实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR国际化标准(二)2024
实时荧光定量PCR国际化标准（二）引言概述实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种高灵敏、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和药物研究等领域。
为了实现方法和数据的国际标准化，国际上制定了实时荧光定量PCR的国际化标准。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的主要内容。
正文内容一、技术要求1.1 具备规范的实验室条件，包括洁净、无尘、无RNA酶污染的实验环境。
1.2 使用具有良好稳定性、一致性和可追溯性的荧光探针和引物。
1.3 验证实验室使用的仪器设备，确保其精确、重复性和灵敏度符合国际标准。
二、质量控制2.1 建立质量控制体系，包括核酸提取、反转录、荧光探针标记等各个环节的质量控制。
2.2 使用合适的内部参照基因或内质控，用于验证试剂盒、仪器设备和实验操作的稳定性和可靠性。
2.3 建立监控样本和质控品的库存管理系统，确保其有效性和可追溯性。
三、方法标准化3.1 设计标准化的实验操作流程，包括样品制备、反转录、PCR 扩增和数据分析等。
3.2 使用适当的PCR引物和荧光探针，根据模板序列设计合理的引物和探针。
验证其特异性和灵敏度。
3.3 建立标准曲线和基准值体系，用于测定目标基因的定量结果，并进行结果的准确性评估。
四、数据分析和结果解释4.1 使用统一的数据分析软件，对实时荧光定量PCR的原始数据进行操作和分析。
4.2 建立标准化的数据处理流程，包括定量结果的计算、统计学分析和差异性评估。
4.3 结果的解释应基于严谨的科学依据和合理的统计学方法，避免主观性和片面性的评价。
五、结果报告和数据共享5.1 根据实验结果的重要性和可信度，及时撰写实验报告，并以适当的形式进行存档和备份。
5.2 结果报告应明确标注实验过程、方法参数、核心数据和评估结果，以便他人能够验证和复现实验结果。
5.3 鼓励将实验结果和数据共享，提供底层数据和分析工具的访问权限，促进实时荧光定量PCR的进一步发展和应用。
实时荧光定量pcr检测核酸的原理
实时荧光定量pcr检测核酸的原理实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，RT-qPCR）是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技术，能够快速、准确地定量检测核酸。
RT-qPCR的原理基于PCR的扩增和荧光信号的监测。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的方法，它由DNA模板、引物和DNA聚合酶组成。
引物是专门设计的短链DNA片段，它们能够在目标DNA序列的两端精确结合并指导DNA聚合酶的复制。
PCR的循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，双链DNA被加热至94-98℃，使其解离成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与单链DNA特异性结合。
在延伸步骤中，DNA聚合酶沿着单链DNA模板合成新的DNA链。
每一个PCR循环会使目标DNA的数量翻倍，经过多个循环，目标DNA的数量会大幅增加。
RT-qPCR通过引入荧光探针实现对PCR扩增产物的实时检测。
荧光探针也是一种短链DNA片段，其中包含一个荧光染料和一个荧光信号抑制器。
荧光信号抑制器通过与荧光染料的近距离接触，抑制了荧光信号的发射。
当荧光探针与PCR扩增产物结合时，荧光信号抑制器与荧光染料分离，荧光信号得以释放。
通过荧光信号的增加可以判断PCR扩增产物的数量。
RT-qPCR的步骤包括样品处理、反转录、PCR扩增和荧光信号检测。
首先，需要从待检测样品中提取出核酸。
然后，通过反转录酶将RNA转录成cDNA，以便后续PCR扩增。
接下来，将引物、荧光探针和PCR反应液与样品一起加入PCR扩增管中。
PCR扩增过程中，荧光探针与PCR产物结合，并释放荧光信号。
PCR扩增和荧光信号检测是在同一反应管中进行的，所以可以实现实时监测。
最后，根据荧光信号的强度，可以计算出PCR扩增产物的初始数量。
RT-qPCR具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点。
它可以在短时间内检测到低浓度的核酸，并且能够区分不同的核酸序列。
实时荧光定量PCR原理
实时荧光定量PCR原理1.PCR基本原理PCR通过在不断循环的体系中复制和放大特定DNA片段，从而实现DNA的快速扩增。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA的双链结构被解开，形成两条单链DNA。
在退火步骤中，引物与目标DNA的互补序列结合，形成引物-目标DNA结合复合物。
