一种高纯度原代神经元培养和高效率转染的方法
原代神经细胞培养方法解析
神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。
神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。
(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。
(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。
(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。
我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。
在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。
1．材料和方法（1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。
（2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。
（3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。
（4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。
（5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。
2．结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。
神经元培养 -总结
Coverslips的清洗方法1.三蒸水浸泡过夜2.硝酸浸泡48小时, 硝酸每月更换一次。
（18h<时间<72h ）3.先用单蒸水冲洗几遍，将表面的硝酸洗去，然后用双蒸水洗8次，在摇床上摇90-100转，1小时换一次水。
最好能摇过夜。
4.干烤6小时，干烤温度为225度。
注：洗玻片这一步很重要，如果洗不彻底，细胞贴壁明显不好，并有聚团现象。
洗得过程中，请按照先放水，再放入玻片架，以免玻片互相粘在一起，洗不彻底。
换水时用PE手套，每次换水请更换PE手套，如洗的过程中有粘在一起的现象，请用镊子一个一个分开后，再继续洗。
5.在超净台，放到无菌培养皿里，封口膜封好6.用0.1mg/ml的PLL coat玻片，每个玻片100-120ul,过夜放置，60mm 加3ml，12孔板加1ml。
注：PLL最好不要使用超过1个月。
母液浓度1mg/ml，-20℃贮存，工作浓度0.1mg/ml（100ul母液+ 900ul ddH2O）7.种细胞前吸去多赖，用HBSS洗，2ml/well ，2-3次。
注：没有放coverslips的dish 不用洗，直接吹干就好了，30min 左右。
8.在Hood里自然干燥，不开紫外，紫外线可以分解多赖。
Preparation:1）冰盒，解剖工具（1把大剪刀，2 把尖镊子，2把尖嘴弯镊）泡在75%的酒精中消毒，100mm dish 2个，60mm dish 4个，细胞计数板，timer，1大1小两个塑料袋。
2）4个60mm dish每个放3ml左右HBSS置冰上，1个100mm dish 加入20ml左右DMEM全培置冰上。
3）打开37 C水浴，pre-warm HBSS，NB全培，0.25%胰酶（trypsin）学生值日准备工作1 预先查看是否有NB液及加B27的NB液2 查找并确定共需多少皿神经元，注意孵箱里保顾的待培养的皿，24孔板，6孔板等2 确定共需配制多少神经元培养液（即10% HS的全培）3 吸去待培养神经元的培养皿中的多赖并回收多赖，晾干4 配制神经元培养液，并加于各待培养的皿中，24孔板500ul，96孔板100ul神经元基础培养液：Neurobasal Medium + B27(2%，10ml/500mlNB，避光融化)神经元原代培养种植液50ml：DMEM + HS(5ml，10%)神经元培养液：神经元基础培养液 + GlutaMAX (125ul，100X，0.25%) + 双抗（1%，P-S，无血清）NB，0.25% trypsin，37℃预热。
神经元原代培养实验报告
