基因克隆详细步骤说明书
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器
(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿
(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g
摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。
[实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。
3．冰上放置30分钟。
4．42℃水浴热激60秒。
5．冰上放置2分钟。
6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。
7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。 8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。 [实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。
实验二 质粒DNA的提取
[实验原理]
碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0‐12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
[仪器、材料与试剂]
(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅
(二)材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL 离心管3．枪头、枪
(三)试剂质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)
试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1／L 葡萄糖，5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)，1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，Solution II 0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution II I5mo1／L 醋酸钾，60 mL冰乙酸 11.5mL水，28.5mL TE缓冲液，10mmo1／L Tris·HCl1mmo1／L EDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RNA 酶A)，将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL 的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于‐20℃。
[实验步骤]
(一)提取质粒将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE‐31质粒和pUC18‐CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。
附：试剂盒说明书
3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1上海申能博彩生物科技有限公司bbst＠shl63．net www．https://www.360docs.net/doc/a415647670.html,
试剂盒组成：
组成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次）
Solution I(a) 5m1 10m1 25m1
Solution II(b) 10m1 20m1 50ml
Solution lll 20m1 50m1 2x50m1
Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1
TE(d) 5m1 10m1 40m1
3S Column 50支 100支 250支
Co11ection tube 50支 100支 250根
说明书 1份 1份 l份
注：
a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点：
● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。
实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)
1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。
2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II 和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。无需低温离心。注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。 10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或‐20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。
实验三 DNA的琼脂糖凝胶电泳
[实验原理]
DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪(二)材料1．pQE‐31和pUC18‐CAT质粒(三)试剂1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)配1000mL 50xTAE：Tris 242 g冰醋酸 57 mL0.5mol／L EDTA 200 mLpH 8.02．凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝 0.25％蔗糖 40％3．琼脂糖
4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL
5．250bp DNA 分子量标准
[实验步骤](一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：
