红曲霉发酵洛伐他汀的一些研究

15.97 mg/L。
不同诱导剂对洛伐他汀产量的影响
由图 5-1 可知，不同 类型的酵母诱导剂均 可促进菌体的生长和 次生代谢产物的合成。 酵母组、酵母滤液组、 酵母破壁液组中洛伐 他 汀 产 量 分 别 为 215.97、263.15、 284.34mg/L ，较对照 组分别提高了 0.52 、 0.85、1.00 倍，其中 添加酵母破壁液的效 果最好。
值为 5.0时，洛伐他汀合成量能够达到最大值。
在对红曲霉发酵条件优化过程中发现，红曲霉发酵 培养温度、菌丝接种量、溶氧量、培养时间均会对 红曲霉生物量及代谢产物有较大影响。单因素最佳
工艺参数为：培养温度 28℃、菌丝接种量 10%、溶
氧量 96.7%、培养时间 15 d，得到洛伐他汀最高产 量为 127.31 mg/L。
• 菌丝接种量对洛伐他汀的影响
菌丝接种量往往能够直接影响产物的生成量和发酵
的经济成本。菌丝接种量较小时，发酵前期菌体生 长慢，使发酵周期延长，增加生产成本；菌丝接种 量较大时，发酵初期菌体生长较快，会使发酵液粘 度增加，导致溶氧不足或基质匮乏，也会使洛伐他 汀的合成量下降。
由图 4-7 可知，接种量 ＜ 10% 时，洛伐他汀产量 较低，说明此阶段菌种未 生长完全，需要延长发酵
在红曲霉发酵生长的第一天添加不同种类的酵母细胞，检测酵母 细胞作为红曲霉生长诱导剂所发挥的作用，如表 5-1 所示。
由表 5-1 可知，不同种类的酵母基本都能够促进红曲 霉合成洛伐他汀，但影响程度不尽相同。其中酿酒酵 母添加组对红曲生长及产物积累能力帮助最大，使红
曲霉生物量提高至 41.97 g/L，洛伐他汀产量达到 2
菌种的分离结果
不同红曲霉菌株的洛伐他汀产量
发酵培养基及发酵条件优化
在发酵合成过程中发现，培养条件对产物的合成积 累至关重要。 碳源和氮源作为限制性底物对红曲霉发酵过程至关 重要，是决定比细胞生长速率和产物积累量的主要 因素。 碳源不足会易引起菌体的衰老和自溶；氮源不足会 导致菌体生长缓慢，氮源过多，则微生物生长过于 旺盛，不利于代谢产物的积累
红曲霉洛伐他汀 的发酵
目录
1、实验菌种 2、发酵培养基及发酵条件优化 3、酵母菌对洛伐他汀的诱导作用
菌种的分离结果
• 选取红米、红腐乳、泡菜、土壤等红曲普遍 存在的样品作为筛选样本，并利用红曲霉嗜 乳酸、嗜乙醇的特性，通过选择性培养基有 针对性的对红曲霉进行筛选培养。最终通过 形态学鉴定，初步鉴定得到 18 株红曲霉。
培养条件对红曲发酵产洛伐他汀的 影响
• 培养温度对洛伐他汀的影响
由图 4-6 所示，当温 度低于 28℃时，低温 会抑制红曲霉细胞的 生长，因此直接影响 了洛伐他汀的生成量。 当温度达到 28℃时， 细胞有较好生长温度， 能够快速生长，并且 在该温度条件下，洛 伐他汀的合成量达到 最大值，约为 135.35 mg/L。
碳源对洛伐他汀产量的影响
本试验选用以下五种碳源进行比较：葡萄糖，蔗糖，麦芽糖， 淀粉，甘油，乳糖。
•
碳源浓度对洛伐他汀产量的影响
氮源对洛伐他汀产量的影响
• 氮源种类对洛伐他汀产量的影响
• 氮源浓度对洛伐他汀产量的影响
由图 4-4 可知， 黄豆粉的添加量对 色素的产生能力影 响不大，而对洛伐 他汀的产生积累有 较大影响，在 3 g/L 黄豆粉添加量 时，洛伐他汀产量 达最大值，约为 123.52 mg/L。
不同酵母培养时间对洛伐他汀产量的影响
由图 5-3 可以 看出，酵母培养 时间的不同直接 影响着红曲霉生 物量及洛伐他汀 的产量，当酵母 培养时间为 2 d 时，洛伐他汀产 量最高，达到 327.43 mg/L。
• 诱导剂添加时间对洛伐他汀产量的影响
由图 5-4 可以看出， 在红曲霉发酵过程的 不同时间添加酵母破 壁液均能提高红曲 霉菌体生物量与洛伐 他汀产量，在第 0 d 向红曲霉中添加酵母 破壁液，即酵母破壁 液与红曲霉同时接入 培养基中，所得到的 洛伐他汀产量最高， 达 327.43 mg/L。
时间；接种量较高(＞10%)
时，洛伐他汀产量受到显 著抑制。因此，试验选用 10% 接种量参数较为适宜。
