乳酸菌检验
食品中乳酸菌检验
a.乳酸菌检测的意义：
当益生菌占优势时（占总数的80%以上），人体则保持健康状态，否则处于亚健康或非健康状态。
长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的且具有重要生理功能的有益菌，它们数量的多和少，与人的健康与长寿非常重要。
人体肠道内乳酸菌拥有的数量，随着人的年龄增长会逐渐减少，当人到老年或生病时，乳酸菌数量可能下降100至1000倍，直到老年人临终完全消失。
在平时，健康人比病人多50倍，长寿老人比普通老人多60倍。
因此，人体内乳酸菌数量的实际状况，已经成为检验人们是否健康长寿的重要指标。
b.实验原理：
乳酸菌为一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称。
乳酸菌主要为乳杆菌属（Lactobacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)和嗜热链球菌属(Streptococcus）。
c.实验材料：食品检样（酸奶)
培养基：MRS 培养基、莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS培养基、MC培养基，无菌生理盐水
其它：超净工作台、无菌培养皿、移液枪、10ml离心管和恒温培养箱等。
d.实验步骤：
1、样品处理：
以无菌操作取检样15mL，放于135mL灭菌生理盐水，经充分振荡或研磨制成1:10的均匀稀释液。
吸取1mL1:10的稀释液依次做10倍梯度稀释，共10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 共6个稀释度。
2、乳酸菌计数:
2.1乳酸菌总数
乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1。
2.2双歧杆菌计数
根据对待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2~3个连续适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
稀释液移入平皿后，将冷却至48°℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。
37℃厌氧培养72h，培养后计数平板上的所有菌落数。
2.3嗜热链球菌计数
根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。
稀释液移入平皿后，将冷却至48°℃的MC培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀。
37C需氧培养72h，培养后计数。
嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背面为粉红色。
2.4乳杆菌计数
根据待检样品活菌总数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度.每个稀释度吸取1mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。
稀释液移入平皿后，将冷却至48°℃的MRS琼脂培养基倾注入平皿约15mL，转动平皿使混合均匀，37℃厌氧培养72h。
3、报告菌落数
选取菌落数在30-300cfu之间，无蔓延生长的平板计数，低于30的记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计，每个稀释度采用2个平行的均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;
若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数；
当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数；
乳酸菌菌落总数的计算方法同食品中菌落总数测定方法。
4、菌种鉴定（涂片镜检）
乳杆菌属菌体形态多样，呈长杆状、弯曲杆状或短杆状。
无芽胞，革兰氏染色阳性。
嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状，直径为0.5μm~2.0μm，成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。
双歧杆菌为革兰氏染色阳性，呈短杆状、纤细杆状或球形，可形成各种分支或分又等多形态，不抗酸，无芽孢，无动力。
乳酸菌检验报告
乳酸菌检验报告1. 引言本报告旨在对乳酸菌样本的检验结果进行详细分析和解释。
乳酸菌是一类益生菌，具有多种益处，包括改善肠道菌群平衡、促进消化系统健康等。
通过对乳酸菌样本的检验，了解其数量和种类，能够为人们提供有关肠道健康的重要指标。
本报告将详细介绍检验方法、结果分析以及相关建议。
2. 检验方法乳酸菌样本的检验通常采用以下方法之一：2.1 培养基法乳酸菌样本首先被接种在含有适宜营养物质的培养基上。