琼脂糖凝胶浓度％ 线性DNA的有效分离范围／kb0.3 5—600.6 1—20O.7 0.8—10O.9 0.5—71.2 0.4—61.5 0.2—42.0 0.1—3
实验用1.2％琼脂糖。称取1.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1xTAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀即可。
(二)胶板的制备
1．取干净的有机玻璃内槽，用透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严，不能留缝隙)。
2．将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。
3．将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
4．待胶凝固后，小心地拔出梳子，撕下透明胶带，然后将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。
5．加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1‐1.5毫米。(三)加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。(四)电泳
1．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。
2．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。(五)染色
将电泳后的凝胶浸入溴化乙锭染色液(在200mL1xTAE缓冲液中加两滴2mg/mL的溴化乙锭储存液即可)，在脱色摇床上缓慢摇动下染色20‐30分钟。注意：溴化乙锭为致癌物，须戴一次性塑料薄膜手套操作，并小心污染环境。
[实验结果]在紫外灯(360nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带(在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，以防紫外线对眼睛的伤害作用)。
实验四 DNA重组
[实验原理]DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。 重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA 分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA 分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的连接条件是在12‐16℃，反应12‐16小时(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到粘性末端短暂配对结构的稳定。连接产物转化宿主细胞后，还须对转化菌落进行筛选鉴定，挑选出所需的重组质粒。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温摇床2．恒温水浴3．恒温培养箱4．小型高速离心机(二)材料1． 氨苄青霉素2． BamHI3． HindIII4． T4 DNA连接酶5． pQE‐31 和pUC18‐CAT 质粒6． 培养皿7． 接种针8． 金属涂棒9． 1.5mL 离心管10．酒精灯11．镊子、灭菌牙签等(三)试剂DNA琼脂糖胶纯化试剂盒（3S Spin DNA Agarose Gel Purification Kit，申能博彩公司）
[实验步骤]
(一)质粒DNA用实验二提取的pQE‐31和pUC18‐CAT 质粒。(二)制备重组DNA1．在灭菌的
1.5mL 离心管中，加入pQE‐31质粒10mL(2mg／mL)，2mL酶切缓冲液，1mL BamHI 和HindIII 酶 的混合液（各含10个单位），无菌双蒸水7mL，至反应混合物总体积为20mL，离心混匀，37℃反应过夜。2．在另一无菌1.5mL 离心管中，加pUC18‐CAT 质粒20mL，加入3mL酶切反应液，lmL BamHI和HindIII酶的混合液，无菌双蒸水补到30mL，37℃反应过夜。3．反应完毕后取5mL pQE‐31质粒的酶切液做电泳分析，检验酶切是否完全。酶切完全，进行下一步。4．将酶切处理的后pQE‐31和pUC18‐CAT 质粒，分别上样跑琼脂糖凝胶电泳（注意加DNA分子量标准）。电泳结束后用DNA琼脂糖胶纯化试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收DNA片段。前者回收的片段为3.5kb，后者为650bp。5．将回收的pQE‐31载体质粒均分为两份，其中一份与酶切后回收的CAT片段混合，做连接；另一份不加CAT片段，做对照。操作如下：在10mL DNA样品中, 加T4 DNA连接酶缓冲液1mL，T4 DNA连接酶1mL，14℃（室温）过夜，然后做大肠杆菌的转化。(三)转化感受态细胞1．用实验一制备的感受态细胞(‐20℃保存的)。2．在100mL的融化后处于冰浴的感受态细胞中，加入10mL连接产物，混匀，冰上放置30分钟，以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE‐31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。
[实验结果]过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。
附：试剂盒说明书
3S Spin DNA Agarose Gel purification Kit上海申能博彩生物科技有限公司WWW．https://www.360docs.net/doc/a415647670.html, 试剂盒组成：
试剂盒组成 K131(50次) K132(100次) K133(250次)
3S Co1umn Collection Tube Solution SN Solution B Wash Solution(a) TE 说明书 50支 50支 30m1 10m1 22m1 10m1 1份 100支 100支 60m1 10m1 2X 22m1 10m1 1份 250支 250支 150m1 25m1 5X 22m1 10m1 1份