在延伸步骤中，DNA聚合酶通过追加互补碱基，并使用引物作为起始点，在目标DNA的基础上合成新的DNA链。
实时荧光PCR是对传统PCR技术的改进，它通过添加荧光探针（也称为探针引物）来实时监测PCR反应的进程。
荧光探针通常由两部分组成：一个荧光标记物和一个定向增效子。
在PCR反应的延伸步骤中，荧光探针与目标DNA的互补序列结合，并被PCR酶切割，导致荧光信号被释放。
3.原理图解实时荧光PCR通常需要使用一个双喷嘴热循环仪（Thermal Cycler），其中一个喷嘴用于控制样品的温度，另一个喷嘴用于实时监测PCR反应的进程。
具体的PCR反应流程如下：-备制PCR试剂：将PCR反应所需的试剂混合均匀，包括DNA模板、引物、荧光探针和内参物。
-生成PCR产物：通过一系列的循环反应，将DNA模板放大成大量的PCR产物。
-荧光信号监测：PCR反应过程中，荧光探针与PCR产物的结合会释放荧光信号。
实时荧光PCR系统通过探测和记录PCR反应体系中的荧光信号，并在每个循环结束时测定信号强度。
4.数据解读和PCR效率计算实时荧光PCR的结果通常以荧光信号的周期阈值（Ct值）表示，Ct值是荧光信号强度超过背景噪音的循环数。
Ct值越低，表示PCR产物浓度越高，反之亦然。
根据Ct值，可以计算PCR的效率。
效率（E）的计算公式为：E =10^(-1/slope) - 1，其中slope为荧光曲线的斜率。
效率越接近1，表示PCR反应越有效。
5.RT-qPCR的应用RT-qPCR可应用于多个领域，包括基因表达分析、病原体检测和药物开发等。
实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
实时荧光定量pcr标准曲线
实时荧光定量pcr标准曲线实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于检测和定量DNA或RNA的方法，它能够实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的快速、准确的定量分析。
在实时荧光定量PCR实验中，标准曲线是非常重要的，它可以用来确定目标序列的数量，并进行定量分析。
本文将介绍实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法及其应用。
1. 实验设计。
在构建实时荧光定量PCR标准曲线之前，首先需要设计实验。
确定需要检测的目标基因或RNA序列，选择合适的引物和探针，设计PCR扩增反应体系。
同时，准备一系列已知浓度的标准样品，用于构建标准曲线。
2. 标准曲线构建。
将已知浓度的标准样品进行系列稀释，得到一系列不同浓度的标准曲线点。
然后进行实时荧光定量PCR反应，记录每个标准曲线点的荧光信号强度和对应的PCR循环数。
利用这些数据绘制标准曲线，一般采用对数浓度与荧光信号强度的散点图进行绘制，然后利用线性回归分析得到标准曲线方程。
3. 标准曲线验证。
构建标准曲线后，需要进行验证。
将标准曲线方程应用于实验样品，通过检测实验样品的荧光信号强度和对应的PCR循环数，计算出目标序列的浓度。
然后与实际浓度进行比较，验证标准曲线的准确性和可靠性。
4. 标准曲线应用。
一旦标准曲线构建和验证完成，就可以应用于实际样品的定量分析。
通过实时荧光定量PCR检测实验样品的荧光信号强度和对应的PCR循环数，利用标准曲线方程计算出目标序列的浓度，从而实现对目标序列的快速、准确的定量分析。
5. 结论。
实时荧光定量PCR标准曲线的构建是实验中的关键步骤，它直接影响到定量分析的准确性和可靠性。
通过合理的实验设计、严谨的实验操作和准确的数据分析，可以构建出准确可靠的标准曲线，为实时荧光定量PCR的定量分析提供可靠的依据。
总之，实时荧光定量PCR标准曲线的构建是实验中的重要环节，它为定量分析提供了可靠的基础。
实时荧光定量PCR的原理
实时荧光定量PCR的原理1.PCR反应：2.荧光探针：实时荧光定量PCR通常使用两种类型的荧光探针来检测扩增过程：探针型Ta qMan探针和缺失型探针。
其中，探针型Ta qMan探针包含一个引物序列和一个标记荧光物。
在反应的延伸过程中，引物结合到目标序列上，同时荧光物会被系统特定的DNA聚合酶切断，从而释放出荧光信号。
缺失型探针则使用两个引物来结合目标序列的两个不同区域，其中一个引物上标记了荧光物，另一个引物上是荧光物对应的抑制剂。
当两个引物结合到目标序列上时，抑制剂阻止荧光物的释放，从而抑制荧光信号。
这两种探针的核心原理是通过荧光信号的释放或抑制来定量PCR扩增过程中的产物。
3.荧光信号检测：实时荧光定量PCR使用荧光实时检测系统检测PCR反应过程中的荧光信号。
常见的检测系统包括荧光比色法、熔解曲线分析法和荧光信号累积法等。
荧光比色法是将PCR反应体系加入一种荧光染料，其荧光信号随着PCR过程中产物的累积而增加。
熔解曲线分析法则通过逐渐升高温度，分析PCR产物的特征性熔解温度，从而确定PCR反应的特异性。
荧光信号累积法利用PCR反应产物与荧光探针的结合释放出的荧光信号的数量与产物量成正比的原理，定量PCR产物的数量。
4.数据分析：实时荧光定量PCR的数据分析通常使用阈值循环数（Ct）方法。
