药典-外源性DNA残留量测定法
《中国药典》2020年版(三部)生物技术产品增修订概况
中国药品标准ＤｒｕｇＳｔａｎｄａｒｄｓｏｆＣｈｉｎａ２０２１，２２（１） ·５ · 第一作者简介：赵雄，副研究员，研究方向：生物制品研发及质量控制。
Ｔｅｌ：０１０ ６７０７９５９８；Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｏｘｉｏｎｇ＠ｃｈｐ ｏｒｇ ｃｎ 通讯作者简介：郭中平，研究员，研究方向：生物制品。
Ｔｅｌ：０１０ ６７０７９５６１；Ｅ ｍａｉｌ：ｇｕｏｚｈｏｎｇｐｉｎｇ＠ｃｈｐ ｏｒｇ ｃｎ《中国药典》２０２０年版（三部）生物技术产品增修订概况赵雄，王晓娟，曹琰，郭中平（国家药典委员会，北京１０００６１）摘要：生物技术产业的快速发展推动了生物技术产品国家标准的不断提升。
本文介绍了《中国药典》２０２０年版（三部）生物技术产品及相关通用技术要求的增修订概况，阐释了增修订的考量和特点，旨在为正确理解和执行生物技术产品国家标准提供参考。
关键词：生物技术产品；国家标准；增修订中图分类号：Ｒ９２１ ２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－３６５６（２０２１）０１－０００５－０５ｄｏｉ：１０ １９７７８／ｊ ｃｈｐ ２０２１ ０１ ００１ＵｐｄａｔｅｓａｎｄＡｍｅｎｄｍｅｎｔｓｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｄｕｃｔｓｉｎｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２０２０（ＶｏｌｕｍｅⅢ）ＺＨＡＯＸｉｏｎｇ，ＷＡＮＧＸｉａｏｊｕａｎ，ＣＡＯＹａｎ，ＧＵＯＺｈｏｎｇｐｉｎｇ（ＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００６１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｒａｐｉｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎｄｕｓｔｒｙｈａｓｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｎａｔｉｏｎ ａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ ＴｈｅｕｐｄａｔｅｓａｎｄａｍｅｎｄｍｅｎｔｓｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｇｅｎｅｒａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅＣｈｉｎｅｓｅＰｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ２０２０（ＶｏｌｕｍｅⅢ）ａｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓａｎｄｃｈａｒａｃ ｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｔｈｅｒｅｖｉｓｉｏｎｓａｒｅｅｘｐｌａｉｎｅｄ Ｔｈａｔａｉｍｓｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｔｈｅａｃｃｕｒａｔｅｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇａｎｄｉｍｐｌｅ ｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ；ｎａｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓ；ｕｐｄａｔｅｓａｎｄａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ 生物技术产品是指采用生物技术制备的、临床上用于疾病治疗的大分子生物制品［１］。
《中国药典》2020版—通则 3407 外源性 DNA 残留量测定法第三法公示稿
通则3407 外源性DNA 残留量测定法第三法公示稿定量PCR 法PCR 反应过程中可通过荧光标记的特异性探针或荧光染料掺入而检测PCR产物量，通过连续监测反应体系中荧光数值的变化，可即时反映特异性扩增产物量的变化。
在反应过程中所释放的荧光强度达到预设的阈值时，体系的PCR 循环数(Ct 值)与该体系所含的起始DNA 模板量的对数值呈线性关系。
采用已知浓度的DNA 标准品，依据以上关系，构建标准曲线，对特定模板进行定量分析，测定供试品中的外源DNA 残留量。
试剂（1）PCR 反应预混液（2×) 含MgCl2、扩增酶、dNTPs 等，按试剂使用说明书要求配制，或符合条件的其它配方预混液。
（2）TE 缓冲液（pH 8.0）同方法一。
（3）荧光标记探针用TE 缓冲液稀释至100μmol/L，-20℃保存。
（4）正向和反向序列检测引物用TE 缓冲液稀释至100μmol/L，-20℃保存。
（5）碘化钠溶液（6mol/L 碘化钠，15 mmol/L EDTA，0.5%月桂酰肌氨酸钠，25mmol/L Tris-HCl pH 8.0 以及35µg/ml 糖原）：配制100ml 碘化钠溶液，先取干净的烧杯置于磁力搅拌器上，依次加入以下成分，同时用搅拌子不断搅拌混匀：50ml 的无核酸酶水，3.0 ml 的0.5 mol/L EDTA 溶液，2.5ml 的1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，缓慢加入89.93g 的碘化钠，加入适量的无核酸酶水至100 ml（可根据需要等比增加或减少）。
用0.2 微米孔径的尼龙膜过滤溶液。
避光4℃储藏。
（6）2%蛋白酶K 溶液同方法一。
（7）蛋白酶K 缓冲液（10×），同方法一但不加氯化钠，或按蛋白酶K 试剂说明书要求配制。