注：(a)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持Wash So1ution中的乙醇含量。(b)TE pH8．0或者水均可以用于洗脱，测序样品请用水洗脱。试剂盒DNA回收率：
3S柱对100bp以上的DNA片段有较好的结合性能和回收率，回收率在60％以上。
主要用途：(a)TBE或TAE Agarose胶中回收DNA片段。
(b)从溶液中回收和浓缩DNA，去除反应体系中的蛋白质。
操作步骤从Agarose胶中回收DNA：
1．用Agarose胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀割下要回收DNA的琼脂块，放入1．5m1离心管中。判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长UV，在UV下照射的时间应尽可能短。
2．按每100mg Agarose胶加入400ml Solution SN，置于55‐65℃水浴中5分钟，中途混匀，至胶完全融化。胶融化后每400ml Solution SN加入100ml So1ution B，混匀。注意；高浓度的胶(1．5‐2％)，每100mg胶加入500ml Solution SN，加热融胶的时间延长到15分钟，以保证胶全部融化，胶融化后加入100ml SolutionB，混匀。
3．将3S柱放入2m1收集管中，将融化的胶溶液转移到3S柱中，让盖子开着，室温放置2分钟。盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温离心(10，000rpm)1分钟。
4．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，加入600ml Wash Solution，室温离心(10，000rpm)1分钟。
5．重复步骤4一次。
6．取下3S柱，倒掉收集管中的废液，将3S柱放入同一个收集管中，室温高速离心(10000 rpm)2分钟。
7．将3S柱放入一根新的1．5m1离心管中，在3S柱子膜中央加入30ml TE或水，室温放置2分钟。注意：提高洗脱温度有利于提高DNA的洗脱效率。也可以用预热的TE或水洗脱。 8．盖上离心管盖(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，10，000rpm高速离心1分钟，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于‐20℃备用。
从溶液中回收和浓缩DNA：
1．根据溶液的体积和所要回收DNA的含量，加入5倍体积的Solution SN。如果溶液的体积不足100ml，加TE补足到100ml，再加500u1 Solution SN和100 ml SolutionB，混匀； 2．以下同从Agarose胶中回收DNA的步骤3‐8。
实验五 转化后细菌菌落的快速裂解及质粒大小的检查
一般情况下，可以根据质粒的大小来确定它是否带有插入片段。以下方法足以产生在琼脂糖凝胶的单个泳道上加样所需的DNA量。
操作方法如下：
1. 使转化得到的细菌在含有氨卞青霉素的琼脂培养基(LB)上生长至菌落直径达1mm左右。
2. 用灭菌的牙签挑取单菌落的一小部分，在含氨卞青霉素的LB琼脂平板上划线。至少挑选20个左右的菌落照此划线，平板于37℃培养过夜，然后保存于4℃，直到相应菌落的回收。
3. 在划线培养的同时，将每一菌落的剩余部分用牙签一一转移并洗脱到事先加有50mL 灭菌的10mmo1／L EDTA(pH8.0)的1.5mL离心管中。
4. 每管加50mL配制的0.2mo1／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液，振荡30秒。
5. 于70℃温育5分钟，然后冷却到室温。
6. 加3mL 2mol／L KCl、0.2％溴酚蓝的溶液，振荡30秒。
7. 冰浴5分钟。
8. 用微量离心机于4℃以12000g离心3分钟，使细菌碎片的沉淀。
9. 制备1％的琼脂糖凝胶(5mm厚)，将50mL上清液加入样品槽内(5×2.5mm，长×宽)。
10. 染料迁移到凝胶全长的2／3—3／4时，于室温将凝胶放入溴化乙锭溶液(0.5ug／mL水溶液)中，浸泡20—30分钟。
11. 紫外灯下观察、拍照。
通过与同时点样的载体质粒的比较，不难发现重组子：比载体质粒迁移慢的很可能是含有插入片段的重组DNA。可从保存于4℃的重新划线的平板上挑出相应的菌落，接种于2mL含抗菌素的LB培养液中培养过夜，然后提取质粒，用做重组时相同的限制酶做酶切鉴定。重组子应该可以切下预期大小的插入片段。
实验六 GFP在大肠杆菌中的诱导表达和细菌蛋白的超声破碎抽提
[实验原理]把含有外源基因的表达载体转化的大肠杆菌在有相应抗菌素和诱导物的条件下培养，可以诱导外源蛋白在大肠杆菌中表达。利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将诱导培养的细菌的细胞壁破碎后，可使那些可溶性的外源蛋白释放出来，再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将外源蛋白分离纯化出来，供进一步的研究使用。有些过量表达的外源蛋白往往在细菌中形成不溶性的包涵体，细胞破碎、离心后这些包涵体出现在沉淀中，这样的蛋白需要用高浓度的尿素或SDS变性处理后才能溶解。超声破碎时要产生大量的热，会引起蛋白的变性。为了避免产生高温，超声时一般使用间隔的脉冲处理，而且应在冰浴中进行。本实验使用超声波破碎法抽提蛋白，因为表达的外源蛋白GFP（绿色荧光蛋白）比较耐高温，故省去了冰浴。
[仪器、试剂和材料]
1、pGLO转化的大肠杆菌
2、LB培养液
3、氨卞青霉素
4、L‐阿拉伯糖
5、硫酸铵
6、细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0)
7、恒温摇床
8、小型高速离心机
9、超声波组织细胞破碎仪
10、玻璃试管，三角瓶
11、1.5mL和5mL 塑料离心管
12、“枪”，枪头
[实验操作]
1、 大肠杆菌的诱导培养：
从Amp+/LB琼脂板上培养的pGLO转化的大肠杆菌中挑取2‐3个菌落，接种于Amp+（终浓度为50微克/mL）的5mL LB的玻璃试管中，培养两管，放恒温摇床中，37℃培养过夜。将其中一管保存于4℃，另一管所有5mL的培养物加到装有150mL的LB培养液的三角瓶中，加入L‐阿拉伯糖干粉150毫克和氨卞青霉素（终浓度为50微克/mL），恒温摇床上37℃振荡培养过夜。
2、 超声破碎抽提：