Ct值定义为PCR反应的循环数，PCR产物的荧光信号超过设定阈值的循环数。
Ct值越小，说明待测DNA的起始量越多。
通过建立标准曲线，将待测样品的Ct值与标准曲线对应的起始DNA量进行比较，从而计算出待测样品的目标DNA的起始量。
总体来说，实时荧光定量PCR通过引入荧光探针并使用荧光信号检测系统，实现对PCR反应中的产物进行实时定量。
其原理简单可靠，广泛应用于基因表达、突变检测、病毒定量等领域，是分子生物学研究中不可或缺的工具之一。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它通过利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，从而可以快速、准确地定量目标序列的数量。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此被广泛应用于基础研究、临床诊断、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面。
首先，PCR反应是实时荧光定量PCR的核心步骤。
PCR反应通过不断循环的高温变性、低温退火和中温延伸，使目标DNA序列得以扩增。
在每一个PCR循环中，目标序列的数量呈指数增长，这种指数增长的特点为后续的定量提供了基础。
其次，荧光探针是实时荧光定量PCR的关键。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光淬灭剂的寡核苷酸探针，它与目标序列特异性结合，并在PCR反应中被3'→5'外切酶切割，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，因此可以通过监测荧光信号的变化来实现对目标序列数量的实时定量。
最后，检测系统是实时荧光定量PCR的重要组成部分。
检测系统包括荧光定量PCR仪和数据分析软件，它能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度，并将荧光信号转化为目标序列的数量。
通过合理设置PCR反应条件和分析荧光信号的曲线，可以实现对目标序列的快速、准确定量。
总的来说，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合，通过PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面的协同作用，实现对目标序列数量的实时定量。
这种原理使实时荧光定量PCR成为一种高效、快速、准确的分子生物学技术，为科研和临床诊断提供了重要的技术支持。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。
首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。
双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。
DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。
这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。
实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。
最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。
在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量pcr名词解释
实时荧光定量 PCR 是一种用于检测和分析 DNA 或 RNA 的方法，通过在 PCR 反应体系中添加荧光基团，实时检测 PCR 扩增产物对应的荧光信号，从而对起始模板进行定量和定性分析。
荧光基团包括荧光染料和荧光探针两种形式。
荧光染料如 SYBRGreen 是一种结合于
双链 DNA 的双螺旋小沟区域的绿色荧光染料，在游离状态下发出微
弱的荧光，一旦与双链 DNA 结合后，荧光大大增强，可以根据荧光
信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
而 TaqMan 荧光探针则是在 PCR 扩增时添加的一条特异性的荧光探针，其中 5"端标记一个报告荧光基团，3"端标记一个淬灭荧光基团。
在 PCR 扩增时，Taq 酶的 5"-3"外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步。
实时荧光定量 PCR 具有灵敏度高、操作简单、实时监测等优点，广泛应用于基因表达分析、基因突变检测、病毒检测等领域。
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荧光定量反应中的监测
•
指数期荧光信号的强度与PCR的产物成正比 常用的荧光探针和荧光染料：
SYBR Green I TaqMan 探针（MGB探针） 探针（ 探针） 探针 分子信标（ 分子信标（molecular beacon） ） LUX Primers