经过一段时间的培养，菌种将生长并形成可见的菌落数量。
通过观察培养基上形成的菌落数量和形态特征，可以初步了解乳酸菌的情况。
2.2 PCR法PCR法是一种通过扩增目标DNA片段的技术。
在乳酸菌检验中，可以通过PCR方法扩增乳酸菌特异性基因片段。
通过测量扩增产物的数量，可以推测乳酸菌样本中乳酸菌的数量。
2.3 16S rRNA测序法16S rRNA测序法是一种通过测序乳酸菌样本中16S rRNA基因的方法。
16S rRNA是一种在细菌中普遍存在的基因，其序列具有一定的保守性和变异性。
通过测序并比对乳酸菌样本中的16S rRNA序列，可以确定乳酸菌的种类。
3. 检验结果与分析3.1 培养基法检验结果经过培养基法检验，乳酸菌样本形成了X个可见的菌落，其形态特征为Y。
根据经验数据，通过数量与形态的分析，可以判断肠道菌群平衡的情况。
3.2 PCR检验结果PCR法检验得到的扩增产物数量为Z，据推测，乳酸菌样本中可能存在的乳酸菌数量约为W。
3.3 16S rRNA测序结果通过16S rRNA测序，确定了乳酸菌样本中存在的乳酸菌种类为A、B、C。
根据已知的乳酸菌种类特点，可以初步评估肠道健康状况。
4. 结果解释与建议根据乳酸菌检验结果，结合个人的生活习惯和饮食情况，可以给出以下解释和建议：•根据培养基法检验结果，乳酸菌样本形成的菌落数量适中，形态特征正常，表明肠道菌群平衡较好。
•根据PCR检验结果，乳酸菌样本中可能存在适量的乳酸菌，有益于维持肠道健康。
微生物的常规检验技术--乳酸菌的检验
四、乳酸菌的检验
４ 检验程序
四、乳酸菌的检验
５ 操作步骤--样品制备 ➢ 样品制备无菌操作程序： ➢ 第一步：冷冻样品 可先使其在2~5℃条件下解冻，时间不超过18h,也可在温度不超 过45℃的条件下解冻，解冻时间不超过15min； ➢ 第二步：固体和半固体食品 以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL生理盐水的 无菌均质杯内，8000 ~ 10 000 r/min均质1 ~ 2min，制成1:10样品匀液； ➢ 第三步：液体样品 应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL生 理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇,制成1:10的样 品匀液； ➢ 第四步：用1mL无菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于装有9mL生理盐水 的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹 打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液； ➢ 第五步：另取1mL无菌吸管，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管。
➢ 双歧杆菌培养:根据待检样品双歧杆菌含量的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度，每个稀
释度吸取0.1mL样品匀液于莫匹罗星锂盐改良 MRS琼脂平板，表面涂布，每稀释度做
两个平板。36℃±1℃，厌氧培养48h ±2h后计数平板上的所有菌落数。从样品稀释
到平板涂布要求在15min内完成；
➢ 嗜热链球菌培养:根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计，选择2~3个连续的适宜稀释度,每
培养皿1 培养皿2 平均数
xxxx5-乳酸菌检验(涂抹平板培养法)标准操作规程
规范乳酸菌检验过程
范围
适用于酵母菌等采用涂抹平板培养法的检验
职责
Lab tech
个人防护要求
物料/工具需求
无菌操作间、恒温培养箱（36±1℃）、振荡器、微量移液器及吸头、吸管（1ml、10ml）、平皿、试管、天平等、MRS（Man Rogosa Sharpe）培养基
编号
主要步骤
描述
图片显示
步骤要点
要点原因
样品制备
/
稀释样品匀液
以无菌操作取25g/ml
样品，放入装有225ml稀释剂的灭菌三角瓶中迅速振摇，将样品混匀，制成1：10的样品匀液
用1ml灭菌吸管准确吸取1：10的样品匀液10ml，放入装有9ml稀释剂试管中。迅速振摇，将样品混匀，制成1：100的样品匀液
平板接种
选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度，每个稀释度吸取 0.1 mL 样品
匀液分别置于 2 个 MRS 琼脂平板，使用 L 形棒进行表面涂布。
培养
立即放入36 ±1 பைடு நூலகம்恒温培养箱，厌氧培养 48 h±2 h。
菌落计数
选取菌落数在 30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30 CFU 的
平板记录具体菌落数，大于 300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
