胎牛血清制备修订稿
牛羊布病的诊断及其防治修订稿
牛羊布病的诊断及其防治WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-牛羊布病的诊断及其防治牛羊布病存在较高的发病率，而且传染性也较强，在多种传播方式影响之下不仅会使牛羊等牲畜出现病症，还会在一定程度上影响人体健康。
在养殖牛羊产业当中，一旦出现牛羊布病其产奶量会大幅度减少，而且牛羊生殖系统还会出现不同程度的发炎以及病变等情况，进而就会加大流产的可能性，这对于养殖产业来说会直接降低经济效益。
1 牛羊布病诊断流行特点及病理变化牛羊布病主要病原就是布鲁氏菌，而这一病菌游戏对于多种动物体易感，其中牛羊更是易感性较强，相比较而言，母畜比畜发病率要高、成年畜比幼年畜发病率要高。
牛羊布病传统然主要是带有细菌的动物体，传染途径则是以呼吸道、消化道为主，此外也有经皮肤以及破损黏膜传染的案例，流行特点则是以地方性流行为主。
牛羊布病病理变化主要表现为生殖器官炎性坏死，淋巴结、肝、肾、脾等器官形成了布病结节，有的病牛羊还会存在可见关节炎。
临床诊断牛羊布病需要按照流行病学以及临床表现进行诊断，而要想确诊还要经过血清学诊断才行，所以，实验室诊断是牛羊布病诊断的关键。
在实验室诊断时经常会使用布病虎红平板凝集试验来进行初步筛选，之后就会使用试管凝集试验来进行确定，在初步筛选试验的时候，如果表现为阳性而且还存在流行病学史以及临床症状，亦或者是试管凝集试验呈现阳性的话，就可以将其判定为牛羊布病。
2 牛羊布病防治措施预防措施做好免疫接种在对牛羊布病进行预防的时候，首先要积极开展免疫接种工作，在免疫接种过程中需要按照地方疫情流行情况来对免疫接种区域进行划分，尤其是对于疾病多发地区更是要加??检疫。
此外，在免疫接种的时候，对于牛疫苗可以选择29号布鲁氏菌苗、粗糙型M111菌苗；而羊则可以使用V 号布鲁氏菌苗。
最后，在免疫接种完成之后，还需要定期组织效果监测，确保免疫接种的有效性。
胎牛血清正确的溶解方法
胎牛血清正确的溶解方法胎牛血清 (Fetal bovine serum, FBS) 是一种常用的细胞培养基组分，具有提供细胞生长所需的营养物质和激素的作用。
正确地溶解和使用胎牛血清对于维持和促进有效的细胞培养非常重要。
下面将介绍胎牛血清的正确溶解方法，以确保获得最佳的培养效果。
1.选择适当的容器和容量：根据实验需要选择一个干净、无菌、具有足够容量的容器。
常见的选择包括离心管、烧杯或试管。
2.注意无菌操作：在溶解胎牛血清前，确保所有操作都在无菌条件下进行。
进行洗手，并将所有使用的仪器和材料进行灭菌处理。
3.降温：将所需量的胎牛血清从冰箱中取出，放置在冰上或在冷冻块上预冷数分钟。
这将有助于缓慢解冻和防止蛋白质的降解。
4.缓慢解冻：将预冷的胎牛血清缓慢解冻至室温。
确保避免急速解冻，以免破坏血清中的蛋白质。
5.预先过滤：在血清完全解冻之前，将其过滤以去除可能存在的细菌和颗粒。
可以使用0.22微米或更小的孔径的过滤器进行过滤。
将有限量的胎牛血清注入过滤器中，轻轻挤压滤器以过滤血清。
6.活化：在细胞培养基中加入所需量的胎牛血清。
通常胎牛血清的添加量是细胞培养基总体积的10-20%。
慢慢滴加血清，同时轻轻搅拌。
避免快速注入，以免造成泡沫的形成。
7.细胞适应：在初始使用胎牛血清的细胞培养中，请确保适当的细胞适应。
这可以通过逐渐增加细胞培养基中的血清浓度来实现。
例如，从1%的血清浓度开始，每隔几天增加1-2%，直到达到所需的血清浓度。
8.储存：如果未使用完全部的胎牛血清，在保存之前请确保将其保存在-20°C或更低的温度下。
储存过程中要小心避免血清的变质，最好将其分装在无菌的小容器中，以减少多次开封所引起的污染和变质的风险。
总结起来，正确的溶解胎牛血清的方法包括降温、缓慢解冻、过滤、活化和细胞适应。
正确的操作流程和无菌操作可以确保血清的质量和细胞培养的成功。
胎牛血清对细胞培养具有重要的作用，通过遵循正确的操作步骤，可以更好地利用胎牛血清来支持细胞生长和实验研究。
胎牛血清解冻和灭活
胎牛血清解冻和灭活解决血清使用中的常见问题1、如何储存和解冻血清才不会使产品质量受损,将血清从冷冻箱取出后，先置于2,8?冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。