•
SYBR Green I
•结合于 结合于DNA双链的小沟中 结合于 双链的小沟中
log X0 = (- log(1+Ex) ) ﹡C(t)+ log Xc(t)
106 105
＊
104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线 荧光强度 循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线 循环数标准曲线 初始模板量对数
初始模板量越多， 初始模板量越多，C(t)值越小 值越小
•
优点
对目标序列有很高的特异性 干扰少，定量准确
•
缺点
设计复杂，对茎环结构要求高 只能用于一个特定目标基因 成本较高
LUX Primers信号采集 信号采集
每扩增一条DNA链就产生一个单位荧光信号
----变性过程：产生非特异性荧光 ----退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 ----延伸过程：产生特异性荧光，检测荧光信号
TaqMan(MGB) 应用----SNP 分析
TaqMan(MGB) 应用----等位基因分型
分子信标（ 分子信标（molecular beacon） ）
•茎环结构，与特异序列结合
环15-30个核苷酸，与目标序列互补 茎5-7个核苷酸，相互配对 荧光基团，淬灭基团
•优点
对目标序列有很高的特异性 干扰少，定量准确
与目标序列互补 • 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 • 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) • 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 • Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
TaqMan 探针
•
•
定量PCR实验基本流程
• • • • • • 1.准备模板(DNA或RNA，RNA反转录成cDNA) 2.PCR反应(DNA/cDNA+引物探针+PCR mix) 3.填样品表(样品名、孔位，样品类型、探针颜色) 4.设置参数(循环参数、反应体积、熔解曲线) 5.运行PCR，自动分析数据 6.进一步分析数据(基线、阈值、CT值、相对表达等)
结合双链DNA 发夹型杂交探针 水解型杂交探针 发夹型杂交探针
无 有 有 无
延伸 复性 任何阶段 延伸或者复性
绝对定量与相对定量
绝对定量与相对定量
绝对定量： 绝对定量：精确的计算初始反应的模板浓度
─ ─Leabharlann 病毒拷贝数 转基因的拷贝数
相对定量： 相对定量：计算初始反应模板的相对含量
─ ─ ─ ─
差异表达分析 芯片评估 转基因生物的检测 基因型检测
常用的荧光基团
FAM TET, VIC HEX JOE CY3 TAMRA CY3.5, Redmond Red Texas Red, ROX CY5 LC640 CY5.5, LC705
荧光监测小结
荧光试剂 原理 淬灭剂 信号检测
SYBR Green I 分子信标 TaqMan 探针 LUX Primers
MGB探针
MGB探针的特点
与传统的TaqMan探针比较，有以下优势：
─ 可以使探针的长度缩短，13～20个碱基 ─ 提高TM值：提高10℃左右 ─ 对富含AT的序列MGB探针的设计有很大的帮助 ─ 提高信噪比：1.无背景荧光 2.更好的淬灭效果 ─ 分辨率更高：常用于SNPs分析 ─ 杂交的稳定性和重复性大大提高
结合位点在两条引物之间
水解探针 与目标序列特异结合 不能有G 5’不能有G，3’必须封闭 不能有 必须封闭
•
优点
对目标序列有很高的特异性 设计相对分子信标简单 干扰少，定量准确
•
缺点
只能用于一个特定目标基因 成本较高
Taq Man探针信号采集
• 每产生一条DNA链，就切断一条探针 • 每切断一条探针，就产生一个单位信号 ----可以在循环过程中任一点检测荧光
n： 扩增反应的循环次数 ： Xn：第n次循环后的产物量 ： 次循环后的产物量 X0：初始模板量 ： Ex：扩增效率 ：
• 将C(t)和达到C(t)值时终产物的量Xc(t)带入上 式得：
log X0 = (- log(1+Ex) )*C(t)+ log Xc(t)
初始浓度的对数与循环数呈线性关系
Ct值和起始模板量的对应关系
SYBR Green I是一种只与DNA双链结 合的荧光染料。当它与DNA双链结合时， 发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧 光信号急剧减弱。
•优点
使用方便，无需复杂的序列设计 无序列特异性，可用于各种模板 便宜，灵敏
•缺点
与所有双链DNA （扩增子，引物 二聚体以及非特异性扩增产物）结合， 干扰定量结果
同一样品重复96次的实验结果显示，非理想状态下，PCR反应的终点 DNA拷贝数波动很大，重现性差，因此PCR的终产物量与起始模板量 之间没有线性关系。