记录时，在换算到每g/ml样品中平板菌落数时，定下两位有效数字。也可将样品的平板菌落数记录为10的指数形式。
报告每g/ml样品中平板菌落数。
编制： 核准：
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。
乳酸菌检验实验注意事项
乳酸菌检验实验注意事项
《乳酸菌检验实验注意那些事儿》
嘿呀，提起这乳酸菌检验实验啊，那可真是有不少要注意的地方呢！
首先，咱得说说这实验准备吧，那可真是不能马虎。
什么培养基啊、试剂啊，都得准备得妥妥当当的，就跟咱出门得把手机钥匙带齐了一样重要。
要是缺这少那的，那实验还咋进行呀！
进入实验室，可得把白大褂穿好，别搞得到处脏兮兮的。
这时候就别心疼那白大褂了，它可是保护咱们不被那些细菌啥的沾上的好宝贝呢！
然后就是操作了。
操作的时候，手可得稳住了，别一抖一抖的，就跟帕金森似的。
要是不小心把样本弄洒了或者是搞混了，那可就悲剧咯！你想想，就好比本来要找的是“小李菌”，你却不小心把“小王菌”给带回来了，那能得出正确结果嘛！
在培养的时候，温度可得控制好，就像咱洗澡水，太烫了不行，太凉了也不行。
要是温度不合适，那乳酸菌说不定就“不开心”，不好好长了。
还有啊，别想着在实验过程中偷偷懒，该等多长时间就等多长时间，可别想走捷径。
不然等你发现结果不对的时候，那就只能呜呼哀哉啦。
做完实验，记得清理战场哦！那些用过的仪器设备啥的，都得收拾整齐，别丢三落四的，下次要用的时候找不到，那可就麻烦大了。
而且哦，实验过程中还得注意自身安全。
虽然这些小东西平时看着没啥，但是惹急了它们也是很可怕的哟！所以一定要严格按照规范来操作。
总之呢，这乳酸菌检验实验就跟咱平时做事一样，要认真、细致，还得有点耐心。
可别马马虎虎的，不然最后吃亏的还是自己。
每次做完实验，我都感觉像是打了一场仗一样，不过看着那最终的成果，心里还是蛮有成就感的呢！哈哈，希望大家也能在实验中找到乐趣，收获满满的成果呀！。
乳酸菌检验方法
河北世翔生物有限公司乳酸菌检验方法前言1.本检验方法针对公司各种形式（固态、液态）的乳酸菌菌微生物添加剂；2.本标准的制定依据GBT 23181-2008 、SNT 1941.1-2007、GB 478935-2010等国家标准制定；3.本标准由研发部起草，经公司总经理批准，公布之日起实施。
一、检验前的准备1.培养基及其试剂1.1盛有若干玻璃珠的无菌水225ml，1.2MRS琼脂培养基：牛肉膏10g蛋白胨10g酵母膏5g121℃，灭菌15-20min1.3培养皿12个，试管12个，涂布棒1个，用报纸包扎后灭菌1.4打开超净工作台，用消毒水或者酒精喷洒，工作台台面，打开紫外灯杀菌30分钟，打开风机，5分钟后，打开照明二、取样按照GB/T14699.1进行取样：用灭菌的铲子，选取有代表性的样品适量放入取样袋中，标注好取样日期，批次备用；液体取样使用灭菌的试管，在火焰保护下进行，完成后放入低温冰箱储藏。
三、检测步骤1. 以无菌操作称取试样25g（ml），加入225ml有玻璃珠的无菌水中，放在摇床上，200r/min，摇动30min，制成1：10的初始菌悬浮液。
取1：10的初始菌悬浮液0.5ml，加入4.5ml无菌水，经充分混匀后，制成1：100的稀释液。
依次方法依次稀释到1：1082.选择107 、108 二个稀释度，用移液枪分别吸取0.1ml，接种到3个营养琼脂平板上，使用涂布棒尽可能小心快速地涂布接种液于琼脂表面，涂布棒不得接触平皿边缘，涂布好的平皿改好，置室温中放置15min使接种物完全被琼脂吸收。
翻转上述平皿置于36±1℃培养箱中培养48±2h。
从样品稀释到涂布完成要求在15分钟内完成。
3.培养后，选取菌落数在30到300个之间的平板计数，低于30 CFU 平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。
每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
若平板中有较大片状菌落生长时，则不宜计数；若片状菌落步不到平板的一半，而其余一半分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2以代表全皿菌落数。
乳酸菌检测方法
一、乳酸菌检测方法植物乳杆菌的检验1原理植物乳杆菌能在相应的厌氧培养条件下，于MRS培养基表面生长成白色、细密、圆形光滑突起的菌落，根据长出的菌落数和稀释倍数，计算出活菌数。
2仪器与试药2.1 仪器超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱、电冰箱、恒温培养箱（60℃±1℃）、恒温水浴锅、显微镜（10x—100x）、架盘天平（0—500g，精确至0.5g）、250ml锥形瓶、250ml 盐水瓶、灭菌吸管：1ml(具0.01ml刻度）、10ml(具0.1ml刻度）、灭菌平皿（直径90mm）、灭菌试管（15mm×160mm）、灭菌L型玻璃棒等。
2.2 试药酪蛋白胨、牛肉浸膏、酵母提取物、琼脂等均为生化试剂；无水乙酸钠、柠檬酸三胺、硫酸镁、硫酸锰、葡萄糖、磷酸氢二钾、碳酸钙、吐温-80、氯化钠等均为分析纯；水为双蒸馏水，其他化学试剂均为分析纯。
