03 氨基酸育种及扩大培养
生产菌种的扩大培养与保藏
生产菌种的扩大培养与保藏目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。
如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。
要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。
其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。
如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。
因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。
这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。
种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。
这些纯种培养物称为种子。
发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理形状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。
第一节种子的制备过程在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
（一）孢子的制备1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。
培养温度一般为37℃。
细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。
2，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。
培养的温度一般为25~28℃。
培养时间一般为4~14天。
实验室菌种扩大培养的流程
实验室菌种扩大培养的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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在进行实验室菌种扩大培养之前，需要做好充分的准备工作。
生产菌种的选育培养—菌种的扩大培养及保藏
（三） 菌种的保藏
不同菌种保藏方法比较
方法名称
主要措施
适宜菌种 保藏期 评 价
冰箱保藏法（斜面）
低温
各大类
3~6月 简便
冰箱保藏法（半固体）
低温
细菌、酵母菌 6~12月 简便
石蜡油封藏法*
低温、缺氧
各大类**
1~2年 简便
沙土保藏法
干燥、无营养 产孢子微生物 1~10年 简便 有效
恢复和建立具有原来生产性状的群体。
菌种的复壮： 狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离等技术，从已衰
退的群体中帅选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 相应措施。
广义：在菌种尚未衰退前就有意识地采取纯种分离和生产性状的测 定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
菌种复壮的措施：
1. 菌种的提纯（稀释涂平板法等、单细胞分离 法）
第四节 菌种的扩大培养及保藏
菌种的扩大培养：将保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠 状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐 级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培 养物称为种子。
一、 菌种的扩大培养
广义：从斜面菌种开始到发酵罐接种之前的所有生产过程。 狭义：仅指生产车间种子罐的培养过程。
菌种衰退的后果： 1. 菌种的发酵能力降低 2. 繁殖能力降低 3. 发酵产品的得率降低
菌种衰退的原因：
1. 基因突变（基因负突变） 2. 变异菌株性状分离 （多次划线分离纯化） 3. 连续传代 （减少传代次数） 4. 其他因素 （温度、湿度、培养基成分）
（二） 菌种的提纯与复壮
菌种的提纯： 从已衰退的菌种中，通过分离纯化，将尚未退化的个体分离出来，以
微生物工业菌种的扩大培养
微生物工业菌种的扩大培养微生物工业菌种的扩大培养来源：青岛海博菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。
这些纯种的培养物称为种子。
作为生产用的种子，必须具备如下的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；②生理性状稳定；③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；④无杂菌污染（不带杂菌）；⑤生产能力稳定。
一、种子的制备过程种子制备的过程大致可分为实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段。
实验室种子制备阶段是指琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养）或液体摇瓶培养；生产车间种子制备阶段是种子罐扩大培养。
（一）、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：固体孢子培养法和液体种子培养法。
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌；对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
１、孢子的制备（1）细菌的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37?C。
细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。
（2）霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为25~28?C，培养时间一般为4~14天。
（3）放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度一般为28?C，培养时间为5~14天。