（8）推荐的检测探针及引物CHO 细胞探针: 5ˊFAM-ACTCGCTCTGGAGACCAGGCTGGC-TAMRA3ˊ正向引物: 5ˊ-TGTGTAGCTTTGGAGCCTATCCT-3ˊ反向引物: 5ˊ-CAGCACTCGGGAGGCAGA-3ˊ大肠杆菌。
外源性DNA残留量测定法
溶 解 ，室 温 放 置 2 4 小 时 ，裂 解 物 加 水 1 80 4 ，再 冷 冻 干
燥 。冻 干 的 裂 解 物 用 水 复 溶 至 适 当 浓 度 。照 SDS- 聚丙烯
酰 胺 凝 胶 电 泳 法 （通 则 0541第 五 法） （胶 浓 度 20% ) 进行
电 泳 ，用 银 染 法 染 色 。
将待提取的细胞基质悬液的细胞浓度调整为每lml约 含 107 个 细 胞 ，如 果 为 细 菌 ，则 将 其 浓 度 调 整 为 每 l m l 约 含 108 个 细 菌 。量 取 悬 液 lml，离 心 ，在 沉 淀 中 加 裂 解 液 400^1混 匀 ，37°C作 用 12〜2 4 小 时 后 ，加人饱和苯酚溶液 450^1,剧 烈 振 摇 混 匀 ，以 每 分 钟 10 0 0 0 转 离 心 1 0 分 钟 ， 转 移 上 层 液 体 ，以 饱 和 苯 酚 溶 液 450M1 重 复 抽 提 1 次 ；转 移 上 层 液 体 ，加 人 三 氯 甲 烷 450^1，剧 烈 振 摇 混 匀 ，以每
中 国 药 典 2015年版
以 每 分 钟 15 0 0 0 转 离 心 1 5 分 钟 ；用 适 量 一20eC 7 0 % 乙醇 溶 液 洗 涤 沉 淀 1 次 ，以 每 分 钟 15 0 0 0 转 离 心 1 5 分 钟 ，弃 上 清 液 ，保 留 沉 淀 ，吹 至 干 燥 后 ，加 适 量 灭 菌 T E 缓冲液 溶 解 ，R N a s e 酶 切 ，苯 酚 -三 氯 甲 烷 抽 提 ，分 子 筛 纯 化 D N A , 即得。
(12) D N A 稀 释 液 取 1 % 鱼 精 D N A 溶 液 50^1，加 T E 缓 冲 液 至 10ml。
用于探针标记和阳性对照的D N A 制 备 用于探针标 记 和 阳 性 对 照 的 D N A ，由生 产供 试 品 用 的 传 代 细 胞 、工
外源性DNA残留检测原理及过程
DNA变性过程
理论详解
变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可 以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过 程称为复性（renaturation）。通常DNA热变 性后，将温度缓慢冷却，并维持在比Tm低 25～30℃左右时，变性后的单链DNA即可恢 复双螺旋结构，因此，这一过程又叫做退火。 复性后的DNA，理化性质都能得到恢复。倘若 DNA热变后快速冷却，则不能复性
变性； 3 .将变性的DNA探针加入预热的杂交缓冲液 DIG Easy Hyb (约
需3.5 mL/100 cm2 膜面积) ，充分混匀。 4 .点样膜经预杂交后，丢弃预杂交溶液，代之以探针/杂交混合
物。 5 .置40℃ 温育16 小时以上。 6. 使用过的DNA探针杂交缓冲液 DIG Easy Hyb可以保存在-
Conjugate）4μL浸泡30min。 4. 用100ml洗涤缓冲液洗涤15分钟，共两次。 5. 用20ml检测缓冲液平衡2min，加入临用新制的显色液（200μL的kit 5
（NBT/BCIP） 到10ml检测缓冲液）在暗处反应，注意不要振摇。 6 .斑点出现后，用10mL TE缓冲液洗涤，终止反应。
– 数据分析及结果判定
7. 阳性对照梯度是否清晰可见，而且所生色斑深浅应具有色差梯度。 8.样品色斑与阳性对照色斑比较，确定样品DNA量的范围。 9. 报告结果，抗体原液呈现的斑点颜色应浅于阳性对照100pg点斑点颜
色。
图例（未酶切）
酶切后
结束
谢谢
实际的计算量。DNA标准阳性对照范围从 100 ng 至 10 pg /点。 5.阳性对照梯度点为一排，供试品、阴性对照另点一排；点样完
毕后，再用TE缓冲液冲洗一次，取出杂交膜用铅笔做好标记。 6.膜放到紫外灯下，紫外交联1个小时，然后将膜放入烤箱80℃
门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光法检测
门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光法检测目的建立门冬胰岛素外源性DNA残留量的荧光检测方法，用于门冬胰岛素的质量控制。
方法参照《中国药典》三部附录及相关资料方法，对门冬胰岛素外源性DNA残留的荧光检测法进行研究，确定检测方法的最适条件，并对方法的线性、加样回收率、精密度、耐用性、重复性等方面进行方法学验证。
结果建立了门冬胰岛素原料药中外源性DNA残留量的荧光检测方法，并进行了方法学验证。
结论该方法操作简便、准确快捷，且无需标准宿主DNA，可用于门冬胰岛素质量标准中外源性DNA残留量的检测方法。
[Abstract] Objective To develop a fluorescence method of determining residual DNA in recombinant Insulin Aspart for its quality control. Methods According to CP (2010 edition) and relative methods, fluorescence method was researched .The method validation was studied from standard curve,recovery,precision,reproducibility etc. Results Fluorescence method of determining residual DNA was developed and the method was valided. Conclusion This method is convenient,fast and good reproducibility, it can be used determination of residual DNA in recombinant insulin aspart .[Key words] Fluorescence method;Residual exogenous DNA;Insulin aspart;Quality control门冬胰岛素是一种新型的人胰岛素改构产物，通过基因工程重组技术、利用大肠杆菌或酵母表达得到的一种重组蛋白类药物。