一、实验背景神经元是神经系统中最基本的结构和功能单位，研究神经元生物学特性对于理解神经系统疾病和开发新的治疗方法具有重要意义。
神经元原代培养是研究神经元生物学特性的重要方法之一，它能够模拟体内神经元的生长和发育过程，为神经元生物学研究提供了一种有效的手段。
二、实验目的1. 掌握神经元原代培养的方法和步骤。
2. 观察神经元原代培养过程中的形态学变化。
3. 分析神经元原代培养过程中细胞生长、增殖和分化情况。
三、实验材料1. 实验动物：E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠。
2. 试剂：含10%胎牛血清的DMEM培养基、神经元维持培养基(NeurobasalB27谷氨酰胺）、胰蛋白酶、抗神经丝抗体、荧光染料等。
3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器等。
四、实验方法1. 取E17-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠大脑皮质，用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液。
2. 将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
3. 每天观察细胞生长情况，记录细胞形态学变化。
4. 培养第3天，进行细胞计数，观察细胞生长速率。
5. 培养第5天，进行免疫荧光染色，观察神经元纯度。
6. 培养第10天，进行神经元分化实验，观察神经元功能。
五、实验结果1. 细胞形态学观察：神经元原代培养过程中，细胞从圆形逐渐转变为梭形，并逐渐出现突起，形态逐渐成熟。
2. 细胞生长速率：培养第3天，细胞生长速率为（2-4）×10^4个/皿；培养第5天，细胞生长速率为（4-8）×10^4个/皿。
3. 神经元纯度：免疫荧光染色结果显示，神经元纯度达到90%以上。
4. 神经元分化实验：神经元分化实验结果显示，神经元在培养过程中逐渐分化为不同类型的神经元，如运动神经元、感觉神经元等。
六、实验讨论1. 神经元原代培养过程中，细胞形态学变化与体内神经元生长和发育过程相似，为研究神经元生物学特性提供了有力手段。
2. 细胞生长速率受多种因素影响，如培养基、温度、CO2浓度等。
新生小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定
新生小鼠小脑颗粒神经元的原代培养与鉴定
方晨昊;刘辉庆;夏泽阳;高俜娉;鲍南
【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》
【年(卷),期】2024(33)1
【摘要】目的通过改进已报道的新生小鼠小脑颗粒神经元培养方法,以获得纯度更高,杂质更少,状态更佳的颗粒神经元。
方法将小鼠小脑组织剪碎,经木瓜蛋白酶消化后得到单细胞悬液,采用Percoll非连续性密度梯度离心法分离出颗粒神经元前体细胞,种植在基质胶包被过的培养皿中并在培养20 h后给予阿糖胞苷(5μmol/L)处理8h。
使用激光共聚焦显微镜及神经元特异性标志物微管相关蛋白2(MAP2)对小脑颗粒神经元细胞进行纯度鉴定。
结果细胞存活率达98.03%±1.048%;神经元纯度为99.71%±0.2%。
结论该方法获取的颗粒神经元存活率和纯度较高,是一种小鼠小脑颗粒神经元体外培养的可靠方法。
【总页数】6页(P56-60)
【作者】方晨昊;刘辉庆;夏泽阳;高俜娉;鲍南
【作者单位】上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心神经外科
【正文语种】中文
【中图分类】R365
【相关文献】
1.茶碱对原代培养大鼠小脑颗粒神经元酒精性损害的保护作用
2.一种改进的小鼠嗅神经元原代培养方法及其鉴定
3.新生大鼠小脑颗粒神经元原代培养与鉴定
4.一种
改进的小脑颗粒神经元原代培养方法及其性质鉴定5.新生大鼠尾核神经元的体外原代培养及神经元鉴定
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
原代神经细胞培养
原代神经细胞培养新生鼠神经元细胞的培养准备工作：1、解剖器械一套（实验室有专门用于细胞间取材用的成套器械），需提前一天灭菌，过夜烤干。
