一一每次样品运行之间避免用NaOH中洗毛细管。
②出峰时间依次后延：可能原因一一样品中有物质易发生吸附。
解决方法——首先在每次样品运行之前用0.1N NaOH短时间冲洗毛细管，看迁移时间能否重复，如果效果不佳请使用涂层毛细管来改善结果或者将样品再次处理，以去除样品中易吸附的组分。
六、峰形和出峰时间不稳定
更换缓冲溶液种类：
①峰形和时间稳定：可能原因一一缓冲溶液不稳定，易电解，或者是样品在原缓冲溶液条件下不稳定。
解决方法一一更换其它种类的缓冲溶液。
②峰形和出峰情况仍不稳定：可能原因一一样品中物质易在毛细管内壁吸附。
解决方法一一可采用涂层毛细管来克服此问题，或对样品进行前处理。
七、无法加气压
检查瓶塞是否盖紧或更换瓶塞。
①更换后问题解决。
可能原因a瓶塞老化，失去弹性。
解决方法一
—请购买新的瓶塞，并注意瓶塞不可烘干，只能自然晾干。
b瓶颈处有液体，导致瓶塞易滑。
解决方法——向瓶中装液体时不要过满，也不要沾湿瓶颈。
②若瓶塞无问题，可先采用真空方式，若真空方式可以使用，但压力仍不可用。
可能原因一一压力系统问题。
解决方法一一请联系工程师。
八、迁移时间可重复但峰面积重复性不好
重新切割毛细管两端。
①若问题解决。
可能原因一一毛细管入口处不平。
解决方法一一重新切割毛细管入口，注意毛细管切割方法，不可以用力过猛或反复
刮擦②问题依然存在，尝试电动进样。
可能原因——若电动进样可保持重现，则压力控制或气路存在问题。
解决方法——请联系工程师。
九、毛细管或电极易折断
①检查瓶盖是否老化。
可能原因——瓶盖老化。
解决方法——购买新的瓶盖。
②电极是否不垂直。
可能原因电极不垂直。
解决方法将电
极拉直。
十、谱图基线不稳定
①先用0.1N NaOH中洗毛细管，然后不进样运行原方法。
a 基线改善。
可能原因——则为样品中物质有吸附。
解决办法——重新预处理样品或更改电泳条件。
b基线未改善。
可能原因一一毛细管内有强烈吸附，或缓冲体系不稳定。
解决办法——更换新的毛细管，不进样，只运行缓中，观察基线情况。
②更换新毛细管后基线仍然不稳，可采用Run Buffer A测试。
a基线改善。
可能原因一一缓冲溶液与毛细管内壁平衡较慢。
解决办法——更换缓中溶液种类，若基线变化对检测无干扰，可保持原来电泳条件。
b 基线未改善。
可能原因——检测光源或其他光学器件不正常。
解
决办法请联系工程师。