但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
长时间储存在2,8?时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。
因此，推荐在-20?以下储存血清，并避免反复冻融。
我们建议血清应保存在-2O?。
若存放于4?时，请勿超过一个月。
若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
2、血清中包含絮状沉淀，它们是什么，怎么处理,沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。
这是正常特性，不会影响产品性质。
要除去沉淀，离心血清(400g，1-2分钟)或者简单的让其沉淀在瓶子底部，将血清小心的转移到另一个无菌瓶里(一般不建议采用过滤的方法除去沉淀，因为沉淀会堵塞滤膜而无法过滤)。
大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37?就会再溶解。
所以，使用产品时要摇动并加热血清至37?，沉淀会自然消失。
3、实验室如何选择适合的血清,国内一致认为HYCLONE的血清是最好的，但是根据我在北美的经历，国外一般认为GIBCO比HYCLONE好，所以并不是价格决定质量，但是总的来说这两种价格普遍偏贵，一般不是太娇气的细胞，国产的就够用了。
此外，由于国内HYCLONE，GIBCO并没有生产线，我们只能从代理商那里买，而代理商又鱼龙混杂，所以买到假货的可能性也很大。
所以，我一般会从直销员那里买血清，有的国外生物公司由于刚刚进入中国，知名度不高，但是其实在国外已经做得很不错了，如Wisent等，他们在国内有办事处，我会从那里拿，血清的品质和HYCLONE不相上下，但价格相对优惠很多。
4、如何避免血清中产生沉淀,按如下操作可避免沉淀的产生:(1)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。
(2) 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
牛血清分类有哪些？
牛血清分类有哪些？
血清是一种性状、外观浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。
【胎牛血清】（Foetal Bovine Serum，简称FBS）：是采自5-8个月胎龄牛胚胎中的胎血。
此时胎牛各脏器正处生长分化阶段，血中含有丰富的生长发育因子，非常适合各种细胞的培养，一旦胚胎发育完全这些因子自动消失。
因此8个月胎龄以上的牛胚胎，已接近足月，不能作为胎牛血清的原料来使用。
【新生牛血清】（Newborn Calf Serum，简称NBCS）：采自出生一天~一周内的新生牛；
【小牛血清】（Calf Serum）：采自出生10－30天的小牛；
【成牛血清】（Adult Bovine Serum，简称ABS）：采自成年牛收全血后分离得到血清。
所有血清出厂前均应经过严格质控，并附详细《检测报告》。
本生详解—胎牛血清要怎么用才能有理想效果-
本生详解—胎牛血清要怎么用才能有理想效果?本生详解—胎牛血清要怎么用才能有理想效果?胎牛血清是一种常见的细胞培养基添加剂，可以提供生长因子、细胞黏附蛋白、酶等多种必需物质，促进细胞生长和增殖。
在使用时，提醒：需要掌握以下几个方面的使用方法。
1、正确储存胎牛血清这是一种易变质、易受污染的生物制品，需要在储存和使用过程中注意保持其质量和纯度。
储存时应放置于-20℃以下的冰箱中，避免热量和湿度影响其质量。
使用前应先将血清缓慢解冻，并进行消毒处理，以确保其纯度和质量。
2、正确添加在细胞培养基中添加血清时，需要根据细胞类型和培养基配方等因素，选择正确的添加量和添加时间。
添加量一般为10%~20%，添加时间一般为细胞接种后的24小时左右。
过多或过少的添加量会影响细胞生长，导致细胞凋亡或分化。
3、选择适当的胎牛血清在使用时，需要选择适当的血清类型和来源。