2、试剂、溶液：Neuralbasal培养基（2mM glutamine）；D-PBS缓冲液；0.25%trypsin/0.02%EDTA消化液；0.05%poly-lysin。
3、包被玻片：干烤灭菌12 x 12mm2玻片，12孔板。
包被过程：0.05%poly-lysin滴于置培养板中的盖玻片上（注意勿溢出玻片），37℃放置12hr后纯水洗3遍，晾干。
4、操作中所用枪头均用剪刀剪去枪头尖，然后在酒精灯上迅速过一下抛光。
取材：1、从-200C取出三个冰袋，预冷若干皿D-PBS，一大皿用于冷却剥出的脑子，另外的35mm的皿用于冷却分离出的脑组织，如：海马，皮层，下丘脑等，分离几个部位就预冷几小皿D-PBS，小皿盖子上做好标记，第三个冰袋上放一皿盖，上面放灭过菌的滤纸，用于剥离脑子的操作。
2、取1-3天鼠，75％酒精浸泡片刻后，用大剪子断头处死。
3、弯头眼科剪剪开颅骨，取出完整脑至盛有预冷D-PBS的培养皿中，在体式镜下分离相应部位的组织,分别放在相应的皿中。
4、将组织块用弯头眼科剪剪碎，每小块约2mm3左右，用枪移入5mlEP中，稍为沉淀1分钟，吸弃上清，加入0.25%trypsin/0.02%EDTA，37℃消化10-15分钟左右，期间每3分钟颠倒几下。
注：每四个海马用胰酶1ml，每个皮层用胰酶2ml。
5、消化完毕，每毫升胰酶加入100ul血清以终止胰酶，颠倒混匀；1000rpm，4分钟，离心沉淀。
6、吸弃上清，注意不要将组织吸出。
7、加入37℃预热的1-2ml DMEM／10%FBS，用枪头吹打20下左右，此时液体浑浊，组织块明显变小。
8、放置沉淀3分钟左右，可见组织块沉底，吸取上清，其中包含所要的细胞。
9、计数，将细胞密度调整至2－4 x 10 5 /ml后接种于预先用poly-lysine包被过的盖玻片或皿上，100ul每玻片（12 x 12mm玻片）。
原代神经元细胞培养技巧
原代神经元细胞培养技巧
以下是 9 条关于原代神经元细胞培养技巧：
1. 哎呀呀，培养原代神经元细胞，那选对材料可太重要啦！就好比你要做一道美味佳肴，那食材得新鲜优质对吧？比如你得挑健康的胚胎组织，可别随便拿些不靠谱的材料来凑数呀！
2. 嘿，解离细胞这一步可得小心谨慎哦！这就像拆一件精密的玩具，不能太粗鲁，不然全给弄坏啦！要温柔地进行操作呢。
3. 哇塞，接种细胞时可得仔细着点儿！就像给小宝贝们找个舒服的家，密度要合适，位置要恰当，不能马马虎虎哟！
4. 知道吗，培养基那可是细胞的营养大餐呀！怎能随随便便选呢？一定要找最适合它们的，不然它们怎么茁壮成长呢？就像给孩子选奶粉一样重要呐！
5. 天呐，培养环境那简直就是细胞的小天地！温度、湿度、气体都得严格把控，这可不是闹着玩的呢，你说是不是？
6. 哇哦，换液的时候可得注意啦！你想呀，如果给它们换了不好的液体，那不就像给人喝了不健康的水一样嘛，能行么？
7. 诶，观察细胞可不能马虎呀！那可是随时了解它们状态的关键呀，这就好比你时刻关注着自己宝贝的一举一动，有没有问题一下子就知道啦！
8. 哎呀，防止污染那可是重中之重啊！稍微不注意让细菌病毒钻了空子，那不就全完啦？这可不比家里打扫卫生，得超级认真呀！
9. 总之呢，培养原代神经元细胞真的需要特别细心和耐心！每一个环节都不能掉以轻心，都要像对待艺术品一样精心呵护，这样才能培养出健康优秀的细胞呀！。
体外培养原代脊髓神经细胞
体外培养原代脊髓神经细胞
张俐;聂光瑞
【期刊名称】《中国中医骨伤科杂志》
【年(卷),期】2008(16)2
【摘要】目的:用一种新方法在体外培养原代脊髓神经细胞。
为脊髓神经细胞缺血再灌注损伤方面的分子机制及药物作用机制的研究提供条件。
方法:取出生于24h
内的SD大鼠的脊髓,然后将其中的分离出的神经细胞作原代细胞,再将其进行培养。
最后用细胞形态学及细胞免疫化学检测法来检测培养细胞的状况。
结果:大鼠的脊
髓神经细胞在体外培养生长情况好,纯度高。
结论:培养脊髓神经细胞时该方法简便,且培养的细胞生长好,纯度高。
这将有助于对脊髓神经细胞的研究开展。
【总页数】3页(P13-15)
【关键词】脊髓;神经细胞;体外培养;培养方法
【作者】张俐;聂光瑞
【作者单位】福建中医学院骨伤系
【正文语种】中文
【中图分类】Q813.11
【相关文献】
1.体外原代培养神经细胞液压冲击伤模型的建立 [J], 杨术旺;张永亮;李灵芝;于媛媛;白皛;
2.体外原代培养神经细胞液压冲击伤模型的建立 [J], 杨术旺;张永亮;李灵芝;于媛
媛;白皛