将诱导培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中，8000转/分离心5分钟，倾去上清液后，在沉淀上面再加培养物，继续离心，将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL 的细菌蛋白抽提液（100mmol/L NaCl，10mmol/L EDTA， pH 8.0），用枪吹打，使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上，将超声波破碎仪的金属头插到离心管中，调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门，打开仪器的电源，对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件：功率80瓦，工作2秒，间隔2秒，每一次处理5个循环。
4次处理后，8000转/分离心5分钟。取出离心管，在紫光灯下观察离心管底的沉淀，如果大量沉淀仍然为绿色，则说明破碎不够，继续按前面方法再超声处理2次，然后再离心。如果仅有很少的绿色沉淀或根本看不到，说明破碎完全。
小心吸出上清液，集中放到干净的5mL离心管中，体积不要超过4mL，逐步地加入少量硫酸铵干粉，使达到饱和，8000转/分离心5分钟。将离心管取出，放紫光灯下观察，沉淀中应该能看到明亮的绿色荧光。将上清液倾去，蛋白沉淀物4℃保存，或冷冻于‐20℃。
实验七 免疫双扩散检测抗GFP血清抗体
[实验原理] 在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物，这叫作免疫沉淀反应。当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线，这叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物，抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。
[仪器、试剂和材料]
1、磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
2、1.5%琼脂，PBS配置
3、兔抗GFP血清
4、GFP粗提物
5、微波炉
6、恒温培养箱
7、载玻片
8、自制打孔器
9、小塑料盒
10、针头、牙签
11、“枪”、“枪头”
[实验操作]
1、1.5%琼脂的配制:pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克琼脂，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
2、取干净的载玻片，平放于实验台（台面要水平），将融化的琼脂趁热加在载玻片上（约加4mL），使琼脂铺满整个玻片的表面（注意勿使琼脂流出玻片之外）。令其在室温下冷却凝固。
3、将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器（内径2‐3毫米）在琼脂上照样板打孔，做两朵“花”。用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。打好孔后，把凝胶的右下角切掉一小块，作为标记。
4、GFP抗原的稀释：用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀，加100mL的PBS使溶解，此为抗原的原液。取出原液15mL，在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释，直到稀释为1：16。
5、在左边一朵花的中央孔中加约15mL的免疫后兔血清，周围孔加不同稀释度的GFP粗提物。右边的一朵花除中央孔中加免疫前的兔血清外其余的与左边的相同。加样时将每孔加满即可，注意不要使溢出孔外。
6、在小塑料盒中铺一块滤纸，加少量水将滤纸浸湿，上面放两根牙签，将加好样的载玻片放在牙签上，盖好盒盖，放37℃温箱中过夜。
[实验结果的观察]
将载玻片从塑料盒中取出，在散射光的背景下（载玻片后方约15厘米处用手或深色物挡住）观察，或在特殊的装置上观察，在左侧的抗体孔与适当稀释的抗原孔之间可见白色的沉淀线，而右侧的对照则无。如果将载玻片放在紫光灯下观察，沉淀线会发出绿色荧光，这说明抗原‐抗体复合物中含有GFP。
实验八 SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳检测外源蛋白的表达
[实验原理]
SDS‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）是蛋白分析中最经常使用的一种方法。它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠（SDS）以及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原，肽链被打开。打开的肽链靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同的大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。 pGLO是将绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆在阿拉伯糖启动子之后的一种表达载体。携带有pGLO的大肠杆菌在含有相应诱导物和抗菌素的条件下培养，可以表达GFP，这比不加诱导物的同样的大肠杆菌在SDS—PAGE凝胶上要多出一条明显的条带。表达的蛋白也可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，紫光灯下可以看到诱导后的样品在凝胶上有绿色荧光条带出现。还可以通过免疫印迹染色（Western—blotting）的方法，用GFP的抗体检测表达的外源蛋白。
[仪器、材料和试剂]
(一)仪器1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子
2．电泳仪
3．干式恒温培养器
4．微波炉