不同的血清来源和类型具有不同的物理性质和生化成分，对不同的细胞类型和培养条件有不同的适应性。
因此，在选择血清时需要根据实际需要选择合适的类型和来源，以确保细胞生长的质量和效果。
4、注意血清的批次问题这是一种生物制品，其纯度和成分可能存在一定的波动，不同批次之间可能存在差异。
因此，在使用血清时需要注意批次问题，尽量在同一批次中使用，以避免批次间的差异对细胞生长的影响。
5、注意血清的卫生问题在使用时需要注意卫生问题。
使用前应先进行消毒处理，避免污染。
在使用过程中，需要保持卫生环境，避免细菌和病毒的污染。
同时，尽量避免使用过期的血清，避免影响细胞生长效果。
胎牛血清是一种常用的细胞培养基添加剂，使用方法非常重要。
在使用时，需要注意储存、添加、选择、批次、卫生和价格等方面的问题，以保证其质量和纯度，同时确保细胞生长的效果和卫生环境的卫生。
胎牛血清 BUNSEN本生公司产品种类已超过万种，正广泛应用于科研院校、中心实验室、分子生物学等科研域。
公司丰富的产品既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。
我国动物血清规模化生产的现状和质量控制
［摘 要］通过阐述我国动物血清规模化生产 的现状，对其分类、应用和国内外的质量控制标准作了简要的介绍9
［关键词］动物血清；质量标准；控制
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现 代生物 技术 的发 展几 乎都 与细 胞培 养有 着密 切的 关系 ，特别 在医 药领 域中 的发 展，细 胞培 养更 具 有 特殊 的作 用和 价值，比如 基因 工程 药物 或者 是在疫 苗研 究生 产过 程中 很多 是通 过细 胞培 养来 实现 的’ 细胞 工程 、杂 交瘤 单克隆 抗体 、基 因治 疗、发 酵 工程 和 酶 工程 等 同 样也 依 赖 于 细胞 培 养 的过 程 来 实现 9 在细 胞培 养的 发展 过程 中，培养基 的质 量又 是其 中 的关 键，而培 养 基 的主 要 成 分之 一 动 物血 清 ，尤 其 是 新 生牛 血清 对培养 细胞 的生 长繁 殖发 挥着 极其 重要 甚至 是难 以替 代的 作用9 动物 血清 是医 药生 物技 术 产 品中 重要 的原材 料之 一，其质 量控 制也 是促进 生物 制品 质量 提高 的重 要环 节9
马 血清采 自健 康活 体成 年马 % !"* 绵羊血清
绵 羊血清 采自 健康 活体 成年 绵羊 % !"+ 山羊血清
山 羊血清 采自 健康 活体 成年 山羊 % !", 鸡血清
鸡 血清采 自健 康活 体成 鸡% !"#$ 猪血清
猪 血清采 自健 康活 体成 猪% !"## 其他动物血清
其 他动 物血清 包括 兔血 清、豚鼠 血清 、小鼠 血清 和大 鼠血 清等 %
药品生产质量管理规范(2010年修订)》生物制品附录修订稿
附件生物制品（2020年4月23日，2020年第58号公告修订）第一章范围第一条生物制品的制备方法是控制产品质量的关键因素。
采用下列制备方法的生物制品属本附录适用的范围：（一）微生物和细胞培养，包括DNA重组或杂交瘤技术；（二）生物组织提取；（三）通过胚胎或动物体内的活生物体繁殖。
第二条本附录所指生物制品包括：疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、细胞因子、生长因子、酶、按药品管理的体内及体外诊断制品，以及其它生物活性制剂，如毒素、抗原、变态反应原、单克隆抗体、抗原抗体复合物、免疫调节剂及微生态制剂等。
第三条生物制品的生产和质量控制应当符合本附录要求和国家相关规定。
第二章原则第四条生物制品具有以下特殊性，应当对生物制品的生产过程和中间产品的检验进行特殊控制：—1 —（一）生物制品的生产涉及生物过程和生物材料，如细胞培养、活生物体材料提取等。
这些生产过程存在固有的可变性，因而其副产物的范围和特性也存在可变性，甚至培养过程中所用的物料也是污染微生物生长的良好培养基。
（二）生物制品质量控制所使用的生物学分析技术通常比理化测定具有更大的可变性。
（三）为提高产品效价（免疫原性）或维持生物活性，常需在成品中加入佐剂或保护剂，致使部分检验项目不能在制成成品后进行。