2.3 MRS琼脂培养基的组成与制备2.3.1培养基的组成酪蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、无水乙酸钠5g、柠檬酸三胺3g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、磷酸氢二钾2.0g、碳酸钙20g、吐温-801ml、琼脂15g、蒸馏水1000ml。
2.3.2培养基制备将上述的各组分在80～90℃加热使溶解，校正pH6.2，加蒸馏水至1000ml中，摇匀，分装于盐水瓶，每瓶100ml。
在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。
2.4营养琼脂平板的制备取冷至45℃左右的MCA琼脂培养基，在无菌的条件下倒入无菌的培养皿中，每平皿各约15ml，待冷却凝固后，备用。
2.5无菌生理盐水的制备称取氯化钠9.0g，用蒸馏水溶解并定容于1000ml量瓶中，摇匀，分装于250ml三角瓶中，每瓶装90ml. 在121℃高压灭菌20分钟，冷却后备用。
3供试品溶液的制备以无菌操作法取检品10.0g，加入盛有90ml无菌生理盐的三角瓶中，充分振荡10分钟，制成1﹕10样品悬液。
食品中乳酸菌数的检验技术
样品中所包括乳酸菌菌属
培养条件的选择及结果说明
仅包括双歧杆菌属
按GB 4789.34的规定执行
仅包括乳杆菌属
按照乳杆菌计数操作
仅包括嗜热链球菌
按照嗜热链球菌计数操作
同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属
按照乳杆菌计数操作，结果即为乳酸菌总数
同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌 按照双歧杆菌计数和嗜热链球菌计数操作。两
5~10%CO2时，可增加其表面生长物。 发酵代谢，专性分解糖。产生大量乳酸和乳酸盐。生长
温度2~53℃，最适生长温度30~40 ℃。
双歧杆菌属的特征
一、乳酸菌概述
细胞呈多形态，单个或链状、V形、栅栏状排列。 革兰染色阳性(24h培养)，无芽胞、不抗酸、不运动。
厌氧，但不同的种对氧的敏感性不同。
厌氧 36±1℃ 72h±2h
三、注意事项
双歧杆菌在改良MRS琼脂平板上的 菌落特征为：平皿底为黄色，菌落 中等大小，瓷白色，边缘整齐光滑， 菌落呈圆形，直径为2.0 mm±1 mm。
嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特 征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的 红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背 面为粉红色
菌落一般光滑、凸圆，边缘完整、乳脂至白色。
生长温度25~45 ℃，最适温度37~41 ℃。 初始最适生长pH为6.5~7.0，pH4.0~5.0或
pH8.0~8.5不生长。
分解糖。对葡萄糖的代谢为异型发酵。触酶阴性。
链球菌属的特征
一、乳酸菌概述
成链状排列、革兰染色阳性兼性厌氧的球菌。 发酵葡萄糖的主要产物是乳酸，但不产气。 触酶阴性。通常溶血。 生长温度为25~45 ℃，最适温度为37 ℃。
二、乳酸菌检测流程
食品中乳酸菌数的检验技术
者结果之和即为乳酸菌总数
同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌
按照乳杆菌计数和嗜热链球菌计数操作。两者来自结果之和即为乳酸菌总数
同时包括双歧杆菌属、乳杆菌属和 按照乳杆菌计数和嗜热链球菌计数操作。两者
嗜热链球菌
结果之和即为乳酸菌总数
食品微生物检验技术
样品中所包括乳酸菌菌属
培养条件的选择及结果说明
仅包括双歧杆菌属
按GB 4789.34的规定执行
仅包括乳杆菌属
按照乳杆菌计数操作
仅包括嗜热链球菌
按照嗜热链球菌计数操作
同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属
按照乳杆菌计数操作，结果即为乳酸菌总数
同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌 按照双歧杆菌计数和嗜热链球菌计数操作。两
厌氧 36±1℃ 72h±2h
三、注意事项
双歧杆菌在改良MRS琼脂平板上的 菌落特征为：平皿底为黄色，菌落 中等大小，瓷白色，边缘整齐光滑， 菌落呈圆形，直径为2.0 mm±1 mm。
嗜热链球菌在MC琼脂平板上的菌落特 征为：菌落中等偏小，边缘整齐光滑的 红色菌落，直径2mm±1mm，菌落背 面为粉红色
菌落一般光滑、凸圆，边缘完整、乳脂至白色。
生长温度25~45 ℃，最适温度37~41 ℃。 初始最适生长pH为6.5~7.0，pH4.0~5.0或
pH8.0~8.5不生长。
分解糖。对葡萄糖的代谢为异型发酵。触酶阴性。
链球菌属的特征
一、乳酸菌概述
成链状排列、革兰染色阳性兼性厌氧的球菌。 发酵葡萄糖的主要产物是乳酸，但不产气。 触酶阴性。通常溶血。 生长温度为25~45 ℃，最适温度为37 ℃。
二、乳酸菌检测流程
