乳酸菌的培养检测方案
专题01发酵工程(综合题30道)(原卷版)
专题01 发酵工程（综合题30道）1．龙眼汁中富含蔗糖、葡萄糖等糖类及多种氨基酸、维生素和铁、磷、钙等元素，以龙眼汁开发生产果醋饮料，能保留较高的药用保健价值。
回答下列有关问题：(1)新鲜龙眼去皮后需先榨汁打浆酶解，酶解的目的是。
(2)利用龙眼汁生产龙眼果醋的过程通常分为果酒发酵和果醋发酵两个阶段，发酵过程发挥作用的菌种主要是。
龙眼果酒制作好后进一步发酵得到龙眼果醋的原理是（写出反应式），同时还需要调整的条件有(3)如图为一定条件下研究LB活性醋酸菌对龙眼果酒的醋酸发酵作用，该实验的实验目的是探究条件下LB活性醋酸菌对的影响。
根据实验结果可知，当发酵温度为20℃时，发酵转化率较低，主要原因是。
图中最适合LB活性醋酸菌发酵的温度为。
2．红酸汤是一种很有特色的火锅底料，制作流程如图所示。
请分析回答以下问题：(1)密封发酵时,常在坛中加入成品红酸汤，其目的是。
乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行的过程，该过程发生在乳酸菌细胞的中。
(2)装坛时坛口留有一点空间而不装满的目的是，红酸汤腌制过程的初期会有气泡冒出，但气泡的产生逐渐停止，试分析原因是。
(3)红酸汤有利于人体肠道内多种益生菌的生长。
消化道炎症往往与益生菌群减少、有害菌群增多有关。
研究表明，治疗消化道慢性炎症时，不宜滥用抗生素，滥用抗生素的害处有。
(4)亚硝酸盐的含量影响红酸汤的品质，在发酵过程中影响亚硝酸盐含量的因素有。
（至少2个）3．柿子果肉绵软香甜，还能用来制作果酒和果醋，下面是民间制作柿子酒和柿子醋的过程。
(1)果酒发酵过程中，如果一直密封发酵罐，将产生一定的安全隐患，原因是，相关的化学反应式是。
(2)果醋发酵过程中没有接种微生物，说明空气以及柿子皮上可能天然存在菌，发酵中没有进行严格的消毒灭菌，却少有杂菌生长，主要原因是。
(3)秋冬季酿酒和酿醋的过程中，人们会把发酵罐放置在相对温暖的地方，原因是。
4．某兴趣小组就“泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化”开展了探究，操作如下：选取1、2、3号三只相同的泡菜坛，在每个坛中加入等量洗净的新鲜莲花菜，再分别倒入相同量煮沸并冷却的10%盐水，将坛密封，置于同一环境中定时测定亚硝酸盐含量，结果如图所示。
1.2.2微生物的选择培养与计数教学设计-2024-2025学年高二下学期生物人教版选择性必修3
1.题型一：微生物的选择培养方法
题目：请设计一个实验方案，通过选择培养基来筛选特定类型的微生物。
答案：实验方案应包括选择培养基的配制、微生物的接种方法、培养条件等。例如，可以设计一个以特定碳源为筛选标志的选择培养基，然后通过涂布平板法或液体培养法来筛选目标微生物。
2.题型二：微生物的计数方法
教学资源准备
1.教材：确保每位学生都有本节课所需的教材《生物人教版选择性必修3》。
2.辅助材料：准备微生物选择培养与计数的图片、图表、视频等多媒体资源，以帮助学生更好地理解微生物的生长和计数过程。
3.实验器材：准备微生物培养皿、计数器、显微镜等实验器材，确保其完整性和安全性，以便学生进行实验操作。
4.教室布置：根据教学需要，将教室布置为分组讨论区和实验操作台，以便学生进行小组讨论和实验操作。
此外，在教学过程中，我注重了与学生的互动，鼓励他们提出问题和观点，但在时间安排上，我发现有时会因为互动而拖延了课堂进度。因此，我需要进一步优化课堂时间管理，确保课堂教学内容和方法的合理安排。
2.教学总结
同时，我也发现学生在微生物计数方法的运用上还存在一些问题，如操作不规范、数据处理不准确等。针对这些问题，我计划在今后的教学中，加强对学生的实验操作训练和数据处理能力的培养，以提高他们的实验技能和科学素养。
4.实验操作
同学们，现在我们来进行实验操作。首先，请大家领取实验器材，包括培养皿、计数器、显微镜等。然后，按照教材上的实验步骤进行操作。在实验过程中，要注意操作的准确性和安全性的微生物的选择培养与计数。在实验结束后，我们将进行结果的分析和讨论。
5.结果与讨论
同学们，现在我们来分析实验结果。请大家将自己的实验数据进行整理和记录。我们可以通过比较不同培养基上的菌落数量，来判断微生物的选择培养效果。同时，我们还可以通过显微镜观察微生物的形态和数量，来进行微生物的计数。现在，请大家将自己的实验结果进行分享和讨论。
乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒一站式解决方案
乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒一站式解决方案乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LD 或LDH ，EC1.1.1.27 ）是一类NAD依赖性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三种亚基，可构成6种四聚体同工酶。
动物乳酸脱氢酶是由4个亚单位组成的四聚体，常见的A、B 两种亚基构成的5种LDH同工酶（LDH1-5），C亚基则仅组成一种LDH同工酶即LDH-C4。
乳酸脱氢酶为含锌离子的金属蛋白，分子量为135-140kD，是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酸与L-乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α-酮酸。
LDH广泛存在于人体组织中，以肾脏含量最高，其次是心肌和骨肌。
红细胞内LDH约为正常血清的100倍。
一、乳酸脱氢酶分类1.根据结合辅酶的不同，微生物体一般包含两种乳酸脱氢酶，NAD-依赖型乳酸脱氢酶（NAD-dependent lactate dehydrogenases，nLDHs）和NAD-非依赖型乳酸脱氢酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDHs）两大类。
2.按其催化底物的构型不同，NAD-依赖型乳酸脱氢酶可以分为NAD依赖型-L-乳酸脱氢酶（L-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）和NAD依赖型-D-乳酸脱氢酶（D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）两大类，分别催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。
