第4章 培养基、灭菌与除菌

第4章 培养基、灭菌与除菌 本章的主要内容： 1.培养基的制备 2.starch 的水解 3.培养基的灭菌 §4-1培养基的制备及要求 一、培养基用原材料及要求 微生物发酵领域其本质，也可以理解为物质形式的转化过程，就是利用微生物生长所需的底物转化成特定的产物，在这个过程中，有两个问题是工业化需要解决的：（1）产物的社会效益，

（2）物质转变过程中产生的经济效益，即：低价值的原材料、低能耗等 对于特定的已知产物，在选择培养基原料时，则应注意以下几个原则： 1、培养基原材料的要求 （1）价格低廉，易得到（价格低，但不一定易得到，例如：地瓜干） （2）对微生物的生长繁殖和代谢无抑制作用的物质 （3）微生物的代谢产物无有害物质。 2、培养基用原材料的种类

碳源 starch 及其水解糖液 含有starch 及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等 化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等 氨水、尿素（有脲酶的微生物），以流加形式使用 (NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL等 氮源 豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、 菌体蛋白？、 玉米蛋白粉等 二、培养基的种类 固体发酵 生产培养基 厌氧发酵 需氧发酵 按用途可分为：种子培养基 摇瓶培养基（优化工艺……） 检查培养基：HASS发酵用的检查培养基： 营养琼脂0.5%—0.55%、Sarch 2%，Glucose 0.5% 平板培养，根据透明圈的大小 本章涉及到的培养基为：生产使用的培养基 三、培养基的制备 1.培养基配制的原则 培养基制备是发酵成功与否的第一个要点，制备一个完整而科学的培养基是很重要的，也是非常艰巨的任务。通常制备培养基需要考虑以下几个方面的问题：

（1）合适的C/N， 不同的微生物、同一种微生物不同的菌株，其对培养基中的C/N要求是不一样的，同一菌株在不同的发酵阶段，其对C/N的要求也不一样。

例如：黄源胶（Xanthan Gum发酵）：前期，较低的C/N，目的是强化菌体的生长和增殖：但是，在黄源胶的生物合成期，则需要较高的C/N，假如在这一时期，培养基中氮源仍然很高，其导致的发酵结果是，底物消耗了但产物的产率却很低。

在大多数情况下，C/N要求在0.2——2.0。对于一些特殊的情况，例如谷氨酸发酵，在谷氨酸生物合成期，则要求C/N为：100/15-21。 （2）在确定了C/N的前提下，需要研究的是不同的氮源，对发酵的影响。 虽然C/N确定，但是氮源的利用其本质就是：pr 肽 AA,通过AA而被利用，不同的氮源，其AA的组成与比例也不相同，对其发酵结果的影响也不相同。有人在HASS(高温淀粉酶)的发酵过程中，向培养基中添加某些AA（亮，异亮）则有利于高温淀粉酶的合成基因的表达，发酵液中的酶活力则明显得到提高。

（3）大多数的工业培养基都使用玉米浆。 玉米浆内含有VH，它是菌体生长和代谢的所必需的一种辅酶，通常玉米浆与： a. 菌体的增殖速度有关 b. 与菌体细胞膜的合成有关，从而影响到细胞膜的通透性 c. 对于某些菌体，与代谢途径和代谢机制有关。

（4）生长因子：

大多数菌体的生长因子如下： a. 维生素：大多数维生素是微生物生长的辅酶，需要量很小，1—50µg/L。 b. AA，凡是微生物自身不能合成的AA则必须以游离的AA或者小分子的肽提供，通常，以小分子的肽提供，微生物更易通过细胞膜进入菌体内部 ?，如果提供外援氨基酸，需要注意的是各种氨基酸的平衡。 c. 嘌呤及其衍生物 2.培养基的优化方法

一种合成培养基的设计，需要考虑的因素是很多的，需要研究的成分也是很复杂的，其中包括碳源、氮源、玉米浆等，即便是碳源还可以是几种碳源的混合体，再加上述几种因素之间的相互影响，要确定一个科学的培养基配方是需要做大量的工作的，采用一个合理的数学方法，就可以在减少工作量的前提下，得到科学的结果。

介绍一种数学方法：均匀实验设计方法——旋转正交实验方法. 这是在正交实验的基础上发展起来的一种对于多因素、多水平的一种实验设计方法。

参考文献：方开泰:均匀正交实验方法 雄宗贵:发酵工艺学原理

§4-2培养基用材料及处理 发酵培养基用原料是非常广泛的，许多原材料需要经过处理后方能够使用，特别是以淀粉质为原料的发酵工业，大多数的情况下需要将淀粉进行水解处理。