25g（mL）样品+225mL无菌生理盐水 10倍系列稀释
食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验
中华人民共和国国家标准G B4789.35 2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验2016-12-23发布2017-06-23实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会前言本标准代替G B4789.35 2010‘食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验“㊁S N/T1941.1 2007‘进出口食品中乳酸菌检验方法第1部分:分离与计数方法“㊂本标准与G B4789.35 2010相比,主要变化如下:增加了乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明;修改了改良M R S培养基成分;修改了平板计数的接种方法和接种量㊂食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验1范围本标准规定了含乳酸菌食品中乳酸菌(l a c t i c a c i db a c t e r i a)的检验方法㊂本标准适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌的检验㊂2术语和定义2.1乳酸菌l a c t i c a c i db a c t e r i a一类可发酵糖主要产生大量乳酸的细菌的通称㊂本标准中乳酸菌主要为乳杆菌属(L a c t o b a c i l l u s)㊁双歧杆菌属(B i f i d o b a c t e r i u m)和嗜热链球菌属(S t r e p t o c o c c u s)㊂3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:3.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂3.2冰箱:2ħ~5ħ㊂3.3均质器及无菌均质袋㊁均质杯或灭菌乳钵㊂3.4天平:感量0.01g㊂3.5无菌试管:18mmˑ180mm㊁15mmˑ100mm㊂3.6无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或微量移液器及吸头㊂3.7无菌锥形瓶:500m L㊁250m L㊂4培养基和试剂4.1生理盐水:见A.1㊂4.2 M R S(M a nR o g o s aS h a r p e)培养基及莫匹罗星锂盐(L i-M u p i r o c i n)和半胱氨酸盐酸盐(C y s t e i n eH y d r o c h l o r i d e)改良M R S培养基:见A.2和A.3㊂4.3 M C培养基(M o d i f i e dC h a l m e r s培养基):见A.4㊂4.40.5%蔗糖发酵管:见A.5㊂4.40.5%纤维二糖发酵管:见A.5㊂4.60.5%麦芽糖发酵管:见A.5㊂4.70.5%甘露醇发酵管:见A.5㊂4.80.5%水杨苷发酵管:见A.5㊂4.90.5%山梨醇发酵管:见A.5㊂4.100.5%乳糖发酵管:见A.5㊂4.11七叶苷发酵管:见A.6㊂4.12革兰氏染色液:见A.7㊂4.13莫匹罗星锂盐(L i-M u p i r o c i n):化学纯㊂4.14半胱氨酸盐酸盐(C y s t e i n eH y d r o c h l o r i d e):纯度>99%㊂5检验程序乳酸菌检验程序见图1㊂图1乳酸菌检验程序图6操作步骤6.1样品制备6.1.1样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序㊂6.1.2冷冻样品可先使其在2ħ~5ħ条件下解冻,时间不超过18h,也可在温度不超过45ħ的条件解冻,时间不超过15m i n㊂6.1.3固体和半固体食品:以无菌操作称取25g样品,置于装有225m L生理盐水的无菌均质杯内,于8000r/m i n~10000r/m i n均质1m i n~2m i n,制成1ʒ10样品匀液;或置于225m L生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1m i n~2m i n制成1ʒ10的样品匀液㊂6.1.4液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25m L放入装有225m L生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分振摇,制成1ʒ10的样品匀液㊂6.2 步骤6.2.1 用1m L 无菌吸管或微量移液器吸取1ʒ10样品匀液1m L ,沿管壁缓慢注于装有9m L 生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不要触及稀释液),振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀,制成1ʒ100的样品匀液㊂6.2.2 