底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响

底物浓度及抑制剂对酶促反应速度的影响

一、实验目的：

1、学习和掌握Km的测定原理和实验方法。

2、掌握竞争性抑制剂对酶活性的影响及竞争性抑制剂表观Km’的测定。

二、实验原理：

1.酶的底物浓度和酶促反应速度的关系一般情况下符合米-曼氏方程：

式中：v为反应初速度；Vmax为最大反应速度；[S]为底物浓度；Km为米氏常数，其单位为mmol/L。Km值是酶的特征性常数，一般来说，Km可以近似地表示酶与底物的亲和力。测定Km值是酶学研究中的一个重要方法。

Lineweaver-Burk作图法（双倒数作图法，图1）是用实验方法测定Km值的最常用的比较简单的方法。Lineweaver-Burk将米氏方程改写成双倒数形式：

1/ v = Km/ Vmax×1/[S] + 1/ Vmax

以1/v－1/[S]作图得一个斜率为Km/ Vmax的直线，将直线外推与横轴相交，其横轴截距为-1/Km ,纵轴截距为1/Vmax ，因此实验时，选择不同的[S]，测定相应的v，依L－B双倒数方程作图，即可求得Km 和Vmax；在抑制剂存在时，即可求得表观Km 和 Vmax，竞争性抑制的动力学特点见图2。

2.本实验以碱性磷酸酶（AKP）为例，磷酸苯二钠为底物，磷酸氢二钠为其竞争性抑制剂，茶碱为其非竞争性抑制剂。AKP催化磷酸苯二钠水解产生游离酚和磷酸盐。酚与酚试剂应用液在碱性溶液中生成蓝色的衍生物。根据蓝色的深浅可测出酚的含量，从而算出相应的酶促反应速度(v)。再根据Lineweaver—Burk法作图，计算其Km 值及抑制剂存在时表观Km

值的改变。

三、实验步骤：

1.米氏常数测定按下表操作：

2.抑制剂对酶促反应速度的影响按下表操作：

3.计算以1/A660－1/[S]作图，求出Km及表观Km。

四、结果与分析：

实验数据处理表格：

1.米氏常数Km测定

管号0 1 2 3 4 5

[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8

A6600.206 0.318 0.412 0.496 0.553

2.抑制剂存在时表观Km测定

管号0 1 2 3 4 5

[S](mmol/L) 2 2 3 4 6 8

A6600.170 0.185 0.275 0.376 0.389

作图：

计算：

1.Km计算：由直线方程y=7.0999x+0.9662知，当y=0时，x=-0.1361，即-1/Km=-0.1361，所以Km=7.35mmol/L，纵截距为0.9662

2.表观Km计算：由直线方程y=10.895x+0.9662知，当y=0时，x=-0.08868，即-1/Km=-0.08868，所以Km=11.28mmol/L，纵截距为0.9662

表观Km>Km,，且纵截距相等，所以抑制剂是竞争性抑制剂。

五、讨论

1.底物、蒸馏水和碱性缓冲液的加入顺序不作严格要求，对实验没有影响。

2.实验时用的大试管必须要干净、干燥，因为本实验反应体系试剂都是微量且为有关酶的实验，稍微多一点水都会对反应体系造成较大影响，导致实验中发生的不是梯度变化，最终影响实验结果。

3.第一步混匀37℃放置5分钟，起到预热的作用，使反应体系达到碱性磷酸酶反应的最适温度。

4.0号试管做空白对照管，不能加酶。

5.第二步混匀37℃放置15秒，是为使酶和底物充分反应，使底物充分转变为产物。

6.加入AKP后要立即准确计时，而且每管酶促时间一定要保持一致也是控制变量，防止时间不同造成反应产物含量不同。

7.第三步混匀37℃放置15分钟是为了使显色反应充分进行。

8.加入的酚试剂除了起显色作用还起到终止酶促反应的作用。

9.测得的显色物质的吸光度A660在酚试剂过量的情况下，与酚的浓度成正比。而酚作为第一步酶促反应的产物，其浓度在此酶促反应中又与反应速率成正比，所以A660可以代替速率v作图。

六、结论

通过双倒数作图法及分别计算无抑制剂与有抑制剂时酶的Km值，可发现，此抑制剂为竞争性抑制剂，并且两条直线的纵截距，可验证竞争性抑制剂的特征: Vm不变，Km变大。