3.NO在体外大鼠神经细胞原代培养中作用机制的研究 [J], 吕晓红;饶明俐
4.大鼠胚胎脊髓神经细胞的原代培养及其神经营养素受体表达的初步研究 [J], 端礼荣;张志坚;刘锦波
5.原代海马神经细胞体外培养的纯化与鉴定 [J], 刘歆;张一娜;张云鹤;姜礼红
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
神经元原代培养 丁香园
（丁香园protocol 2008）一、常规的试剂配制：1、培养基：选用高糖型DMEM/F12 (1:1)培养基干粉（含15 mmol Hepes），每升培养液中加入碳酸氢钠1.8 g，调节pH值7.0，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后，加入谷氨酰胺、无菌的青霉素和链霉素液，使其终浓度分别为0.5 mmol/L 、100 U/ml和100 μg /ml，分装后置于4℃保存，临用前加入2%的B27。
神经细胞代谢旺盛，选用高糖型培养基；谷胱甘肽可保持培养基还原状态，营养成分稳定；B27是公认的刺激神经元生长的营养因子，不过价格挺贵；PH值很关键，Hepes是优秀的缓冲系统，pH值调好后能保持很长时间；2、多聚赖氨酸溶液的配制：称取1.5 mg L-多聚赖氨酸溶于100 ml PBS，0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于4 ℃保存，可长期使用；3、磷酸盐缓冲液（PBS）的配制：称取8.0 g NaCl、0.2 g KCl、2.85 g Na2HPO4•12H2O 和0.2 g KH2PO4充分溶于900 ml dd H2O，调节pH值为7.2，补dd H2O至1000 ml并分装，高压灭菌（121～126 ℃），4 ℃备用；4、D-Hanks液的配制：称取KCl 0.4 g，KH2PO4 0.06 g，NaCl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，Na2HPO4•12H2O 0.08 g，溶于dd H2O中，调节PH值为7.2，定容至1000 ml，高压蒸汽灭菌（121～126 ℃），4℃备用；5、0.25%胰蛋白酶的配制：称取0.25 g胰蛋白酶粉末，少许D-Hanks溶液调成糊状，用D-Hanks定容至100 ml，混匀，冰箱内放置过夜，滤纸过滤后，0.22 m微孔滤膜过滤，分装，-20 ℃保存。
二、试验操作过程：1、包被：培养前晚上将培养瓶（板）用多聚赖氨酸包被10 min，吸除，无菌操作台上15min 自然晾干，置于培养箱中备用；2、取脑：选取新生24 h的SD大鼠数只，雌雄不限，75%酒精全身消毒，断头处死，无菌条件下分层剪开头皮、颅骨，用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，D-hanks液洗数次；（预先准备至少4把眼科剪刀，分别用于断头、剪头皮和剪颅骨及第3步的剪组织这4个操作）3、分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于冰浴的D-hanks液中，仔细剔除微血管，用充分剪碎组织；4、消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，瓶口用锡箔纸盖上，37 ℃培养箱内消化20 min 左右，期间轻摇数次；过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用尖头吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作要轻柔，用150目网筛过滤，收集细胞悬液；5、接种：以1100 rpm离心5 min，倾去上清，用DMEM/F12培养液重悬细胞，轻轻吹打，台盼蓝染色快速计数，根据计数结果，调整细胞终浓度为1 00000个/ml，加入终浓度为10%胎牛血清后接种于培养瓶（板）中，置于37 ℃、含5% CO2培养箱中培养；12小时内禁止晃动6、换液：接种后24 h将培养液全量换成无血清DMEM/F12培养液，第48 h时加入终浓度为10 μmol/L的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞的过度生长，随后每3 d半量换液。
一种改进的小鼠嗅神经元原代培养方法及其鉴定