另取1m L 无菌吸管或微量移液器吸头,按上述操作顺序,做10倍递增样品匀液,每递增稀释一次,即换用1次1m L 灭菌吸管或吸头㊂6.2.3 乳酸菌计数6.2.3.1 乳酸菌总数乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明见表1㊂表1 乳酸菌总数计数培养条件的选择及结果说明样品中所包括乳酸菌菌属培养条件的选择及结果说明仅包括双歧杆菌属按G B4789.34的规定执行仅包括乳杆菌属按照6.2.3.4操作㊂结果即为乳杆菌属总数仅包括嗜热链球菌按照6.2.3.3操作㊂结果即为嗜热链球菌总数同时包括双歧杆菌属和乳杆菌属1) 按照6.2.3.4操作㊂结果即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作同时包括双歧杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.2和6.2.3.3操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作同时包括乳杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 6.2.3.3结果为嗜热链球菌总数;3) 6.2.3.4结果为乳杆菌属总数同时包括双歧杆菌属,乳杆菌属和嗜热链球菌1) 按照6.2.3.3和6.2.3.4操作,二者结果之和即为乳酸菌总数;2) 如需单独计数双歧杆菌属数目,按照6.2.3.2操作6.2.3.2 双歧杆菌计数根据对待检样品双歧杆菌含量的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的M R S 培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ厌氧培养72h ʃ2h ,培养后计数平板上的所有菌落数㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.2.3.3 嗜热链球菌计数根据待检样品嗜热链球菌活菌数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的M C 培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ需氧培养72h ʃ2h ,培养后计数㊂嗜热链球菌在M C 琼脂平板上的菌落特征为:菌落中等偏小,边缘整齐光滑的红色菌落,直径2m mʃ1m m ,菌落背面为粉红色㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.2.3.4 乳杆菌计数根据待检样品活菌总数的估计,选择2个~3个连续的适宜稀释度,每个稀释度吸取1m L 样品匀液于灭菌平皿内,每个稀释度做两个平皿㊂稀释液移入平皿后,将冷却至48ħ的M R S 琼脂培养基倾注入平皿约15m L ,转动平皿使混合均匀㊂36ħʃ1ħ厌氧培养72h ʃ2h ㊂从样品稀释到平板倾注要求在15m i n 内完成㊂6.3菌落计数注:可用肉眼观察,必要时用放大镜或菌落计数器,记录稀释倍数和相应的菌落数量㊂菌落计数以菌落形成单位(c o l o n y-f o r m i n g u n i t s,C F U)表示㊂6.3.1选取菌落数在30C F U~300C F U之间㊁无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数㊂低于30C F U 的平板记录具体菌落数,大于300C F U的可记录为多不可计㊂每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数㊂6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数㊂6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时,则将每条单链作为一个菌落计数㊂6.4结果的表述6.4.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内,计算两个平板菌落数的平均值,再将平均值乘以相应稀释倍数,作为每克或每毫升中菌落总数结果㊂6.4.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时,按式(1)计算:N=ðC(n1+0.1n2)d (1)式中:N 样品中菌落数;ðC 平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1 第一稀释度(低稀释倍数)平板个数;n2 第二稀释度(高稀释倍数)平板个数;d 稀释因子(第一稀释度)㊂6.4.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于300C F U,则对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算㊂6.4.