3.根据天然电子受体的不同，可以将NAD-非依赖型乳酸脱氢酶分为三类。
第一类为膜蛋白，利用膜醌类作为外部的电子受体；第二类直接利用O2作为电子受体，根据氧化终产物的不同，又将其细分为乳酸氧化酶（Lactate oxidase，LOX）和乳酸单氧酶（Lactate monooxygenases，LMO），其中前者产生丙酮酸和H2O2，而后者产生乙酸、CO2和H2O；第三类是硫胺b2（flavocytochrome b2），存在于真菌中，它天然的电子受体为细胞色素c。
肠道微生物的分离与鉴定方法
一、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地衣）。
5种有害菌：大肠杆菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。
4种二、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产气荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。
5种需氧菌：芽孢杆菌。
1种兼性厌氧菌：大肠杆菌，沙门氏菌。
2种注：境中生长最好。
最适温度为37～42℃。
在正常大气或无氧环境中均不能生长。
肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占比例较少。
三、一般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。
需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。
四、无氧环境的简易操作：1、方法来自文献《健康羊驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》采用干燥器培养，1m3空间用焦性没食子酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按比例取10%的氢氧化钠液置于干燥器皿底部，然后放置2到3个略高于液面的青霉素小瓶，再按比例称取焦性没食子酸用纸包好，放在圆柱上。
继而放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指示剂一管。
盖上缸盖并用石蜡封闭。
再轻轻摇动干燥器，使焦性没食子酸掉人氢氧化钠液中，反应后，干燥器内无氧，美蓝指示剂由蓝变白。
置于温箱37℃培养24一48h观察结果。
2、方法来自文献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》后者先拧紧瓶盖,放入密封性较好的玻璃罐(用凡士林封口)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。
五、CO2培养箱不可代替无氧培养箱厌氧箱一般是组合气体90%氮气+5%氢气+5%二氧化碳，厌氧箱里面培养的微生物都是厌氧微生物；而二氧化碳培养箱里面是5%二氧化碳+95%空气，里面是有一部分氧气的。
一般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须小于1000ppm（千分之一），更严格的环境是小于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能用来培养严格厌氧菌。
2024版年度食品微生物检验技术教学设计
通过食品微生物检验，可以及时发现并处理食品中的污染和变质问题，保障公众的健康和生命安全。
维护公众健康
食品微生物检验技术的发展和应用，有助于提高食品质量和安全水平，推动食品产业的健康发展。
促进食品产业发展
食品微生物检验重要性
教学目标与要求
掌握基本理论和技能
通过本课程的学习，学生应掌握食品微生物检验的基本理论和实验技能，包括微生物学基础知识、检验方法和技术等。
涵盖食品微生物学基础知识、检验原理和方法、实验操作规范等方面。
考试内容
根据教学目标和学生实际情况，合理设置考试难度，既要考察学生对基础知识的掌握，又要体现一定的分析、解决问题的能力。
难度把握
采用选择题、判断题、简答题、案例分析题等多种题型，全面评价学生的理论水平。
题型设置
理论考试内容设置及难度把握
安排一定学时的实验和实训课程，让学生在教师指导下进行实际操作，巩固所学知识和技能。
详细介绍食品微生物检验的常规方法和技术，如菌落总数测定、大肠菌群计数、致病菌检验等。
对课程内容进行总结和回顾，通过考核评估学生的学习成果和教学质量。
02
CHAPTER
基础知识与技能点梳理
了解微生物的基本概念、分类体系以及命名规则。
食品微生物检验技术教学设计
目录
课程背景与目标 基础知识与技能点梳理 实验操作技能培养方案设计 实验室安全与环保意识培养 案例分析与讨论环节设计 考核评价方式与标准制定 教学资源建设与利用策略 总结反思与持续改进计划
01
CHAPTER
课程背景与目标
食品微生物检验是确保食品安全的重要手段，能够及时发现和控制食品中的有害微生物，防止食源性疾病的发生。
培养基种类与选择
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
2024北京海淀区高三一模生物试题及答案
2024北京海淀高三一模生 物2024.04本试卷共10页，100分。
考试时长90分钟。
考生务必将答案答在答题卡上，在试卷上作答无效。
考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回「第一部分本部分共15题，每题2分，共30分。
在每题列出的四个选项中，选出最符合题目要求的一项。
1.乳酸菌、黑藻叶肉细胞、人体小肠上皮细胞虽形态各异，但它们也有共同之处，表现在A.有细胞膜和核膜B.可进行有丝分裂C.以DNA作为遗传物质D.线粒体中进行能量转换2.端粒是染色体末端的一段DNA片段。
端粒酶由RNA和蛋白质组成，该酶能结合到端粒上,以自身的RNA 为模板合成并延伸端粒DNA。
在正常情况下，端粒酶只在不断分裂的细胞中具有活性。