一种改进的小鼠嗅神经元原代培养方法及其鉴定
本研究提出了一种改进的小鼠嗅神经元原代培养方法，包括以下步骤：第一步，小牛鼻神经（OBN）节细胞从离体小鼠自由表面脊髓内被分离出来；第二步，将离体OFC节细胞悬浮在一定量的培养液中，采用低速接种机将其接种到低糖有机硅载体中；第三步，在有机硅载体中，可以看到神经细胞出现可见的表现，细胞形状、活动性等记录在素细胞成长；第四步，由于有机硅载体的响应性能及其器官的生物学性质，可以用于小鼠嗅神经系统的原代培养，在实验用培养液中，添加适量的神经元生长因子，神经元细胞会在很短的时间内继续增殖；第五步，对小鼠OFC原代细胞进行免疫组化和原位测序，以鉴定小鼠OFC神经元的分子特性和功能；第六步，通过电生理实验、单细胞荧光定量PCR(qPCR)等技术，进一步将小鼠OFC原代培养系统进行定量分析，评价细胞特异性及其功能。
本方法节约成本，效率高，可以大量生产高质量的小鼠OFC原代细胞供进一步实验研究。
大鼠原代神经元的培养及操作技巧
径 得 尤为重 要。 神经 系统新型药物 的研发方 面 ， 成功地 进 行神经元 的原代培养对药物的基础研究起着重要的作用 ，是研 究 的 良好 材料Ｉ １ ＇ ２ １ 、 另外 ， 神经 元原代培养方法 是具有影 响因素 干扰因素少的实验模 型 ， 具有较真实反映在体神经元活动
一
、
和结 果容易分析 等特点＿ ｊ Ｉ 。凶此 ， 探 索并建立 用 ２ ４ ｈ内新 生 Ｓ Ｄ 乳 鼠体 外培养神经元 的方法显得尤为重要 。
有限公 司 ） ．
②对进入细胞培养室 的有外包装瓶子 、 盒子等要通 留脑 膜 和 』 ｆ Ｉ Ｌ 管， 将剪碎脑组织移至离心 管中 ， 加入 ０ ． ２ ５ ％胰 酶 吹 的定期消毒 ； 并紫外线消毒 ， 不能刚紫外线 消毒的 ， 使用 ７ ５ ％乙醇 打消化 ， ３ ７ ℃水 浴 箱 巾 静 止 １ ５ ｍ ｉ ｎ ， 取上 层 液 加 入 盛 有 Ｈ ａ ｎ ｋ ￣液 过传递窗 ， 消毒 。第二 。 取材步骤注意事项 ： ① 由于是新生乳 鼠， 体积小 ， 好 的离心管 中． １ ５ ０ ０ Ｊ ｎ ｉ ｎ离心 １ ０ ｍ ｉ ｎ ，收集沉淀加 入适 当的 ｌ ０ ％ 消毒后 ， 直接取脑 皮层 ， 不用处死乳鼠 ， 这样可以保持细胞 胎牛血清 的 Ｄ ＭＥ Ｍ／ Ｆ １ ２ ， 片 】 光 滑 的 细 口吸 管 轻 轻 吹 散 、 混匀， 以 把控 ， 活 性， 有利 于神经元培养 。②剥离脑膜和血管时操作要轻 ， 应尽 ２ × ｌ ０ 个／ ｍ Ｌ的密 度将 细 胞 种 植 在 预 先 包 被 多 聚 一 Ｌ 一 赖 氨 酸 的 培
１ 材 料 与 方 法
图１ ｄ ６神经元细胞。２ ０ ０ ｘ
图２ Ｎ Ｓ Ｅ染色神经元细胞。４ ０ ０ ｘ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
《中国组织工程研究》 Chinese Journal of Tissue Engineering Research 文章编号:2095-4344(2018)32-05186-05 5186 www.CRTER.org ·研究原著·
李兴统，男，1991年生，云南省宣威市人，汉族，2017年昆明医科大学毕业，硕士，主要从事神经生物学研究。
并列第一作者：汤红艳，女，1969年生，云南省宜良县人，汉族，2010年北京大学医学网络教育学院毕业，主管护师，主要从事神经生物学研究。
通讯作者：李力燕，博士，教授，昆明医科大学神经科学研究所，云南省昆明市 650500
并列通讯作者：郭建辉，主任医师，云南省第一人民医院普外二科，云南省昆明市 650032
并列通讯作者：李俊彦，副主任医师，昆明市第一人民医院神经外科，云南省昆明市 650032
中图分类号:R318 文献标识码:B 稿件接受：2018-04-21
Li Xing-tong, Master, Institute for Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Tang Hong-yan, Nurse-in-charge, Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Li Xing-tong and Tang Hong-yan contributed equally to this work.