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30C F U,则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂6.4.5若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数计算㊂6.4.6若所有稀释度的平板菌落数均不在30C F U~300C F U之间,其中一部分小于30C F U或大于300C F U时,则以最接近30C F U或300C F U的平均菌落数乘以稀释倍数计算㊂6.5菌落数的报告6.5.1菌落数小于100C F U时,按 四舍五入 原则修约,以整数报告㊂6.5.2菌落数大于或等于100C F U时,第3位数字采用 四舍五入 原则修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,按 四舍五入 原则修约后,采用两位有效数字㊂6.5.3称重取样以C F U/g为单位报告,体积取样以C F U/m L为单位报告㊂7结果与报告根据菌落计数结果出具报告,报告单位以C F U/g(m L)表示㊂8乳酸菌的鉴定(可选做)8.1纯培养挑取3个或以上单个菌落,嗜热链球菌接种于M C琼脂平板,乳杆菌属接种于M R S琼脂平板,置36ħʃ1ħ厌氧培养48h㊂8.2鉴定8.2.1双歧杆菌的鉴定按G B4789.34的规定操作㊂8.2.2涂片镜检:乳杆菌属菌体形态多样,呈长杆状㊁弯曲杆状或短杆状㊂无芽胞,革兰氏染色阳性㊂嗜热链球菌菌体呈球形或球杆状,直径为0.5μm~2.0μm,成对或成链排列,无芽胞,革兰氏染色阳性㊂8.2.3乳酸菌菌种主要生化反应见表2和表3㊂表2常见乳杆菌属内种的碳水化合物反应菌种七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇水杨苷山梨醇蔗糖棉子糖干酪乳杆菌干酪亚种(L.c a s e i s u b s p.c a s e i)+++++++-德氏乳杆菌保加利亚种(L.de l b r u e c k i is u b s p.b u l g a r i c u s)--------嗜酸乳杆菌(L.a c i d o p h i l u s)+++-+-+d 罗伊氏乳杆菌(L.r e u t e r i)N D-+---++鼠李糖乳杆菌(L.r h a m n o s u s)+++++++-植物乳杆菌(L.p l a n t a r u m)++++++++注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性;d表示11%~89%菌株阳性;N D表示未测定㊂表3嗜热链球菌的主要生化反应菌种菊糖乳糖甘露醇水杨苷山梨醇马尿酸七叶苷嗜热链球菌(S.t h e r m o p h i l u s)-+-----注:+表示90%以上菌株阳性;-表示90%以上菌株阴性㊂附录A培养基及试剂A.1生理盐水A.1.1成分N a C l8.5gA.1.2制法将上述成分加入到1000m L蒸馏水中,加热溶解,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.2M R S培养基A.2.1成分蛋白胨10.0g牛肉粉5.0g酵母粉4.0g葡萄糖20.0g吐温801.0m LK2H P O4㊃7H2O2.0g醋酸钠㊃3H2O5.0g柠檬酸三铵2.0gM g S O4㊃7H2O0.2gM n S O4㊃4H2O0.05g琼脂粉15.0gA.2.2制法将上述成分加入到1000m L蒸馏水中,加热溶解,调节p H至6.2ʃ0.2,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.3莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良M R S培养基A.3.1莫匹罗星锂盐储备液制备:称取50m g莫匹罗星锂盐加入到50m L蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂A.3.2半胱氨酸盐酸盐储备液制备:称取250m g半胱氨酸盐酸盐加入到50m L蒸馏水中,用0.22μm微孔滤膜过滤除菌㊂A.3.3制法将A.2.1成分加入到950m L蒸馏水中,加热溶解,调节p H,分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂临用时加热熔化琼脂,在水浴中冷至48ħ,用带有0.22μm微孔滤膜的注射器将莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到熔化琼脂中,使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50μg/m L,半胱氨酸盐酸盐的浓度为500μg/m L㊂A.4M C培养基A.4.1成分大豆蛋白胨5.0g牛肉粉3.0g酵母粉3.0g葡萄糖20.0g乳糖20.0g碳酸钙10.