第五条生物制品生产企业在生产质量管理过程中，应当按照国家有关生物安全管理法律法规、生物制品生产检定用菌毒种管理规程等建立完善生物安全管理制度体系，应当对包括生物原材料、辅料、生产制造过程及检定等整个生物制品生产活动的生物安全进行评估，并采取有效的控制措施。
第三章人员第六条应当加强对关键人员的培训和考核，培训内容至少包括相关法律法规、安全防护、技术标准等，并应当每年对相关人员进行专业考核。
从事生物制品生产、质量保证、质量控制及其他相关人员（包括清洁、维修人员）均应根据其生产的制品和所从事的生产操作—2 —进行专业知识和安全防护要求的培训。
第七条生产管理负责人、质量管理负责人和质量受权人应当具有相应的专业知识（微生物学、生物学、免疫学、生物化学、生物制品学等），并能够在生产、质量管理中履行职责。
细胞培养_动物血清
第一章动物血清有关血清的基本信息40年来，研究者依赖Invitrogen公司GIBCO血清在体外再造适于细胞生长、繁殖和分化的生理环境。
在提供细胞培养基、平衡盐溶液和培养用试剂的同时，GIBCO提供高品质的血清。
GIBCO自1961年开始生产用于细胞培养的动物血清，是此行业的开创者。
在三十多年的岁月里，一直保持在技术和品质方面的领先水平，血清和培养基的市场占有率常年蝉联全球第一。
GIBCO血清生产的纵向整体化管理从血液收集到最终产品检验和内部稽核的每一个步骤，GIBCO都采用专用设备和标准操作程序，这种严格的控制可保证产品的高品质和最低的批间差。
可追踪性：血清品质的证据GIBCO收集并保留从采血、处理、检测到发运的全部文件供追踪之用。
采血胎牛血清采用心脏穿刺的方法采血。
马血清采自供体动物。
新生牛血清采自出生10至14天的小牛。
全部按照工业标准采血。
处理全部血清：收集的血液均在冷藏条件下处理。
血清和凝块分离后立即将血清合并并冷冻。
只有符合我们的检测标准的血清才被接受作进一步处理。
热灭活血清：热灭活是在56℃水浴中严格控温30分钟。
超低IgG胎牛血清：我们持有从血清中通过层析方法去除γ球蛋白的专利。
经过这种程序处理的血清只有极低的IgG浓度（小于5µg/ml）但保持了血清的全部生物学活性。
透析血清：用12,000～14,000截留分子量的透析膜对0.15M的NaCl进行透析直到葡萄糖水平低于5mg/dl(用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶方法检测)。
为防止沉淀和血清中多肽的灭活，不进行过度的透析，因此一些小分子量的可透析成分如氨基酸不一定完全去除。
γ 射线照射血清：可按客户要求对血清进行γ射线照射。
通过γ射线照射以灭活各种动物血清中的病毒和支原体的方法已经得到证实。
研究证实照射剂量在30-45kGy为宜。
这一数据符合最新的欧洲和美国FDA的标准，证实血清被照射后物理化学特性和细胞培养表现没有改变。
生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准
生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准用于生物制品生产的牛血清应为从出生14小时内未进食初乳的新生小牛采血分离血清，经除菌过滤制成。
主要用于细胞培养。
【性状】为淡黄色澄清稍黏稠的液体，无溶血或异物。
【无菌检验】按附录页进行检验，应无菌生长。
【支原体检验】按附录页进行检验，应无支原体生长。
【外源病毒检验】将被检血清按10%浓度加入MEM培养基中，接种48孔细胞培养板培养的VERO、BHK21、PK15、牛睾丸细胞单层，每种细胞接种8孔，同时设立牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV）对照各2孔，37℃培养5日，观察细胞病变，细胞均不得出现细胞病变。
培养至第5日时，对每种细胞的2孔及病毒对照孔，用PBS洗涤3次，每孔加入80%丙酮0.5ml，4℃以下固定30分钟，弃丙酮后自然干燥，每孔加入BVDV荧光抗体染色0.3ml，室温染色30分钟，弃荧光抗体并用PBS洗涤3次，荧光显微镜观察，被检血清孔不得出现荧光染色。