大肠杆菌表达的重组蛋白外源性E.coli宿主残留DNA检测方法研究
大肠杆菌表达的重组蛋白外源性E.coli 宿主残留DNA检测方法研究摘要：目的：建立大肠杆菌表达的重组蛋白外源性E.coli宿主残留DNA的检测方法用于生产过程以及最终产品的质量控制。
方法：参考试剂盒相关说明书，样品加标回收了率无法达到2020版中国药典（Ch.P）第四部3407章节和美国药典(USP)1130章节的要求，通过对药物浓度、处理温度、糖原的蛋白酶K的使用量以及不同的加标量的优化，即将样品稀释10倍后，加30pg的E.coli标准品，20μl的蛋白酶K消化1h,选择15μl PCR反应体系。
结果：回收率满足在50%~150%之间。
结论：借助商品化的试剂盒，优化的外源性DNA提取条件满足法规要求、操作简便，非常适用于大肠杆菌表达的重组蛋白生产过程以及最终产品的外源性残留DNA的检测。
关键词：大肠杆菌表达的重组蛋白大肠杆菌外源性DNA背景介绍：本文所述大肠杆菌表达的重组蛋白的的制备工艺是通过质粒重组、转染、大肠杆菌发酵并纯化得到；根据CDE 2003年3月20日颁布的《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》最终产品控制这部分的内容，外源性残留DNA属于工艺相关杂质，存在潜在的传染性、免疫原性、致癌性以及影响正常基因的激活和抑制。
EMA[1]对外源性DNA残留也做出了相应规定，指出外源DNA残留量是纯化工艺验证的重要指标。
WHO[2]规定非口服的生物制品DNA残留量为10ng每人份剂量，并规定了外源性残留DNA的片段大小一般要小于200bp。
我国在2020年9月发布《基因治疗产品药学研究与评价技术指导原则》的征求意见稿也对外源性DNA残留量做出了建议，一般要求控制在10ng/剂以内,片段大小控制在200bp以内，FDA[3]要求生物制品每剂量外源性DNA残留量小于100pg，大剂量放宽至10ng每人份剂量。
综合法规及指导原则要求，我们的产品的残留DNA的接受标准定为10ng/剂，选择相较于DNA探针杂交法和荧光染色法更快捷、灵敏、准确的qPCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）法作为研究目标，通过对残留DNA提取效率和检测灵敏度的优化以适应各国法规要求来保障产品的质量。
2015版《中国药典》关于《通则和指导原则》第四部(1)
2015版《中国药典》关于《通则和指导原则》的内容（以下红色标记的内容更需要关注）序号编码目录10100 制剂通则2 0101 片剂3 0102 注射剂4 0103 胶囊剂5 0104 颗粒剂6 0105 眼用制剂7 0106 鼻用制剂8 0107 栓剂9 0108 丸剂10 0109 软膏剂乳膏剂11 0110 糊剂12 0111 吸入制剂13 0112 喷雾剂14 0113 气雾剂15 0114 凝胶剂16 0115 散剂17 0116 糖浆剂18 0117 搽剂19 0118 涂剂20 0119 涂膜剂21 0120 酊剂22 0121 贴剂23 0122 贴膏剂24 0123 口服溶液剂口服混悬剂口服乳剂25 0124 植入剂26 0125 膜剂27 0126 耳用制剂28 0127 洗剂29 0128 冲洗剂30 0129 灌肠剂31 0181 合剂32 0182 锭剂33 0183 煎膏剂（膏滋）34 0184 胶剂35 0185 酒剂36 0186 膏药37 0187 露剂38 0188 茶剂39 0189 流浸膏剂与浸膏剂400200 其他通则41 0211 药材和饮片取样法42 0212 药材和饮片检定通则43 0213 炮制通则44 0251 药用辅料45 0261 制药用水46 0291 国家药品标准物质通则47030048 0301 一般鉴别试验49 0400 光谱法50 0401 紫外-可见分光光度法51 0402 红外分光光度法52 0405 荧光分光光度法53 0406 原子吸收分光光度法54 0407 火焰光度法55 0411 电感耦合等离子体原子发射光谱法56 0412 电感耦合等离子体质谱法57 0421 拉曼光谱法58 0431 质谱法59 0441 核磁共振波谱法60 0451 X射线衍射法610500 色谱法62 0501 纸色谱法63 0502 薄层色谱法64 0511 柱色谱法65 0512 高效液相色谱法66 0513 离子色谱法67 0514 分子排阻色谱法68 0521 气相色谱法69 0531 超临界流体色谱法70 0532 临界点色谱法71 0541 电泳法72 0542 毛细管电泳法730600 物理常数测定法74 0601 相对密度测定法75 0611 馏程测定法76 0612 熔点测定法77 0613 凝点测定法78 0621 旋光度测定法79 0622 折光率测定法80 0631 pH值测定法81 0632 渗透压摩尔浓度测定法82 0633 黏度测定法83 0661 热分析法84 0681 制药用水电导率测定法85 0682 制药用水中总有机碳测定法860700 其他测定法87 0701 电位滴定法与永停滴定法88 0702 非水溶液滴定法89 0703 氧瓶燃烧法90 0704 氮测定法91 0711 乙醇量测定法92 0712 甲氧基、乙氧基与羟丙氧基测定法93 0713 脂肪与脂肪油测定法94 0721 维生素A测定法95 0722 维生素D测定法96 0731 蛋白质含量测定法970800 限量检查法98 0801 氯化物检查法99 0802 硫酸盐检查法100 0803 硫化物检查法101 0804 硒检查法102 0805 氟检查法103 0806 