下列有关端粒酶的叙述，正确的是A.仅由C、H、O、N四种元素组成B.催化过程以4种脱氧核苷酸为底物C.组成成分都在核糖体上合成D.在所有细胞中均具有较高活性3.新生无毛哺乳动物体内存在一种含有大量线粒体的褐色脂肪组织，褐色脂肪细胞的线粒体内膜含有蛋白质U。
蛋白质U不影响组织细胞对氧气的利用，但能抑制呼吸过程中ADP转化为ATPO据此推测当蛋白质U发挥作用时A.葡萄糖不能氧化分解B.只在细胞质基质中进行无氧呼吸C.细胞中会积累大量的ATPD.可大量产热，维持体温4.内生真菌生活在植物体内，植物为内生真菌提供光合产物和矿物质，内生真菌呼吸产生的CO2可供植物利用。
在恒定光照强度下，研究人员测定了土壤不同N元素含量及有无内生真菌对植物光合速率的影响，结果如下图所示。
下列相关分析，不正确的是A.土壤含N量及CO2浓度都是影响光合速率的环境因素B.内生真菌呼吸产生的CO2可进入植物叶绿体基质参与暗反应C.图中A点制约植物光合速率的主要环境因素是光照强度D.在土壤高N含量下内生真菌可提高植物的光合速率5.C品系果蝇仅在X染色体上存在D基因，使其具有棒眼性状，果蝇中D基因纯合会致死。
用X射线照射大量雄果蝇，为检测照射后的这批雄果蝇X染色体是否发生突变，使它们与C品系雌蝇交配。
乳品微生物指标及检验标准介绍
微生物危害分类
中等： 副溶血性弧菌 蜡样芽孢杆菌 致病性大肠埃希菌 金黄色葡萄球菌毒素 严重： 沙门（未分型） 志贺 单增李斯特菌 肠出血性大肠埃希菌 重大危害：O1型霍乱 婴儿致病性大肠埃希菌
2.考虑与现行标准值的协调性，既参考国际或发达国 家标准，也要避免对行业发展造成冲击性的影响。
GB 4789-2010
序号 国家标准号 标准名称
1
2 3 4 5 6
GB 4789.1
GB 4789.2 GB 4789.3 GB 4789.4 GB 4789.10 GB 4789.15 GB 4789.30 GB 4789.35 GB 4789.40
食品微生物学检验 总则
食品微生物检验 菌落总数测定 食品微生物检验 大肠菌群计数 食品微生物检验 沙门氏菌检验 食品微生物检验 金黄色葡萄球菌检验 食品微生物检验 霉菌和酵母计数
乳粉
乳清粉 奶油
5,2,50000,200000
— 5,2,10000,100000
5,1,10,100
— 5,1,10,100
—
— 90
—
— —
干酪
再制干酪
5,2,100,1000
5,2,100,1000
5,2,100,1000
5,2,100,1000
50
50
50
50
食源性致病菌
乳品 生乳 灭菌乳 调制乳 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 单增李斯特菌 5,0,0 5,0,0 商业无菌 5,0,0 巴氏杀菌乳 5,0,0
4.1.3 采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的 外来污染。
4.1.4 样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措 施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原 有状态。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
品质管理检测项目细菌形态学分类一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本属性：乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。
无芽孢，革兰氏染色呈阳性。
微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。
在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。
（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。
乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。
以上用量为1000ml培养基的用量。
溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
乳酸杆菌在液体培养基中的生长状况背景资料：培养基有MRS培养基、RS MA培养基、番茄汁琼脂培养基。
当乳酸杆菌是待分离区系的优势菌时，常用MRS培养基对其进行分离。
一些常见的食品污染菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等在MRS培养基上生长较差或几乎不生长，从而减少了杂菌的污染，降低了分离难度。
目前MRS培养基已经成为国标上公认的用于乳酸杆菌分离较好的培养基。
常用于从乳酸杆菌发酵制品中分离菌种以及菌种分离后的传代培养。
番茄汁琼脂培养基，这是一种传统的用于分离乳酸杆菌的培养基，此种培养基由于含有一定量的番茄汁，为乳酸杆菌的生长提供必要的营养，使得乳酸杆菌在此环境下更容易生长。
但由于配置过程中需要制备新鲜番茄汁，所以操作起来较为费时费力，目前已逐渐被MRS 等培养基所代替。
某些选择性培养基可用于从菌群复杂的基质(例如肠道) 内进行乳酸杆菌的分离。
APT( All Purpose Tween) 培养基通常用于从肉制品中分离乳酸杆菌，改良的Rogosa SL( Rogosa Sodium Lactate Modified ) 完全选择性培养基则常用于胃肠内容物中乳酸杆菌的分离。
Briggs琼脂培养基和s L( Sodium Lactate) 培养基常用于酸奶中乳酸杆菌分离。
（二）检测内容、流程、方式：内容：1 通过对水体当中的的乳酸杆菌的筛选培养，最后计数得到相应水体当中的乳酸杆菌的数量。
方法为：逐级稀释法。
2 乳酸杆菌的定性流程：①采集：每个采集点各自采集10ml的池塘水，经过过滤杂质（固体），冷冻运送等环节送到实验室内部。
②稀释平板测数法1、样品稀释液的制备准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL 无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀释菌液。
用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。