本节内容：starch的水解；糖蜜的预处理；工业用添加剂 一、淀粉的水解 许多微生物由于其本身的生理生化特性而决定了其代谢所需的底物只能使Glucose等单糖，主要有下列菌种：

酵母：G、F、蔗糖、半乳糖、以及部分麦芽糖等 大部分的细菌：GA产生菌、Lys产生菌、苏云金芽孢杆菌等 其中：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌则可以以淀粉为原料。

霉菌：大部分的霉菌可以直接使用淀粉为原料，他们本身具有淀粉的水解能力。

淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法，分别介绍如下：

1.淀粉的水解方法 （1）淀粉的酸法水解 水解原理： 淀粉是由葡萄糖通过α-1，4或α-1，6葡萄糖苷健连接而成的含有多个葡萄糖的大分子长链物质，根据其葡萄糖连接的糖苷健的不同，可分为枝链淀粉和直练淀粉，可以使用重合度 来表示淀粉分子的大小，所含有的葡萄糖苷健的数量，称之为淀粉的重合度，用DP来表示。淀粉内部的葡萄糖苷健在一定的温度和酸性的条件下可以水解，而使淀粉分子链断裂，高温可加速葡萄糖苷健的水解速度。

水解条件：高温，120℃以上， H+, 0.2MPa 的压力 缺点：反应条件比较强烈，产生的副产物较多. 主要有下列副产物： a. 双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖， 前者不利于产物的结晶提出，后者对于菌体的生长有抑制作用。

b. 一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。 c. 一分子葡萄糖和—NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。(美拉得反应)

2.酸酶法 3.酶酸法 4.双酶法：使用两种淀粉水解酶：α-淀粉酶 淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶。 α-淀粉酶 ：又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄糖苷健，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，液化的含义？其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖（从水解葡萄糖苷健的种类，水解速度到最后已无工业意义三个方面），因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。

淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶，又称为糖化酶，可以水解淀粉分子的α-1，4；或

α-1，6葡萄糖苷健，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。

酸法与双酶法的优缺点比较： （1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。 有的人会问？目前采用的耐高温α-淀粉酶的作用温度也是较高，突破100℃，和酸法水解的温度相差不多。双酶法淀粉水解首先使用耐高α-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。

（2）正因为上述原因，淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。这可以给味精、制药的领域带来巨大的经济效益。

例如：对于年产10000吨的小型味精厂，年增产100吨味精，直接经济效益可达到：0.8*100=80万元。 （3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。

（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be，原因？（副产物）意义？（设备利用率）

介绍液体浓度Be的概念： 波美度（Be）是表示液体浓度（比重）的一种方法，其和液体比重之间有下列关系：

d = λ/λ- Be 式中——d： 液体的比重 λ： 模数 λ因标定的温度不同可将波美表分为： 美国：15.6℃标定，λ=145 合理：15℃标定，λ=144.3 荷兰：12.5℃标定，λ=144 标定方法： 轻表：“0”Be的位置，把表放在一定温度下的蒸馏水中的位置； “10” Be的位置，把表放在一定温度下的比重为0.9351 的溶液中的位置。 重表：“0”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的蒸馏水中； “66”Be的位置，该位置是把表放在一定温度下的比重为1.842的浓硫酸溶液中。

表示溶液的比重的方法还可以使用Bx(玻利克斯)： 定义：某一溶液的Bx，表示该溶液的比重和相同浓度（为Bx%）的蔗糖溶液的比重相等。 注意： Bx的概念不同于波美度，他与比重之间是没有计算公式的，但是可以查找有关换算关系。

2.淀粉的双酶法水解工艺 淀粉调浆 液化 糖化 过滤 糖液 浆液浓度：20—30Be,调pH值6.0—7.0， 添加CaCL2,使用量，0.01mol/L（目的？） 液化：耐高温α-淀粉酶，酶的使用量：5—8单位/g淀粉 温度：105℃；时间，20—30分钟 降温：采用喷射冷却方法： 糖化：使用淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶；

使用量：根据液化淀粉的浓度，30%的浓度，80—100单位/g淀粉 温度：65℃ 终点判断： 时间，2—3小时。 二、糖蜜的处理 1.糖蜜的主要成分 （1） 糖，49—50%，因不同的原料和生产方法不同而异，主要是蔗糖 （2） 胶体物质，5—10%，来自于原料 （3） 灰分，10—12% （4） 生物素，1—10mg/Kg(甘蔗)，0.04—0.06 mg/Kg(甜菜) （5） pH值6.2(甘蔗)，7.4（甜菜） 对于发酵工业可以利用得的主要成分是：糖和生物素

2.用途 （1） 发酵工业用原料，国内发酵生产的有：味精、酵母 目前，国内酵母工业使用进口糖蜜为原料，带来了较大的工业污染，…… （2） 使用糖蜜生产酒精