Corresponding author: Li Li-yan, MD, Professor, Institute for Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
Corresponding author: Guo Jian-hui, Chief physician, Second Department of General Surgery, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Corresponding author: Li Jun-yan, Associate chief physician, Departement of Neurosurgery, the First Hospital of Kunming, Kunming 650032, Yunnan Province, China
一种高纯度原代神经元培养和高效率转染的方法 李兴统1，汤红艳3，马 微1，杨金伟1，2，王先斌1，代云飞1，李俊彦4，郭建辉2，李力燕1(1昆明医科大学神经科学研究所，云南省昆明市 650500；2云南省第一人民医院普外二科，云南省昆明市 650032；3昆明医科大学第一附属医院神经外科，云南省昆明市 650032；4昆明市第一人民医院神经外科，云南省昆明市 650032)
DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0383 ORCID: 0000-0002-0106-0844(李兴统)
文章快速阅读：
文题释义： 神经元原代培养：从动物的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，称为原代神经元培养。 人工脂质体转染：是一种人工膜，利用脂质体可以和细胞膜融合的特点，可用作外源物质进入细胞的载体，通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞，形成内含体，DNA从内含体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。
摘要 背景：神经元的培养和细胞转染技术是在体外研究神经元生长发育及生理病理机制的重要手段，但目前原代培养的皮质神经元往往纯度不高、转染效率不高。 目的：建立一种简单、高效、稳定的原代神经元培养及转染方法。 方法：无菌条件下分离新生1 d SD大鼠大脑皮质，经0.25%的胰蛋白酶消化后离心，制备成单细胞悬液，以5×109 L-1细胞浓度接种至含神经元专用培养基的24孔细胞培养板进行原代培养，并于倒置显微镜下观察神经元形态的变化，使用神经元特异性标志物Tuj1和MAP2对培养的细胞进行鉴定；利用人工脂质体转染神经元，观察神经元转染效率。 结果与结论：①体外培养的原代神经元具有较高的纯度，在培养第7天神经元特征明显，突起相互接触形成神经元网络，并表达神经元特异性标志物Tuj1与MAP2；利用人工脂质体转染神经元，转染效率较高；②采用该方法进行原代神经元培养，能够获得稳定的、高纯度的原代神经元；人工脂质体亦可高效率转染原代神经元。 关键词： 神经元；原代神经元培养；形态学鉴定；免疫荧光鉴定；转染；人工脂质体；纯度；组织构建 主题词： 神经元；细胞培养技术；转染；脂质体；组织工程 基金资助： 国家自然科学基金项目(31560295，31260253)；云南省应用基础研究(昆医联合专项)(2015FB098)；云南省卫生科技计划项目(2014NS202)
A method of high purity primary neuron culture and high efficiency transfection Li Xing-tong1, Tang Hong-yan3, Ma Wei1, Yang Jin-wei1, 2, Wang Xian-bin1, Dai Yun-fei1, Li Jun-yan4, Guo Jian-hui2, Li Li-yan1 (1Institute for Neuroscience, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China; 2Second Department of General Surgery, the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 3Department of Neurosurgery, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 4Department of Neurosurgery, the First Hospital of Kunming, Kunming 650032, Yunnan Province, China)
一种简单、高效、稳定原代神经元培养及转染方法的建立 取大脑最表面1.0-2.0 mm厚度的皮质块
制备成单细胞悬液后接种于24孔板
Tuj1和Map2染色鉴定及统计分析神经元纯度
siRNA和lipo2000转染及转染效率检测
结论： 获得稳定，高纯度的原代神经元；人工脂质体可高效转染原代神经元 Li XT, Tang HY, Ma W, Yang JW, Wang XB, Dai YF, Li JY, Guo JH, Li LY. A method of high purity primary neuron culture and high efficiency transfection. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2018;22(32):5186-5190. DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.0383
P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org 5187
Abstract BACKGROUND: Neuron culture and cell transfection technologies are important means to study the development and pathophysiologic mechanism of neurons in vitro, but the purity and transfection efficiency of primary cultured cortical neurons are poor. OBJECTIVE: To establish a simple, efficient and stable method of culture and transfection method of primary neurons in vitro. METHODS: Primary cortical neurons were harvested from neonatal 1-day rat brains under aseptic condition, which was digested with 0.25% trypsin prior to centrifugation and made into cell suspensions, followed by being seeded into Neurobasal-A medium (5×109 L-1 per pore). The morphological characteristics of neurons were observed by inverted microscope; two neuron-specific markers (MAP2 and Tuj1) were used for immunolabeling to identify the cultured cells; the transfection efficiency of neurons was tested by Lipofectamine 2000 and Block-iT Transfection Kit. RESULTS AND CONCLUSION: The neurons cultured in vitro exhibited interconnected networks after culture for 7 days. All the cultured neurons displayed MAP2 and Tuj1 immunoreactivity. The highly effective transfection was observed under fluorescence microscope using Lipofectamine 2000 transfected neurons. In summary, the culture method of primary cerebral cortex neurons can be adopted to obtain highly purified neurons. Besides, high transfection efficiency of primary neurons can be realized by artificial liposome. Subject headings: Neurons; Cell Culture Techniques; Transfection; Liposomes; Tissue Engineering Funding: the National Natural Science Foundation of China, No. 31560295 and 31260253; the Applied Basic Research Project of Yunnan Province, No. 2015FB098; the Health, Science and Technology Project of Yunnan Province, No. 2014NS202