氰化物检查法104 0807 铁盐检查法105 0808 铵盐检查法106 0821 重金属检查法107 0822 砷盐检查法108 0831 干燥失重测定法109 0832 水分测定法110 0841 炽灼残渣检查法111 0842 易炭化物检查法112 0861 残留溶剂测定法113 0871 甲醇量检查法114 0872 合成多肽中的醋酸测定法115 0873 2-乙基己酸测定法1160900 特性检查法117 0901 溶液颜色检查法118 0902 澄清度检查法119 0903 不溶性微粒检查法120 0904 可见异物检查法121 0921 崩解时限检查法122 0922 融变时限检查法123 0923 片剂脆碎度检查法124 0931 溶出度与释放度测定法125 0941 含量均匀度检查法126 0942 最低装量检查法127 0951 吸入制剂微细粒子空气动力学特性测定法128 0952 黏附力测定法129 0981 结晶性检查法130 0982粒度和粒度分布测定法131 0983 锥入度测定法132 1100 生物检查法133 1101 无菌检查法134 1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法135 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法136 1107 非无菌药品微生物限度标准137 1121 抑菌效力检查法138 1141 异常毒性检查法139 1142 热原检查法140 1143 细菌内毒素检查法141 1144 升压物质检查法142 1145 降压物质检查法143 1146 组胺类物质检查法144 1147 过敏反应检查法145 1148 溶血与凝聚检查法1461200 生物活性测定法147 1201 抗生素微生物检定法148 1202 青霉素酶及其活力测定法149 1205 升压素生物测定法150 1206 细胞色素C活力测定法151 1207 玻璃酸酶测定法152 1208 肝素生物测定法153 1209 绒促性素生物测定法154 1210 缩宫素生物测定法155 1211 胰岛素生物测定法156 1212 精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用测定法157 1213 硫酸鱼精蛋白生物测定法158 1214 洋地黄生物测定法159 1215 葡萄糖酸锑钠毒力检查法160 1216 卵泡刺激素生物测定法161 1217 黄体生成素生物测定法162 1218 降钙素生物测定法163 1219 生长激素生物测定法164 1401 放射性药品检定法165 1421 灭菌法166 1431 生物检定统计法1672000 中药其他方法168 2001 显微鉴别法169 2101 膨胀度测定法170 2102 膏药软化点测定法171 2201 浸出物测定法172 2202 鞣质含量测定法173 2203 桉油精含量测定法174 2204 挥发油测定法175 2301 杂质检查法176 2302 灰分测定法177 2303 酸败度测定法178 2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法179 2322 汞和砷元素形态及其价态测定法180 2331 二氧化硫残留量测定法181 2341 农药残留量测定法182 2351 黄曲霉毒素测定法183 2400 注射剂有关物质检查法1843000 生物制品相关检查方法1853100 含量测定法186 3101 固体总量测定法187 3102 唾液酸测定法（间苯二酚显色法）188 3103 磷测定法189 3104 硫酸铵测定法190 3105 亚硫酸氢钠测定法191 3106 氢氧化铝（或磷酸铝）测定法192 3107 氯化钠测定法193 3108 枸橼酸离子测定法194 3109 钾离子测定法195 3110 钠离子测定法196 3111 辛酸钠测定法197 3112 乙酰色氨酸测定法198 3113 苯酚测定法199 3114 间甲酚测定法200 3115 硫柳汞测定法201 3116 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯含量测定法202 3117 O-乙酰基测定法203 3118 己二酰肼含量测定法204 3119 高分子结合物含量测定法205 3120 人血液制品中糖及糖醇测定法206 3121 人血白蛋白多聚体测定法207 3122 人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法208 3123 人免疫球蛋白中甘氨酸含量测定法209 3124 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法210 3125 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法211 3126 IgG含量测定法212 3127 单抗分子大小变异体测定法（CE-SDS）2133200 化学残留物测定法214 3201 乙醇残留量测定法215 3202 聚乙二醇残留量测定法216 3203 聚山梨酯80残留量测定法217 3204 戊二醛残留量测定法218 3205 磷酸三丁酯残留量测定法219 3206 碳二亚胺残留量测定法220 3207游离甲醛测定法221 3208 人血白蛋白铝残留量测定法222 3209 羟胺残留量测定法2233300 微生物检查法224 3301 支原体检查法225 3302 外源病毒因子检查法226 3303 鼠源性病毒检查法227 3304 SV40核酸序列检查法228 3305 猴体神经毒力试验229 3306 血液制品生产用人血浆病毒核酸检测技术要求2303400 生物测定法231 3401 免疫印迹法232 3402 免疫斑点法233 3403 免疫双扩散法234 3404 免疫电泳法235 3405 肽图检查法236 3406 质粒丢失率检查法237 3407 外源性DNA残留量测定法238 