(二)材料1． pGLO表达质粒转化的大肠杆菌的培养物：用阿拉伯糖诱导的和没有加阿拉伯糖诱导的(三)试剂1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8 (已加SDS )2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 (已加SDS)3．10％SDS4．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。5．10％Ap (‐20℃存放)6．2x样品缓冲液0.5mo1／L Tris·HCl pH6.8 2mL甘油 2mL20％SDS 2mL0.1％溴酚蓝 0.5mL2—b—巯基乙醇 l.0mL双蒸水 2.5mL7．5x电极缓冲液Tris 7.5gG1y 36 gSDS 2.5g双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用8．染色液：0.2g考马斯亮蓝R250 + 84mL 95％乙醇 + 20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用。9．脱色液： 酒精：冰醋酸：水＝7.5：7.5：85
[实验步骤]
1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：做1.0mm厚的胶。选择两侧的玻璃夹条为1mm 的玻璃板，将其夹条面朝上平放在桌面上，把灰色的U形硅胶夹条在上面摆好，然后把带两个“耳朵”的凹玻璃放在上面，使U形硅胶夹条平整、服帖地夹在两块玻璃板之间。小心地把这玻璃板“三明治”放到“提篮架子”上，用塑料的“楔子”夹紧，注意底部的U 形硅胶夹条在夹紧的过程中依然保持平整、服帖。在玻璃板“三明治”的夹缝加满蒸馏水，检验是否漏，如果漏水必须重装。
2．配制浓度为12％的分离胶 (凝胶浓度应根据被分离蛋白的分子量进行选择)，配方如下：双蒸水 3.3 mL 1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL Acr／Big(30％) 4.0 mL10％ SDS 100 µL TEMED 10 µL 10％AP 100 µL 总体积 10 mL （刚好灌制两块胶）混匀后加入两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水(在胶面上加蒸馏水称水封，目的是保持胶面平整，并防止胶与空气接触，影响胶的聚合)，室温放置，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），将水封倾去。这时可以开始配制4％的浓缩胶，配方如下：双蒸水 1.8 mL0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mLAcr／Bis (30％) 0.4 mL10％ SDS 30 µLTEMED 5µL10％Ap 30µL总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶）混匀后加入到"三明治"玻璃板的夹缝中，然后在把1mm的梳子插进浓缩胶中，注意在
梳子和浓缩胶之间不要留有气泡。如果发现有较大的气泡，一定要想法去掉（可以插拔梳子或指弹气泡处的玻璃等），否则会影响电泳结果。待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。如果发现拔出梳子后形成的加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理，使之齐整。 3．细菌培养物SDS‐PAGE样品的制作：同时做L‐阿拉伯糖诱导的和未加L‐阿拉伯糖的两个大肠杆菌样。取细菌培养物1.5mL加到1.5mL小离心管中，12000r/m离心3分钟，去上清。在离心沉淀中加约等体积的蒸馏水，用枪头小心地吹打，使细菌充分悬浮，直到没有明显的小团块，然后加入等体积的2×样品缓冲液，在100℃沸水浴(或干式培养器)中保温5min。此时如用枪头吸取样品，会发现非常粘稠，呈鼻涕状，这是因为有样品中含有大量DNA的结果。要用胰岛素注射器将样品从极细的针头中打出，反复多次才能将DNA分子打断，使样品变得不再粘稠为止。将样品14000r/m离心5分钟，使不溶物沉淀下来，小心吸取上清加样。电泳样品的处理直接关系到电泳结果的好坏，一定要认真做样，否则跑不出好胶来。 4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板“三明治”从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉。去掉夹条后在凝胶的底部会留下一空隙，此空隙要用2%融化的琼脂填满，否则在玻璃板浸到电极缓冲液后空隙中的空气将很难彻底排除掉，电泳时会明显影响导电，严重时会使整个电泳失败。琼脂封底时注意不要产生气泡。
5．电泳槽组装：封底后将玻璃板“三明治”凹玻璃面向内重新装到“提篮架子”上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。加液时要使内外槽中的液面基本等高，内槽液的液面要高出玻璃板“三明治”的凹玻璃至少5mm，以保证能够导电，且电场均匀。
6．加样：按事先设计好的顺序与加样量依次加样。在样品的浓度未知的情况下，同一样品可加一梯度，即每一泳道的加样量依次减半。这样，在做第二次电泳时可以其作为参考，正确加样。蛋白分子量标准可以加在靠中间的加样孔中，也可加在离边的第2道处（最靠边的一道样品往往会明显跑斜）。
7．电泳：将电泳槽的盖子盖上，把电泳槽的两个电极接到电泳仪上（注意电极不要接错），然后接通电源。先将电压调到80V，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，暴露出胶面。将浓缩胶部分去掉不要，分离胶放到塑料盒中染色。 8．染色和脱色：凝胶在考马斯亮蓝染色液中染色20分钟（摇床上缓慢振荡），然后倾去染色液（染色液回收，可反复用数十次），用自来水洗几下，去掉凝胶上和塑料盒中的染色残液，加脱色液脱色（摇床上缓慢振荡），1小时后换一次脱色液，振荡脱色过夜。彻底脱色后的凝胶蛋白条带清晰，背景透明干净。这时可以将凝胶拍照或用扫描仪进行扫描，作为永久记录。
[实验结果]
染色后的聚丙烯酰胺凝胶上可见许多大大小小的条带。比较两个大肠杆菌样品，经阿拉伯糖诱导的与未加阿拉伯糖诱导的，前者在约25kD处明显多一条带，这就是GFP所在的位置。
实验九 GFP的免疫印迹