２、液体种子制备（1）好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。
将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。
试管→三角瓶→摇床→种子罐。
生物工业菌种与种子的扩大培养
II. 划线分离法
斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法
产品鉴定及筛选
从两个角度出发：产物角度、形态角度 I. 从产物角度出发
也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计 培养基。 例：醛肟水解酶的筛选
在培养基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去 一半培养物，补充新鲜培养基，不断分析样品。
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育
4. 诱变育种 正突变 对生产有利的突变称为正突变。
突变方向 负突变 造成菌株衰退及生产质量下降 的突变称为负突变。
菌株发生正突变的概率低。 诱变育种的关键： ①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细
胞悬浮液，使个别存活的个体中DNA碱基变异频 率大幅提高；
(b) 预处理：1g土样溶于99ml去离子水中，振荡均匀， 过滤，得菌悬液
(c) 增殖培养： 经80℃，30分钟预处理
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 自然选育过程： (d) 分离纯化：固体分离培养基采用CMC为唯一碳源
，pH 10.5条件下涂布培养3-4天 (e)鉴定筛选：选择有凹陷圈的菌落，而且越大越
诱变
2. 诱变机理 这种变化包括：DNA链的断裂，DNA分子内和分子 间的交联形成嘧啶二聚体。
诱变
3. 诱变仪器 265nm的紫外光，对应于功率为15W的紫外灯
4. 诱变操作 (1) 将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液 层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器；
(2) 使用15W的紫外灯管，照射距离为30cm左右， 照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株 需处理10min左右。
4第四章-种子的扩大培养
① 生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延 滞期短；
② 菌体的生理特性及生产能力稳定；
③ 菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求；
④无杂菌污染。
生产种子的制备与培养条件因生产品种和菌种不 同而异。eg:细菌、酵母菌、放线菌和霉菌，它们 的生长速度、产孢子能力、营养要求、培养温度、 需氧量等方面各不相同，因此应根据菌种的生理 特征选择合适的培养条件。
{3} 霉菌类 (☆☆☆重点此处课本讲的较为 粗略，补充章节加以详细说明，可选。）
母斜面上的菌落要分散，以便于挑选理想 的菌落。挑单菌落种子斜面时，要挑取菌 落中央部位的孢子。斜面制备大米孢子时， 孢子悬液的浓度要适当，接种完毕后，把 大米等固体培养基与孢子悬液混合均匀， 待孢子生长成熟后，在真空下将水分含量 抽至10%下，密封后置于4℃冰箱中 备用。
{2} 放线菌类 灭菌后的琼脂培养基在放凉且未凝固时摆成斜面，
如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，但不要产生 气泡。待斜面凝固后置于28~37℃培养2~3d，经 检查无杂菌和无冷凝水后备用。根据放线菌种类 的不同，取适量沙土管菌种或母斜面上的菌落 划线接种 到琼脂斜面培养基上，调整到合适的 温度，经过5~7d培养，待孢子成熟后方可使用。 注意点：第一次从沙土管或者冻干管中接出的菌 种往往生长缓慢，菌落稀少。这是因为菌种长期 在低温下保存，尚未完全从休眠中恢复，同时有 一些菌种死亡所致，可选用第一次长好的斜面上 （成为子斜面），经过培养后，斜面上的菌落数 量多，孢子丰满，孢母的扩大培养
第四节 液体种子制备
定义：液体种子的制备是将固体培养基上 培养好的孢子或菌体转入到液体培养基中 培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。
注意：种子制备所使用的培养基和工艺条 件，要有利于孢子发芽和菌丝的繁殖。
结冷胶种子扩大培养的研究及分析
生 长速 率和 适 当的 菌量 ， 同 的初 始 ｐ 不 Ｈ对 种子 的 质量 影 响较 大 。 生 长因 子对 发酵 后期 的 多糖合 成也 有促 进作 用 。结 冷胶 一级 种子
种 子培 养基 中的氮 源功 能是 构成 菌体 成分 ，作 为酶 的 组成 分或 维 培 养过程 相 关参数 趋 势见 图 １ 。
收前 ４ ５ — 天将 袋 除 去 ， 以促 进 上 色 ， 对于 日照条 件 差 的地 区可 提 病 作 用的 农药 ， 轻 流胶病 的 危害 ， 要控 制好 桃 园的 水肥 管 以减 同时 前２ ３ — 天除 袋 。 理 ， 预防 桃流 皎病 也有 一定 的效 果 。 对
６适 时 采 收 ． 定 。如 就地 鲜销宜 于八 至 九成 熟时 采收 。
结 冷 胶一 级 种子 一 般 采 用 无糖 配 方 ， 酵 母浸 膏 ：． 牛 肉 即 ０１ ％，
控条 件少 ， 过程 不易 取样 分析 检测 ， 制 约了 摇瓶 种子 的 优 膏 ：． 鱼 蛋 白胨 ：． 硫 酸 镁 ：． 培 养基 中含 有加 入少 量 有 中间 严重 ０３ ％， ０ ％， ｓ Ｏ５ ％， 化 。而 工业 生产 中 ， 种子接 入 工业扩 大 培养罐 ， 内各种 参数 可 以 机 氮 源和 无机 盐类 。结 冷胶 菌属 细菌 类 ， 一级 种子 培 养时 ， 要 罐 在 需 通过 取样 检 测和 控 制 ， 高 种 子 的质 量 ， 握最 佳 种龄 的 控 制点 ， 有机氮 源和 无机 盐 参与 菌体 的繁 殖 ， 源直 接影 响微 生 物 的生长 ， 提 掌 氮 有利于 发酵 周期 的缩短 ， 多糖转 化率 的提 高 。 结 冷胶 种子 培养 过程 中常 用 的氮源 多为酵母 膏 和其 他氮 源组 合 的 工 业种 子扩 大 培养 过程 中 ，Ｈ 值 、 Ｄ 值 （ ｐ Ｏ 菌浓 ）氨 基 氮 三项 复合氮源（ 、 牛肉膏 、 蛋白胨等 ｏ ｍ ｏｔｉ 等研究了酵母膏 、 ｐ ｏｈ ｉ Ｎａ ｒ 蛋白