3408 抗生素残留量检查法（培养法）239 3409 激肽释放酶原激活剂测定法240 3410 抗补体活性测定法241 3411 牛血清白蛋白残留量测定法242 3412 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法243 3413 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法244 3414 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法245 3415 类A血型物质测定法246 3416 鼠IgG残留量测定法247 3417 无细胞百日咳疫苗鉴别试验（酶联免疫法）248 3418 抗毒素、抗血清制品鉴别试验（酶联免疫法）249 3419 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法250 3420 伤寒Vi多糖分子大小测定法251 3421 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法252 3422 人凝血酶活性检查法253 3423 活化的凝血因子活性检查法254 3424 肝素含量测定法255 3425 抗A、抗B血凝素测定法256 3426 人红细胞抗体测定法257 3427 人血小板抗体测定法258 3500 生物活性/效价测定法259 3501 重组乙型肝炎疫苗（酵母）体外相对效力检查法260 3502 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法261 3503 人用狂犬病疫苗效价测定法262 3504 吸附破伤风疫苗效价测定法263 3505 吸附白喉疫苗效价测定法264 3506 类毒素絮状单位测定法265 3507 白喉抗毒素效价测定法266 3508 破伤风抗毒素效价测定法267 3509 气性坏疽抗毒素效价测定法268 3510 肉毒抗毒素效价测定法269 3511 抗蛇毒血清效价测定法270 3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法271 3513 人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法272 3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法273 3515 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法（E玫瑰花环形成抑制试验）274 3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法（淋巴细胞毒试验）275 3517 人凝血因子Ⅱ效价测定法276 3518 人凝血因子Ⅶ效价测定法277 3519 人凝血因子Ⅸ效价测定法278 3520 人凝血因子Ⅹ效价测定法279 3521 人凝血因子Ⅷ效价测定法280 3522 重组人促红素体内生物学活性测定法281 3523 干扰素生物学活性测定法282 3524 重组人白介素-2生物学活性测定法283 3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法284 3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法285 3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法286 3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法287 3529 重组链激酶生物学活性测定法288 3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法289 3531 尼妥珠单抗注射液生物学活性测定法290 3532 重组人白介素-11生物学活性测定法291 3533 注射用A型肉毒毒素成品效价测定法（平行线法）2923600 特定生物原材料/动物293 3601 无特定病原体鸡胚质量检测要求294 3602 实验动物微生物学检测要求295 3603 实验动物寄生虫学检测要求296 3604 新生牛血清检测要求297 3605 细菌生化反应培养基2983700299 3701 生物制品国家标准物质目录3008000 试剂与标准物质301 8001 试药302 8002 试液303 8003 试纸304 8004 缓冲液305 8005 指示剂与指示液306 8006 滴定液307 8061 对照品对照药材对照提取物308 8062 对照品标准品3099000 指导原则310 9001 原料药物与制剂稳定性试验指导原则311 9011 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则312 9012 生物样品定量分析方法验证指导原则313 9013 缓释、控释和迟释制剂指导原则314 9014 微粒制剂指导原则315 9015 药品晶型研究及晶型质量控制指导原则316 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则317 9102 药品杂质分析指导原则318 9103 药物引湿性试验指导原则319 9104 近红外分光光度法指导原则320 9105 中药生物活性测定指导原则321 9106 基于基因芯片的药物评价技术与方法指导原则322 9107 中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则323 9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则324 9202 非无菌产品微生物限度检查指导原则325 9203药品微生物实验室质量管理指导原则326 9204 微生物鉴定指导原则327 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则328 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则329 9301注射剂安全性检查法应用指导原则330 9302 中药有害残留物限量制定指导原则331 9303 色素测定法指导原则332 9304 中药中铝、铬、铁、钡元素测定指导原则333 9305 中药中真菌毒素测定指导原则334 9501 正电子类放射性药品质量控制指导原则335 9502 锝［99mTc］放射性药品质量控制指导原则336 9601 药用辅料功能性指标研究指导原则337 9621 药包材通用要求指导原则338 9622 药用玻璃材料和容器指导原则339 9901 国家药品标准物质制备指导原则。