[实验原理]免疫印迹（Western blotting 或 Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分。第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体染色后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（Ap）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）染色，再加酶的底物显色，通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。为了使初学者能够在实验过程中观察到所要检测的目的蛋白，本实验使用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳，以保持GFP的天然活性，利用荧光对其进行追踪。此外，实验中用国产的HRP标记的蛋白A取代第二抗体，以节省费用。蛋白A是从细菌分离的一种能识别多种动物IgG的蛋白，在许多场合它都可以作为第二抗体的替代物。同样是为了节省费用，实验中用醋酸纤维素膜（AC膜）代替硝酸纤维素膜（NC膜），这样要便宜得多，而效果却无大差别。
第一部分：GFP抽提物在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳
非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳，除试剂中不含SDS及蛋白样品不加热处理外，其余的与SDS‐PAGE几乎相同。因为要做免疫印迹，电泳结束后，凝胶不染色，而是做转移电泳。 [仪器、材料和试剂]
(一)仪器与器材1．垂直板电泳槽及配套的玻璃板，梳子2．电泳仪3．微波炉4．小型高速离心机5．专用紫光灯（BIO‐RAD公司）6．枪，枪头，1.5mL 离心管
(二)材料1．蛋白样品：GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀(三)试剂1．1.5mo1／L Tris·HCl pH 8.8 2．0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 3．30％Acr／Bis 29.2g Acr + 0.8gBis，用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放。4．10％Ap (‐20℃存放)5．2x 非变性胶样品缓冲液：0.125 mo1／L Tris·HCl pH6.8 20％ 甘油 0.01％ 溴酚蓝 6．5x电极缓冲液Tris 7.5gG1y 36 g双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用
[实验操作]
1．装配做胶用的玻璃板"三明治"：
2．做胶：先配制浓度为12％的分离胶，配方如下：双蒸水 3.3 mL 1.5mo1／L Tris·HCl (pH 8.8) 2.5 mL Acr／Big(30％) 4.0 mL TEMED 10 μL 10％AP 100 μL 总体积 10 mL （刚好灌制两块胶）灌分离胶胶后在胶面上加水封，等胶自然凝聚后（此时在胶面与水封之间可见清晰的界限），开始配制4％的浓缩胶，配方如下：
双蒸水 1.8 mL0.5mo1／L Tris·HCl pH 6.8 0.75mLAcr／Bis (30％) 0.4 mLTEMED 5μL10％Ap 30μL总体积 3.0 mL （够做两块板的浓缩胶）
灌浓缩胶、插1mm的梳子。待浓缩胶凝固后，小心地拔出梳子。如果拔出梳子后加样孔之间的间隔发生扭曲，用注射器的针头小心加以整理。
3．非变性凝胶电泳蛋白样品的制作：在GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀中加2x 非变性胶样品缓冲液100微升，用枪头吹打，使沉淀溶解，将样品液转移到1.5mL离心管中，12000r/m 离心3分钟，取上清液加样。
4．琼脂封底：做好胶后，把玻璃板"三明治"从架子中取出，将两玻璃板之间的硅胶夹条去掉，用2%融化的琼脂填满胶底的空隙，注意不要产生气泡。
5．电泳槽组装：封底后将玻璃板"三明治"凹玻璃面向内重新装到"提篮架子"上，固定好后，将整个部件放到电泳槽的外壳中，然后加电极缓冲液。
6．加样：取蛋白溶液离心后的上清液加样，加成一个梯度，即每一泳道的加样量依次减半。
7．电泳：先将电压调到80V，当样品进入分离胶后，调节电压使恒定在150V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5cm时，关掉电源，停止电泳。
8．将玻璃板从电泳槽中取出，小心地用旧的电话卡撬开两玻璃板，小心地用塑料牙签将凝胶从玻璃上剥离下来，使凝胶贴在事先准备好的一张比胶面略大的滤纸上。操作时要徐缓，小心不要把胶弄破。
第二部分：免疫印迹染色
[仪器、材料与试剂](一)仪器与器具1．电泳仪(要求为大电流低电压)2．电泳转移槽及转移夹3．水平摇床4．小塑料盒5．镊子6．搪瓷盘(二)材料1．醋酸纤维膜2．滤纸3．一次性塑料手套 (三)试剂1．转移电泳缓冲液25mmo1／L Tris，192mmo1／L 甘氨酸，20％甲醇，pH 8.36.05gTris + 28．83g Gly + 400mL甲醇，用dH20溶解并定容至2L2．PBS贮存液(10xPBS)0.2mo1／L 磷酸缓冲液，PH＝7.4，含8.7％ 的NaCl3．PBS缓冲液：10xPBS贮存液用重蒸水10倍稀释4．封闭液：PBS + 5％脱脂奶粉5．漂洗液：PBS + 0.2％Triton X‐1006．丽春红染色液：4％三氯醋酸，1％丽春红 7．一抗：兔抗GFP血清，用PBS适稀释50‐100倍8．辣根过氧化物酶标记的蛋白A (HRP‐pA)
9．DAB显色液：DAB 1mg，溶于5mL的50mmol/L 的Tris‐HCl（pH 7.4‐7.6）中，然后加入50微升的0.5％的过氧化氢。显色液不稳定，要在临用前配制。
[实验操作]（接第一部分的实验操作8往下做）
1．将醋酸纤维素膜（AC膜）事先裁成比需要转移的凝胶块略大的小块。
2．在搪瓷盘中加入转移电泳缓冲液，将AC膜在转移电泳缓冲液中浸泡，使完全浸透。同时把两块海绵也在转移电泳缓冲液中浸透。
3．将转移夹打开，置搪瓷盘中，在有黑色标记的一半上放上一块已浸透了转移电泳缓冲液的海绵，把贴在滤纸上的凝胶块滤纸面向下放在海绵上，在转移电泳缓冲液中使AC膜紧贴在凝胶上，切勿使AC膜与凝胶间留有气泡。再把一张滤纸浸透，小心地放在AC膜上，其上再放上另一块海绵。将转移夹合上，夹紧，做成“三明治”。
4．转移电泳槽中放入转移电泳缓冲液，将“三明治”夹放入，使凝胶块（即黑色的一面）朝向负极，AC膜朝向正极，切勿放错方向，否则蛋白将跑到溶液中，而不是转移到膜上。 5．接通电泳仪电源，使电流达到100‐150mA，电泳转移过夜。
6．转移电泳完毕，将转移“三明治”夹从转移电泳槽中取出，将夹子打开，用镊子捏住AC 膜的一角，将AC膜有蛋白的一面朝上放在一块干净的滤纸上。于暗处在紫光灯下，仔细观察发绿色荧光的条带的位置，用铅笔点一些点子，标出它。