第八章氨基酸产生菌的选育和发酵技术
8.3.1 概述
(2) 寄主—载体系统
脱离染色体的基因不能复制，需要无性繁殖系。
(3) 目的基因的制备与克隆 (4) 转化系统 (5) 目的基因的表达
第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术 8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌
8.3.2 赖氨酸产生菌的构建 赖氨酸产生菌AJ11779 增殖 提取染色体DNA EcoR I 连接 枯草杆菌AJ1315 重组质粒 扩增 感受态细胞 DNA 质粒pUB110 EcoR I
葡萄糖
2/3mol Leu + 2 NAD(P)H2 + 2ATP
2/3mol Glu + 5 1/3 NAD(P)H2 + 2ATP Glu + 3 NAD(P)H2 + ATP
谷氨酸发酵（乙醛酸循环） 葡萄糖
谷氨酸发酵（磷酸烯醇式丙酮酸羧基化途径）
葡萄糖
第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术 8.6 氨基酸的提取与精制
第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术 8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略
8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 育种实例： 苏氨酸结构类似物：a-氨基-ᵦ-羟基戊酸，黄色短杆菌，苏氨酸14g/L
赖氨酸结构类似物：S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸，赖氨酸盐30g/L
第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术
8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略
8.1.9 氨基酸产生菌的定向育种途径
发酵生产氨基酸，多采用营养缺陷型、抗结构类似物或具有多重遗传标 记的突变株。避免盲目性。 研究目的氨基酸生物合成途径、遗传控制、代谢调节与关键酶。
第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术 8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌 8.2.1 利用原生质体融合技术选育氨基酸产生菌
《发酵工程》—扩大培育优良菌种与种子
◆任务：不仅要得到纯而壮的培养物， 而且要获得活力旺盛的接种数量足够 的培养物。以便在发酵罐的发酵培养 过程中尽可能地缩短迟滞期。
◆根据菌种生长速度快慢来决定扩大培 养的级数；
《发酵工程》—扩大培育优良菌种与 种子
※细菌（谷氨酸及其它氨基酸生产）生长较快， 用二级放大培养（斜面菌种→一级种子摇床 培养→二级种子罐培养→发酵罐）
• 蒸馏水保藏法：菌体在无营养条件条件 下4~10℃较长时间保藏。适用于酵母菌、 真菌等。
• 琼脂穿刺封口保藏法：适用于不产孢子 细菌的保藏
《发酵工程》—扩大培育优良菌种与 种子
• 曲法保藏：将麸皮与水按比例混合，灭菌后 接入菌种，待孢子长成后即为成曲。将试管 放入盛有氯化钙的干燥器中，干燥后低温保 藏。适用于有大量孢子的霉菌和某些放线菌 的保藏。
✓发酵工业用菌种 ✓ 种子扩大培养
重点：菌种的选育、保藏方法，防 止菌种衰退的措施以及影响种子质 量的因素。种子扩大培养定义 难点：影响种子质量的因素。
《发酵工程》—扩大培育优良菌种与 种子
第一节 发酵工业用菌种
发酵工业对菌种的要求 工业上常用的微生物及来源 生产用菌种的保藏及选育 防止菌种衰退的措施
《发酵工程》—扩大培育优良菌种与 种子
应用：生产甲叉丁二酸(又 名衣康酸)
《发酵工程》—扩大培育优良菌种与 种子
【精选】第五章种子扩大培养
二、生产车间种子制备
以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做 种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对 种子的要求。
种子罐培养原则：
采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐 等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
摇瓶菌丝体种子： 可在火焰保护下接入种子罐或 采用压差法接入。
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
种子罐级数的意义：
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并可减少移种带来染菌机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时 间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时 间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数 不宜过少。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶
液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。
（3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中， 就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会。
（4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根 据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子 扩大培养的级数。
种子液(几或几十立方米)
按10%接种量
发酵罐(几十或几百立方米)
由实验室制备到车间生产 的过程
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段