【最新精选】外源性DNA残留量测
外源性DNA残留量检测1.目的描述外源性DNA残余量检定（地高辛法）的操作过程和注意事项。
2.材料及设备2.1试剂试液无水乙醇。
Tris饱和酚。
三氯甲烷。
异戊醇。
吐温20。
20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，用盐酸调pH至7.2。
0.2mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）。
3mol/L醋酸钠溶液。
20×SSC溶液：0.3mol/L柠檬酸钠,3mol/L NaCl,调pH至7.0。
Buffer I (0. lmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCI，用固体NaOH调pH7. 5)。
Buffer Ⅲ (100mmo1/L Tris-HCl 100mmo1/L NaCI, 50mmo1/LMgCl2，pH9. 5)。
TE缓冲液（pH8.0)：量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml,0.5mol/L EDTA溶液（pH8.0）2ml, 加灭菌水至1000ml。
ECORI内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）BamHI内切酶（宝生物工程（大连）有限公司）2.2材料和用具细菌基因组DNA提取试剂盒（天根生物）批号H6611琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物）批号I7908外源DNA残留量检测试剂盒（Roche）货号：11745832910和1109365791尼龙膜（PALL 0.45微米）点样器（Bio-RAD;Model No:Bio-Dot SF Cell;Serial No:160BR07680）、移液器、tip 头、恒温水浴锅、超净工作台、冰盒、离心机、三维旋混仪、电磁炉3.操作原理用随机启动法，将地高辛甙元标记的脱氧尿苷三磷酸掺入未标记DNA，通过一个手臂将dUTP与载体半抗原地高辛甙元连接起来（dig-dUTP）。
与目的DNA杂交后，杂交分子用酶联免疫法检测；应用抗体－酶联接物（抗地高辛甙元－碱性磷酸酶复合物）和随后用酶促颜色反应使5－溴－4－氯－3－吲哚磷酸（BCIP）和氮蓝四唑（NBT）显色。
外源性dna残留量测定法
外源性DNA残留量测定法第一法 DNA探针杂交法供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。
将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA的含量。
试剂（1）DNA标记和检测试剂盒（2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜。
（3）2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水10ml中，分装后储藏于-20℃备用。
（4）3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水10ml中。
（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用盐酸调pH值至8.0。
（6）5.0mol/L氯化钠溶液（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）用10mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 至8.0。
（8）20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液用盐酸调pH至7.2。
（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0），5mol/L 氯化钠溶液2.0ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0）2.0ml，20%SDS溶液2.5 ml，加灭菌水至10ml。
（10）TE缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液（pH8.0）10ml，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2ml，加灭菌水至1000ml。
（11）1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。
（12）DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50μl，加TE缓冲液至10ml。
用于探针标记和阳性对照的DNA制备用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考下述推荐方案进行，具体方法可参考《分子克隆实验指南》（［美］J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（［美］F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。