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m L1%中性红溶液5.0m LA.4.2制法将前面7种成分加入蒸馏水中,加热溶解,调节p H至6.0ʃ0.2,加入中性红溶液㊂分装后121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.5乳酸杆菌糖发酵管A.5.1基础成分牛肉膏5.0g蛋白胨5.0g酵母浸膏5.0g吐温800.5m L琼脂1.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4m L蒸馏水1000m LA.5.2制法按0.5%加入所需糖类,并分装小试管,121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.6七叶苷培养基A.6.1成分蛋白胨5.0g磷酸氢二钾1.0g七叶苷3.0g枸橼酸铁0.5g1.6%溴甲酚紫酒精溶液1.4m L蒸馏水100m LA.6.2制法将上述成分加入蒸馏水中,加热溶解,121ħ高压灭菌15m i n~20m i n㊂A.7革兰氏染色液A.7.1结晶紫染色液A.7.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20m L1%草酸铵水溶液80m LA.7.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.7.2革兰氏碘液A.7.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.7.2.2制法将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.7.3沙黄复染液A.7.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10m L蒸馏水90m LA.7.3.2制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A.7.4染色法A.7.4.1将涂片在酒精灯火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1m i n,水洗㊂A.7.4.2滴加革兰氏碘液,作用1m i n,水洗㊂A.7.4.3滴加95%乙醇脱色,约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A.7.4.4滴加复染液,复染1m i n㊂水洗㊁待干㊁镜检㊂。
实验一乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验
引言概述：乳酸菌饮料是一种富含乳酸菌的食品，乳酸菌在食品工业中广泛应用于酸奶、乳饮料等产品中。
本文将详细介绍乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法。
正文内容：一、样品采集和制备1.确定样品采集时机：乳酸菌饮料中的乳酸菌数量会随着储存时间的增加而增加或减少，因此需要在存储时间稳定的情况下进行采集。
2.采集样品方法：使用无菌技术采集样品，避免外部微生物的污染。
3.样品制备：将采集到的样品进行均匀搅拌，以保证样品的均匀性。
二、总菌数检验方法1.琼脂平板法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，在琼脂平板上涂布，经过一定孵育时间后，根据菌落的数量计算总菌数。
2.膜过滤法：将样品通过膜过滤器过滤，将过滤后的膜放置在琼脂平板上孵育，根据菌落的数量计算总菌数。
三、乳酸菌检验方法1.培养基选择：根据乳酸菌的生长特性选择适合的培养基，常见的培养基有MRS培养基、LBS培养基等。
2.乳酸菌的分离：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在选定的培养基上。
经过一定孵育时间后，可以观察到乳酸菌形成的菌落。
3.鉴定乳酸菌：使用形态学观察、生理生化试验和分子生物学方法等进行乳酸菌的鉴定。
四、活菌数检验方法1.孵育培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，均匀涂布在含有乳酸菌生长所需营养物质的培养基上。
经过一定孵育时间后，观察活菌的生长情况，计算活菌数。
2.阻碍培养基法：将样品制备成一定稀释倍数的悬浮液，与含有抑制剂的培养基混合。
通过观察生长情况，计算活菌数。
五、质量指标评价方法1.pH值测定：使用pH计或试纸对乳酸菌饮料中的pH值进行测定，根据标准范围评价产品的质量。
2.乳酸浓度测定：使用乳酸测定仪器或化学试剂对乳酸菌饮料中的乳酸浓度进行测定，根据标准范围评价产品的质量。
3.品尝评价：通过专业的品尝人员进行品尝评价，评估乳酸菌饮料的口感和风味。
总结：乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验方法包括样品采集和制备、总菌数检验、乳酸菌检验、活菌数检验和质量指标评价方法。