7．将AC膜蛋白面朝上置于小塑料盒中，加丽春红染液10‐20mL，染色3分钟，用蒸馏水轻轻漂洗数次至背景红色消失。这时应该可以看到转移到膜上的蛋白条带。
8．倾去漂洗的蒸馏水，在小塑料盒中加入封闭液10mL，室温下于脱色摇床上缓慢振荡1小时。
9．倒出封闭液（弃去），用PBS洗一次，加PBS稀释的一抗溶液5mL，室温下缓慢振动3小时或过夜。
10．取出AC膜，用PBS漂洗液洗3次，每次5分钟(手摇或脱色摇床上振荡)。
11．放入HRP标记的蛋白A溶液中，在室温下于脱色摇床上缓慢振动3小时或更长时间。 12．取出AC膜，用漂洗液洗涤，方法同10。
13．加入DAB显色液5mL，轻轻晃动，显色数分钟或更长的时间，直到黄褐色的条带清晰可见，加入蒸馏水漂洗几次，洗去显色液，终止反应。注意主要的显色条带是否与事先用铅笔标记的位置相重合。
14. 将AC膜夹在两张干滤纸中间，将水分略微吸干，然后扫描或拍照，记录实验结果。
实验十 非变性条件下GFP的制备聚丙烯酰胺凝胶电泳
[实验原理]制备电泳与普通的分析电泳在原理上没有什么不同，只是用的凝胶厚些、加的样品量大些罢了。因为制备电泳的胶厚，电泳时有个散热问题，电泳后还有把所要分离的蛋白从胶中洗脱下来的问题。为了提高制备电泳的效率，有些公司（如BIO‐RAD）生产了专为制备电泳设计的电泳槽。我们的实验用非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备GFP，在整个的电泳过程中GFP始终维持其天然活性。电泳结束后，不用染色处理，在紫光照射下可以很容易地将发绿色荧光的GFP条带从凝胶上切下来。
[实验操作]
1、用1.5毫米夹条的玻璃板做胶，分离胶的浓度仍为12%，注意用不含SDS的非变性系统缓冲液配胶，配浓缩胶时也同样。
2、做浓缩胶时不加梳子，而是做分离胶那样用水封顶，使浓缩胶的顶部形成一平面。
3、制备电泳的蛋白样品与前次免疫印迹的相同，用非变性的样品缓冲液做样，样品不加热处理。上样前要充分离心(1.5mL离心管，12000rpm，5分钟），勿使所加样品中含有沉淀。
4、上样量0.2‐0.4mL，上样后要使样品的高度在整个浓缩胶面上均匀分布。
5、在样品完全走进浓缩胶前电流不要调得过大，以免样品发热，产生明显的对流。待样品完全走进浓缩胶后可以加高电压，但不要超过150V，以防过热。
6、电泳结束后，取下并打开玻璃板“三明治”，在紫光灯下用刀片将发绿色荧光的条带从胶上切下，切成小段，放于干净的1.5mL离心管中，冷冻保存。
DNA 指纹技术（DNA fingerprinting）
一、 主要仪器与试剂
仪器：水浴锅、恒温摇床、暗合、X光片、同位素操作屏蔽设备、暗室洗片设备、尼龙膜、吸水纸
试剂：
1、ACD液的配制： 柠檬酸 0.48 g
柠檬酸钠 1.32g
葡萄糖 1.47g
加水至100ml，高压灭菌
2、SET的配制：1 M Tris‐Hcl (PH8.0) 2.5 ml250 mM EDTA‐Na2 (PH8.0) 25ml5 M Nacl 5ml加入ddH2O至250ml , 高压灭菌
3、蛋白酶K：10mg蛋白酶K + 1ml ddH2O, 充分溶解后，‐20℃保存
4、20%SDS： SDS 5g 加入ddH2O 定容至50ml
5、1M Tris‐Hcl (PH8.0)：121.0g Tris + ddH2O 至800ml溶解，用纯的HCL调节PH 8.0 定容1 L。（灭菌）
6、0.5 M EDTA‐Na2 (PH8.0)EDTA‐Na2 186.1g +800 ml ddH2O于磁力搅拌器上溶解，用NaOH 调节PH 8.0，定容1 L.。（灭菌）
7、5M Nacl溶液29.22g Nacl +80 ml ddH2O 溶解后，定容100ml。（灭菌）
8、5×TBE缓冲液54g Tris + 27.5g 硼酸+20 ml 0.5M EDTA (PH8.0)+800ml ddH20 , 定容 1 L。
9、设计的内切酶（含有各种的Buffer）
10、琼脂糖、HCL、NaOH
11、50*TAE 242g Tris + 700ml ddH2O 溶解，+100ml 0.5M EDTA(PH8.0)+57.1的冰醋酸；定容1L。
12、10*BPB0.2M EDTA，20%聚蔗糖，0.25%二甲苯青FF，0.25%溴酚兰
13、变性液1.5mol/L Nacl ,0.5mol/L NaOH14、杂交液100g SDS + 50ml蒸馏水加热溶解厚后， 在加入10ml 10*blotto(至终浓度为1*blotto ,1%脱脂牛奶，0.02%叠氮钠)，5ml 20*SSC(至终浓度为 1*SSC) +35ml蒸馏水
15、20*SSC175.3gNacl + 88.2g柠檬酸钠 + 800ml ddH2O,用浓的NaOH调节PH7.0之后，定容1L。灭菌
二、实验步骤
1、基因组DNA的制备（方法同RAPD技术）
2、基因组DNA用限制性内切酶酶切（反应条件可根据试剂要求变化）
（1） 在一个新的干净的1.5ml的离心管内加入以下的成分：8~10 ug DNA , 1ul 酶（10U以上），2ul 10*Buffer ,2ul 40 mmol/L 三氯亚精胺，补加灭菌的双蒸水至20ul。
（2） 在内切酶的适宜温度下反应足够的时间。
（3） 取出酶切的样品于4℃下保存备用。
3、制备琼脂糖凝胶和酶切产品的电泳
（1）使用TAE缓冲液制备0.8%的琼脂糖凝胶（大胶用，2cm厚度，约用300ml）。
（2）向酶切样品加入1/10体积的10*BPB，充分混匀。（上孔加样，记住加入DNA Marker） （3） 加样（5~10min）后，20V恒压电泳48h左右。
4、进行Southern转移
(1) 电泳完成后，将凝胶连同作胶板一起放入一个 方型的塑料盒内，倒入500ml的0.2mol/LHcl处理25~30min.间断性摇动混匀（5min/次）。
（2）倒掉稀盐酸溶液，加入灭菌的双蒸水洗涤一下凝胶，倒掉水；加入500ml的变性液浸泡30min, 间断的摇动。
(3)倒掉变性液，加入500ml 0.5倍的稀释变性液（0.75mol/L Nacl ,0.25mol/L NaOH）浸泡20min，间断的摇动。
(4)将凝胶移到一块干净的玻璃板上,切掉凝胶多余的无用部分,将已经裁剪好的尼龙膜平铺在凝胶表面(先在0.5的变性液中浸泡),用玻棒轻轻压其表面赶走气泡.
（5）将三张稍大于膜的滤纸放于膜上，每放一张就应用玻棒将其表面的气泡赶走（滤纸应先在0.5的变性液中浸泡）。
（6）将一打（约4~5cm厚的）吸水纸放在滤纸上,在将一块玻璃板放在吸水纸的上面,压紧两块玻璃板迅速翻转,并去掉胶面上的玻璃.