PCR反应模式
Theoretical
Log Target DNA
理想的PCR反应： Xn=X0×2n 非理想的PCR反应： Xn=X0(1+Ex)n
绝对定量方法
标准品， 标准品，标准曲线
已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线
样品
与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值
unknown
104 103
相对定量
相对定量的目的 相对定量的目的
─
比较基因在不同情况下的表达差异（倍数关系）
•缺点
设计复杂，对茎环结构要求高 只能用于一个特定目标基因 成本较高
分子信标信号采集
环
茎
探针与DNA杂交时产生荧光
荧光素 淬灭剂
----变性过程：产生非特异性荧光 ----退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号 ----延伸过程：不产生荧光
LUX Primers
•
茎环结构，自身淬灭
引物 3’ 端用荧光报告基团标记 荧光基团，发夹结构淬灭
实时荧光定量PCR 实时荧光定量
张 庆
Agenda
荧光定量PCR的原理 绝对定量与相对定量 iQ5 特点和应用 iQ5软件
荧光定量PCR的基本原理 荧光定量 的基本原理
荧光定量PCR的发明 的发明 荧光定量
• 1992 Higuchi
─EB +外接光学系统
• 1996 ABI
─荧光定量PCR的诞生
相对定量的问题
─ ─
解决样品材料不均一造成的差别 解决加样过程中的差别
内标基因
─ ─ ─
内标通常是β-actin、GAPDH和18sRNA等看家基因 它们在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素 影响较小 对目的基因进行均一化：目的基因拷贝／每一个内标基因拷贝
常用的内标基因
使用β actin作为内参基因时要注意它在发育的不同阶段表达量不一致 使用β-actin作为内参基因时要注意它在发育的不同阶段表达量不一致
• 发展
─BioRad（MJ） ─Roche ─Strategen
什么是实时荧光定量PCR？
•
实时荧光定量PCR （Real-Time Q-PCR）
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线 对未知模板进行定量分析的方法。
•
相对定量与绝对定量
为什么要进行荧光定量PCR？
Real Life
X0：初始模板量 Xn：第n个循环的产物量 Ex：PCR反应的扩增效率
Cycle #
阈值与C(t)值
•
荧光阈值(Xct):
是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般将荧 光域值设置为 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。
•
C(t)值(n):
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历 的循环数被称为 Ct 值（ threshold value ）。
-dI
荧光强度
dT
Tm
温度
Tm值：DNA解链一半时的温度 Tm值 DNA解链一半时的温度
熔链曲线分析
代替凝胶对终产物分析
specific product
specific product Non-specific product
反应体系的建立及优化
• • • • • SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧 光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同
荧光共振能量转移(FRET)
当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收 光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波 长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧 光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际 相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。
TaqMan---水解型杂交探针
利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循 荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中 环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模 Ct值和标准曲线的分析对 环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模 板进行定量分析
能否采用PCR终产物进行定量？
实时荧光PCR相对定量方法 相对定量方法 实时荧光