通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。
2、平板接种培养平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。
⑴混合平板培养法将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1mL放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1mL放入编号1×10－8的3个平板中，再吸取1×10－7稀释液各1mL放入编号1×10－7的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。
然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。
至菌落长出后即可计数。
⑵涂抹平板计数法涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。
再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。
在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。
将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。
⑶划线法（不采用，因为需要对乳酸菌和大肠杆菌进行筛选培养）：用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。
划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。
转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。
同法进行第三次、第四次划线。
另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。
转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。
划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。
以上各种分离法，都应按无菌操作进行。
所用的培养基若在倒平板前，按50µg/m L 的量加入用乙醇溶解的制霉菌素或放线菌酮（起抑制霉菌的作用），效果会更好。
3、培养（16个小时即可）将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于28～30℃培养，至长出菌落为止（24～36h）。
4、挑菌纯化在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。
5、计数选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30～300的平板，分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。
这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。
（四）数据的收集整理：数据库模板的建立二大肠杆菌（一）大肠杆菌的基本属性：（二）仪器和试剂：仪器：试剂：液态培养基：配制每升培养基,应该在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g ，NaCl 10g 。
摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
固态培养基：LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。
LB固体培养基倒板1.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉。
2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
3.倒板：一般10ml倒1个板子。
培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
（1）普通培养基:固体培养基是在液体培养基中加1.5%琼脂制成，先配液体培养基，然后加入1.5%琼脂，高压灭菌20min，取出后再无菌状态下铺平板（2）选择性培养基:将消毒好的固体培养基置室温下冷却50℃时加抗生素或其他必加成分，摇匀后倒入灭菌皿中厚度2-3mm, 室温固化。
(抗生素用三蒸水溶解后，用无菌滤头过滤到无菌瓶中, 氨苄青霉素终浓度50μl/ml)新制备的固体培养基较湿，铺上的液体不易吸收，可在室温下放2-3天，或37℃放半小时，然后4℃保存备用。
（3）LB培养基中所用抗生素终浓度：氨苄青霉素-50μl/ml；氯霉素-20μl/ml；庆大霉素-15μl/ml；卡那霉素-30μl/ml；春日霉素-1000μl/ml；壮观霉素-100μl/ml；链霉素-30μl/ml；四环素-12μl/ml。
（三）培养检测方法：乳品中大肠杆菌检测国标GB/T4789.38-2008的具体步骤及达标的标准：第一法大肠杆菌MPN 计数操作步骤6.1、样品的稀释6.1.1、固体和半固体样品：以无菌操作取259 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内，8000r / min ～1000r/ min 均质1 min～2 min ，制成l:10 样品匀液，或置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。
6.1.2、液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。
6.1.3、样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1mol/L 氢氧化钠（NaOH）或1mol/L 盐酸（HCI）调节。
6.1.4、用1mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管或吸头反复吹打，使其棍合均匀，制成1:100 的样品匀液。