（7）在胶面上放置三张较凝胶大的滤纸（先于0.5倍的变性液内处理），并用玻棒轻轻的赶走气泡。（为了防止上下的滤纸相互接触，可先用保鲜膜在刚翻转时将外露的滤纸和吸水纸封住）
（8）将整个的装置用保鲜膜封好（防水分的蒸发），并压上一块玻璃板；持续转移6~8h，取出尼龙膜放在2*SSC中浸泡20min ,然后放在一张滤纸上烘干，即可备用。
5、随机引物法标记小卫星探针
6、预杂交、杂交、洗膜
（1）将预热的杂交液（60℃）倒入塑料盆中，将待杂交的膜一张张的放入杂交液。恒温（60℃）摇床震动6h左右。
（2）将标记的放射性探针于沸水中处理5~10 min以变性DNA，然后迅速取出插入冰中。 （3）将尼龙膜取出，按5*105cpm/ml的浓度加入变性的探针，缓慢的摇匀，然后将膜重新放入杂交液中，恒温（60℃）摇动15h。
（4）将膜取出放入1*ssc 溶液中室温洗涤5min，然后转入洗膜液中（1*SSC、.1%SDS）于（60℃）洗涤30min 更换洗膜液重复一次。
（5）将膜放入1*SSC于室温下洗涤5min。取出平铺于干燥的滤纸上，待倒无水珠时，用保鲜膜包好备用。
7、放射自显影（具体根据暴光盒决定）
（1）在暗室内打开X光暴光盒，加入一张增感屏，X光片放在膜上，另一张增感屏光滑面朝下放在X胶片上，盖紧盒子，放入‐70℃放射自显影暴光。
（2）暴光完成后，在暗室洗片，X光片在显影液中12min，1.5%冰醋酸溶液（停显液）中10S，再装入定影液中5min，最后放入流水冲洗20min，晾干后即可分析。
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.360docs.net/doc/a415647670.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
4植物基因克隆的策略与方法
4植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆确实是利用体外重组技术,将特定的基因和其它DNA顺序插入到载体分子中。基因克隆的要紧目标是识不、分离特异基因并获得基因的完整的全序列,确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传操纵关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速进展,使人们把握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术差不多克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆,育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等,1995;舒群芳等,19 97),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。 1功能克隆(functional Cloning) 功能克隆确实是按照性状的差不多生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆(Collis,1995)。其具体作法是:在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或基因组文库,DNA文库中基因的选择按照情形要紧可用二种方法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针 从cDNA库或基因组文库中选择编码基因,(2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针,从cDNA入载体表达库中选择相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,专门多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst1和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,能够提升对灰质葡萄孢(B otrytis cinerce)的抗性,在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因通过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性专门有意义(H ain等,1985)。Kondo等1989年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DN A做了克隆和序列分析(Kondo等,1989)。周兆斓等构建了水稻cDNA文库,分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的cDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化,使害虫因 缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic virus)(CMV),并克隆了编码该
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
植物基因克隆实验指导
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
拟南芥基因克隆的策略与途径
拟南芥基因克隆的策略与途径 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序 已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物 的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字 花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各 国政府的重视。 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功 能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的 几种常用方法介绍如下。 1、图位克隆 Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms. 图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对较稳定的基因座，在利用分离群体的遗传连锁分析或染色体异常将基因伫到染色体的1个具体位置的基础上，通过构建高密度的分子连锁图，找到与目的基因紧密连锁的分子标记，不断缩小候选区域进而克隆该基因，并阐明其功能和生化机制。 用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图1）。
实验六 基因克隆及序列分析
实验六、基因克隆及序列分析 1.目的片段回收 取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 μl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 μl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 μl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。 2 片段连接反应 采用pGEM? -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。取1.5 μl PCR产物，加入0.5 μl T4 DNA ligase，0.5μl T Easy Vector，2.5 μl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4?C冰箱过夜。 3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。 取2 μl连接反应物转到1.5 ml离心管中，冰上保存待用。从-70℃冰箱中取出感受态细胞置于冰上，待其刚好融化时（约5 min）小心吸取30-50 μl转入到离心管中，冰上静置20 min。42℃水浴中热激90 s（不要摇动）。迅速放回冰上2 min，然后加入LB培养基（室温）400 μl，37℃摇床培养1.5 h（150 r/min）。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/a415647670.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.360docs.net/doc/a415647670.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1mlTrizol加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷 (3) 加200 μL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； (4) 4o C，12,000g，离心15 min； (5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min； (6) 4o C，12,000g，离心10 min； (7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗 (8) 4o C，7,500g，离心5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。 此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（μg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成 纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5×gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42o C，2min； RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反应液10μL RNase Free dH2O 补齐至20μL 操作条件为： (1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。 3 PCR 按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下： Premix Taq25μL 模板5μL 引物1 (10 μM) 1μL 引物2 (10 μM) 1μL ddH2O 18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。 PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。
基因克隆基本实验方法
重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L A TP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
PCR技术克隆目的基因全过程
实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。【实验用品】 1．材料：重组质粒DNA作为模板 2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3．试剂： ①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。 ②MgCl2 ：25mmol/L。 ③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 ④Taq DNA聚合酶5U/μl。 ⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
基因克隆方法步骤
克隆步骤 一、目的片段的回收纯化 1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul 平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。 2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3．向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块 充分溶解。 4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收 集管中。 5．向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。 6．重复步骤5. 7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。 8．将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的无菌水。室温放置2min，12000rpm离心2min， 收集DNA溶液。(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次) 9．取2ulDNA加入loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。 二、目的片段与载体的连接 1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下： 目的片段 4 .5μL pMD19-T simple Vector 0.5μL SolutionⅠ 5 μL Total 10 μL
4植物基因克隆的策略与方法
植物基因克隆的策略与方法 基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它ＤＮA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，19９５;舒群芳等,199７),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。?1功能克隆（funｃtｉonal Cloｎing) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆（Colｌis,1995)。其具体作法是：在纯化相应的编码蛋白后构建cDＮＡ文库或基因组文库,DNＡ文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,（2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从ｃＤNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。 Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst１和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对
灰质葡萄孢（Bｏtrytiｓ cineｒce)的抗性，在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hａin等,１985)。Kondo等198９年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989）。周兆斓等构建了水稻ｃDNA文库，分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的ｃDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化，使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucｕmｂer Mｏｓaic virus)（CMV)，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,19８９)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(ｐotato ｖｉruｓ X， pvx）,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因，并将外壳蛋白基因转入马铃薯中，以期获得抗pｖｘ病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。病毒外壳蛋白（Ｃoａt proteiｎ cp)基因的成功克隆，可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Proteｉn Mediated Rｅsiｓtａnｃｅ CPMR)或病毒ＣP-ＲN Ａ介导的抗性。Vａｎｋａn 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9，可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物（Van Ｋan 等,１9９1)。我们１9９5年构建了天麻cDＮA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的ｃDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳 等,1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、