剩余的6个细胞孔,前3孔，每孔加入0.2%豚鼠、人O型、鸡红细胞等量混合液0.3 ml，2～8℃作用30分钟，另3孔同样加入红细胞后室温作用30分钟。
倒置显微镜观察，均不得出现红细胞吸附现象。
【特异性抗体测定】生产企业应根据血清的使用对象确定测定的抗体种类，测定方法采用中和抗体测定法，如有适用的的ELISA方法，也可采用。
如用于生产口蹄疫疫苗的血清不得含有口蹄疫病毒抗体，用于生产猪瘟疫苗的血清不得含有BVDV抗体等。
【细菌内毒素测定】用凝胶法或细菌内毒素检测仪测定，按照鲎试剂或内毒素检测仪操作程序测定，每毫升血清的内毒素含量应低于10 EU。
【细胞增殖试验】取生长良好的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，弃营养液，用无血清MEM配成每毫升30万～50万细胞悬液，计数细胞后，用无血清MEM在96孔细胞板上作1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，每稀释度加8孔，每孔0.1ml，每孔再分别补加0.1ml含20%标准血清或20%被检血清MEM营养液，置5％CO2培养箱37℃培养至48小时，倒置显微镜下计数，取每孔克隆数均在30～50之间的稀释度的8个孔，求和计为总克隆数。
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胎牛血清制备
WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
胎牛血清制备
一、目的:
为了保障胎牛血清产品质量的均一性和稳定性，制定以下操作方法，
以规范胎牛血清生产制备。
二、操作方法：
（一）采血
1、挑选出大约8月龄以上的健康妊娠母牛，经剖腹获取小牛。
2、将小牛清洗干净后，侧放在万级洁净房间内的采血台上，固定四肢
及头部。
3、用来苏水清洗心脏外部，刮去心脏外部牛毛，露出心脏外部一侧皮
肤，用2%碘酒擦拭消毒。
4、在心脏部位切开一道10厘米左右的切口，取出近心血管，先用2%
碘酒消毒，再用75%的酒精消毒，用止血钳夹住血管，切开1厘米左右的切
口进行插管，插好管后打开血管的止血钳，让牛血顺采血管流入另一个洁
净房间内的采血瓶中。
5、采血瓶采血前经干烤灭菌（180℃ 2小时）后，按无菌操作注入10
毫升左右经高压灭菌的生理盐水后加塞封口，于采血前半小时放入37℃恒
温箱备用。采血前先晃动瓶内生理盐水，使其充分湿润瓶壁后倒出，再进
行采血并加塞封口。将采血后的采血瓶放37℃ 恒温室2小时，再放入4℃
冷库 4小时以备离心。
（二）离心
将准备好的采血瓶放入离心套筒调好平衡后，对称放入离心机，按
1800转/分钟 离心50分钟后，放入4℃冷库备用。
（三）抽血清
取出4℃冷库离心好的采血瓶，注意轻抬轻放，以免将下层血块和血清
混层。将经过高压灭菌装有两孔瓶塞的5000ml大瓶的抽气孔一端的管子接
好空气滤器，再接到压缩机抽气口上。打开压缩机，用抽血清孔的管子轻
轻抽取采血瓶内的上清液，注意控制好抽管，避免抽到下层血块。将抽好
的血清分装，即为粗制胎牛血清，放入-20℃冷库冷藏备用。
（四） 血清过滤
1、将-20℃冷库内的粗制血清取出化冻。
2、将化冻后的粗制血清用经过高压灭菌的12层医用脱脂棉纱布进行
初滤。
3、把初滤后的血清倒入大罐进行混合。
4、将装好滤芯的滤器做密封性试验和发泡试验合格后，经过高压灭
菌，在洁净室内用无菌操作法将滤器按滤柱孔径由大到小的顺序进行组
装，并装上压力表。把滤器大孔径一端和蠕动泵出口进行连接。
5、用蠕动泵将大罐内的血清送入滤器进行过滤。
6、将滤出的血清在百级净化操作台上进行分装后，即为精制胎牛血
清，送-20℃冷库储存。
三、注意事项：
1、在操作过程中，要经常用75%的酒精对手部进行消毒，同时避免接触牛
血或血清，特别是有伤口的部位，以免感染。
2、在采血插管过程中，插管避免接触到未消毒的部位，尽量深入血管，使
牛血能快速流完为好，并固定好插管，避免脱离动脉血管。
3、在抽血清的过程中，控制好压缩机的压力大小，避免压力过大，抽到下
层的沉淀物。
4、在过滤过程中，控制好压力的大小，避免超过滤柱工作压力。