生物制品中外源DNA残留
生物制品中外源DNA残留外源DNA为残留宿主细胞的DNA片段。
这些残留DNA可能带来传染性或致瘤性风险，比如残留DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因。
由于微生物来源的基因组DNA 富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险。
方法：1.首先要确认检测方法能适用于DNA残留量的测定。
药典方法有DNA探针杂交法、荧光染色法、定量PCR法。
并且需要用已上市的药物进行对照，来排除本身药物对这个方法的影响。
有必要时可用三种方法进行检测，来确认方法的可行性。
2.确认蛋白质对检测方法没有影响，可以通过蛋白酶K进行水解，再进行DNA残留量检测，蛋白酶K水解前后，DNA残留量应该不变或者变化很少，并且需要判断蛋白酶K的加入对检测方法有没有影响。
或者用核酸酶进行水解残留的DNA，此时DNA残留量应该检测不出来的，并且需要判断核酸酶的加入对检测方法有没有影响。
若有影响可以通过碘化钠沉淀或者其他商业的方法（质粒提取试剂盒或者胶回收试剂盒等等）进行除去蛋白质来纯化或者富集DNA，来进行检测DNA含量。
3.DNA的等电点较低，约在2~4左右，带有大量的负电荷，可以用阴离子填料Q、DEAE、adhere等进行层析，因为具有蛋白纯化作用，并且载量高，可以通过控制上样条件、洗脱条件进行层析，但是DNA含量很难达到pg级别。
还有膜层析，是上面带有阴离子配基，具有吸附带负电荷的物质，但载量较小，可以在最后用于蛋白质过滤来达到DNA除去效果和澄清除菌的效果。
4.阴离子聚合物进行吸附，可能会吸附目的蛋白，这时候要进行计算目的蛋白回收率。
阴离子聚合物有聚乙烯亚胺、聚丙烯酰胺等，要考虑一下有无细胞毒性，残留量的问题。
优点是价格比较便宜，可以用于前期处理，有澄清样品的作用。
5.鱼精蛋白为碱性蛋白，带有大量的正电荷，能够与DNA结合产生沉淀，从而将DNA去除。
该方法操作简便、迅速，能有效降低DNA残留量。
缺点是需要使用大量的鱼精蛋白，容易造成鱼精蛋白残留，很难达到DNA残留量到pg级别。
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外源性DNA残留量测定法在进行外源性DNA残留量测定时，可根据供试品具体情况选择下列任何一种方法进行测定。
第二法荧光染色法应用双链DNA荧光染料与双链DNA特异结合形成复合物，在波长480nm激发下产生超强荧光信号，可用荧光酶标仪在波长520nm出进行检测，在一定的DNA浓度范围内以及在该荧光染料过量的情况下，荧光强度与DNA浓度成正比，根据供试品的荧光强度，计算供试品中的DNA残留量。
试剂：1. 1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH7.5）用盐酸调pH至7.5。
2. 0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5）用10mol/L的NaOH溶液调pH至7.5。
3. TE缓冲液（pH7.5）1mol/L Tris溶液（pH7.5）1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH7.5）0.2ml，加灭菌水至100ml。
4. 双链DNA荧光染料按试剂使用说明配置5. DNA标准品取适量DNA标准品溶于TE缓冲液中，制成100µg/ml DNA标准品，于-20℃保存。
DNA标准品浓度计算：DNA浓度（µg/ml）=50 x A260DNA标准品溶液制备用TE缓冲液将DNA标准品配成0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5.0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的标准品溶液。
测定法：1. 精密量取DNA标准品溶液和供试品溶液各400µl于1.5ml离心管中，分别加入新配制的双链DNA荧光染料400µl，混匀，避光室温放置5min。
2. 取250µl上述反应液于96孔黑色酶标板中，并作3个复孔。
用荧光酶标仪在激发波长480nm、发射波长520nm处测定荧光强度。
3. 以TE缓冲液测得的荧光强度为本底，测定和记录各测定孔的荧光值。
以标准品溶液的浓度对其相应的荧光强度作直线回归，求得直线回归方程（相关系数应不低于0.99），将供试品溶液的荧光强度代入直线回归方程，求出供试品中DNA残留量。
注意事项：1. DNA残留量在1.25~80ng/ml内，本法线性较好，供试品DNA残留量在该范围内可定量测定；当DNA残留量低于1.25ng/ml时应为限量测定，表示为小于1.25ng/ml。
2. 供试品首次应用本法测定时需要进行方法学验证，验证内容至少包括精密度试验和回收率试验。
若供试品干扰回收率和精密度，应采用适宜方法稀释或纯化DNA（参见本项目第一法）以排除干扰。
需要纯化DNA后再进行测定的供试品，每次测定均应从纯化步骤起增加回收率试验，并用回收率对测定结果进行校正。
第一法DNA探针杂交法供试品中的外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。
将特异性单链DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照比对后，可测定供试品中外源性DNA残留量。
试剂（1）DNA标记和检测试剂盒（2）DNA杂交膜尼龙膜或硝酸纤维素膜（3）2%蛋白酶K溶液称取蛋白酶K 0.20g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分装后储藏于-20℃备用。
（4）3%牛血清白蛋白溶液称取牛血清白蛋白0.30g，溶于灭菌水（电阻率大于18.2MΩ·cm）10ml中，分装后储藏于-20℃备用。
（5）1mol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶液（pH8.0）用盐酸调pH至8.0。
（6）5.0mol/L NaCl溶液。
（7）0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）NaOH溶液调pH至8.0。
（8）20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液用盐酸调pH至7.2。
（9）蛋白酶缓冲液（pH8.0）量取1mol/L Tris溶液1.0ml（pH8.0）、5.0mol/L NaCl 溶液2.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml、20%SDS溶液2.5ml，加灭菌水至10ml。
（10）TE缓冲液（pH8.0）1mol/L Tris溶液（pH8.0）1.0ml、0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠溶液（pH8.0）2.0ml，加灭菌水至1000ml。
（11）1%鱼精DNA溶液精密称取鱼精DNA 0.10g，置10ml量瓶中，用TE缓冲液稀释至刻度，摇匀。
用7号针头反复抽打以剪切DNA成为小分子，分装后贮藏于-20℃备用。
（12）DNA稀释液取1%鱼精DNA溶液50µl，加TE缓冲液至10ml。
用于探针标记和阳性对照的DNA制备由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得，其提纯和鉴定可参考以下方案，具体可参考《分子克隆实验指南》（美J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002）或《精编分子生物学实验指南》（美F.奥斯伯等著，颜子颖、王海林译，科学出版社，1998）。
1.将待提取的细胞基质悬浮的细胞浓度调整为107个/ml（细菌则为108个/ml）；2.量取悬液1ml，离心，在沉淀中加裂解液400µl混匀，37℃作用12~24h；3.加入饱和苯酚溶液450µl，剧烈混匀，10 000rpm，10min；4.转移上层液体，以饱和苯酚溶液450µl重复抽提1次；5.转移上层液体，加入三氯甲烷450µl，剧烈混匀，10 000rpm，10min；6.转移上层液体，加入pH 5.2的3mol/L醋酸钠溶液40µl，充分混匀，再加入-20℃以下的无水乙醇1ml，充分混匀，-20℃以下作用2h，15 000rpm，15min；7.用适量-20℃70%乙醇溶液洗涤沉淀1次，15 000rpm，15min，弃上清；8.将沉淀吹至干燥后，加适量灭菌TE缓冲液溶解，RNase酶切；9.酚-三氯甲烷抽提，分子筛纯化DNA，即得。
用1%琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法鉴定阳性对照品的DNA纯度，应无RNA和寡核苷酸存在；A260/A280比值应在1.0~2.0之间（测定时将供试品稀释至A260为0.2~1.0）.用于阳性对照和标记探针的DNA在使用前应进行酶切或超声处理，使其片段大小适合DNA杂交和探针标记。
阳性对照品的DNA浓度计算：DNA浓度（µg/ml）=50X A260阳性对照品可分装与适宜的小管中，-20℃以下保存，长期使用。
探针的标记：按说明书进行测定法：1.蛋白酶K预处理按下表对供试品、阳性对照和阴性对照进行加样，混合后37℃保温4h以上，以保证酶切反应完全。
加样量2%蛋白酶K溶液蛋白酶缓冲液3%牛血清蛋白溶液加水至终体积供试品100µl 1µl 20µl 200µlD1 100µl 1µl 20µl 适量200µlD2 100µl 1µl 20µl 适量200µlD3 100µl 1µl 20µl 适量200µl 阴性对照100µl 1µl 20µl 适量200µl根据成品最大使用剂量，用DNA稀释液将供试品（原液）稀释至每100µl含1人份剂量；如成品使用剂量较大，而供试品的蛋白质含量较低，可用DNA稀释液将供试品稀释至每100µl含1/10或1/100人份剂量。
D1、D2、D3为稀释的阳性DNA对照。
用DNA稀释液稀释至每1ml中含DNA 1000ng，然后依次10倍稀释成10ng/100µl（D1）、1ng/100µl（D2）、100pg/100µl（D3）3个稀释度；如成品使用剂量较大，而DNA限量要求（100ng/剂量）较严格时，则需要提高DNA检测灵敏度，相应的阳性DNA稀释成100pg/100µl（D1）、10pg/100µl（D2）、1pg/100µl（D3）。
阴性对照为DNA稀释液，空白对照为未进行蛋白酶K预处理的TE缓冲液。
当供试品1/100人份剂量大于100µl时，终体积也随之增大，一般为供试品体积的1倍左右，供试品体积和终体积相差过小，可能会影响蛋白酶K的活性。
2%蛋白酶K溶液和蛋白酶缓冲液的比例为1:20，蛋白酶缓冲液和终体积的比例为1:10。
加入3%牛血清蛋白溶液适量，是为了使阳性对照和阴性对照中含有一定的蛋白质，与供试品（通常为蛋白质）的酶切条件一致；如供试品为其他物质，则改为其他相应物质。
若预处理后的供试品溶液中的蛋白质干扰本试验，可用上述饱和苯酚溶液抽提法或其他适宜方法提取供试品DNA（阳性、阴性对照也应再次提取DNA，与供试品溶液平行）。
2. 点膜用TE缓冲液浸润杂交膜后，将预处理的供试品、阳性对照、阴性对照与空白对照置100℃水浴加入10min，迅速冰浴冷却，8 000rpm，5s。
用抽滤加样器点样于杂交膜（因由蛋白质沉淀，故视沉淀多少确定加样量，避免加入蛋白质沉淀。
所有供试品与阳性对照、阳性对照、空白对照加样体积应一致，或按同样比例加样）。
晾干后置80℃真空干烤1h 以上。
3. 杂交及显色按试剂盒使用说明书进行。
结果判定：阳性对照应显色，其颜色深度与DNA含量相对应，呈一定的颜色梯度；阴性对照、空白对照应不显色，或显色深度小于阳性DNA对照D3，试验成立。
将供试品与阳性对照比较，根据显色的深浅判定供试品中外源性DNA的含量。