• 溶氧量对洛伐他汀的影响 由图 4-8 可以看出， 溶氧量较低时，由于 菌丝体的生长速率被 限制，会进一步影响 菌体的产酶代谢，致 使洛伐他汀及色素产 量下降。较高溶氧量 利于洛伐他汀的合成 积累，当溶氧量达到 96.7%左右时，洛伐 他汀产量最高，约为 127.37 mg/L。
• 酵母破壁液添加量对洛伐他汀产量的影响
由 图 5 -5 可 以 明显看出，酵母 破壁液能够显著 促进红曲霉的菌 体生长能力。在 添加量为 1.5 mL 时，洛伐他 汀产量能够达到 最大值，约为 329.01mg/L。
• 酵母破壁液对红曲霉发酵生长及洛伐他汀产量的影响
从图 5-6 能够看出，酵母 破壁液的添加能够极大促进 红曲霉生物量的提高和次级 代谢产物洛伐他汀的合成分 泌，其中红曲霉生物量提高 到 40.56 g/L，较对照组提 高了0.45 倍。洛伐他汀产 量在红曲霉培养第 13 d 达 到最大值，较对照组洛伐他 汀产量达到最大值的时间提 前了 2 d，最高产量约为 334.01 mg/L，与对照组相 比提高了 1.32 倍。
酵母菌对洛伐他汀的诱导作用
研究表明，红曲霉与乳酸菌、酵母菌或其他真菌诱 导子由于培养条件相似，在混合培养时，能够提高 红曲色素产量，这提示其他微生物的某些酶和代谢
物对红曲霉的培养具有促进作用。
Shin 等人够显著提高红曲霉菌体生物量以及红曲色素 产量。可能由于酵母滤液中含有壳聚糖酶，能够轻微分解
红曲霉细胞壁，促进菌体生长，而红曲霉自身为了防御外
界刺激而产生疏水性物质如红曲色素等。而洛伐他汀也属 于疏水性物质范畴，并且洛伐他汀与红曲色素的代谢途径 中部分相同，具有相同的合成前体物质——聚酮类化合物， 由此推断酵母滤液等诱导剂会对红曲霉发酵产生的洛伐他
汀有一定影响。
酵母种类对洛伐他汀产量的影响
总结
对 H8 红曲霉发酵培养基成分进行优化，综合比较 碳源和氮源对红曲霉生长及代谢产物的影响。结果 表明快速碳源并不利于洛伐他汀的合成积累，而慢
速碳源甘油对洛伐他汀产量的积累最有利，最佳添
加量为 60 mL/L 。在有机氮源的选择中，黄豆粉对 洛伐他汀的产量积累效果最好，最佳添加量为 3 g/ L。在对发酵培养基初始 pH 值的考察中发现，菌株 积累洛伐他汀的能力在酸性条件最为适宜。当 pH
通过考察酵母诱导剂类型、酵母细胞培养的不同时 间、诱导剂添加时间以及添加量等因素对红曲霉生 长及代谢的影响，确定了最佳诱导培养参数：酵母 诱导剂类型为酵母破壁液，酵母细胞作为诱导剂的 最佳培养时间为 2 d，诱导剂添加时间为红曲霉发 酵的第 0 d(即初始培养时)，添加量为 1.5 mL。 由于酵母破壁液的诱导，使洛伐他汀达到最大产值 的时间由对照组的 15 d 缩短为13 d，极大节省了 发酵过程中的生成成本。最终得到洛伐他汀产量为 334.01 mg/L，较对照组提高了 1.35 倍。
微生物在利用营养物质时，由于酸碱性物质的合成 积累或代谢酸物质的生成，能够使培养环境中的酸 碱性发生变化。在配制发酵培养基时，pH 值对细胞
生长以及代谢产物的影响也要重点考虑。
由图 4-5 可知，菌 株积累洛伐他汀与 色素的能力在酸性 条件下为宜。当 pH 值为5.0 时，洛伐 他汀的产量达到最 大值，约为 132.54 mg/L，当 pH 值继 续升高时，洛伐他 汀产量下降幅度较 大。
培养基初始 pH 值对洛伐他汀产量的影 响
• 培养基中的酸碱性会对微生物生长有显著影响，可 以影响菌体对基质的利用速率、菌体生长速率、细 胞的结构状态和菌体细胞膜的电荷状况等，同时影
响发酵过程中各种酶活，从而影响代谢产物的变化
以及代谢产物的稳定性。此外，在发酵过程中，pH 值也会引起细胞膜通透性以及菌体形态的变化，进 一步影响菌体对养分的吸收和代谢产物的分泌过程。
• 培养时间对细胞生长及代谢产物的影响 从图中可以看出， 当培养时间达到
15 d 时，洛伐他
汀的积累量基本 达到最大值，约 为 127.31 mg/L 。
• 模型最优解计算及验证试验 利用 Matlab7.0 对回归方程进行规划求解，求得模 型参数：z1=28.43，z2=10.10，z3=5.00，代入回归
方程求得 Ym=141.43。最终得到最佳工艺参数为：
培养温度 28.43℃，接种量 10.10%，pH 5.0，模型 估计洛伐他汀产量为 141.43 mg/L。
由表 4-4 可知，实际试验结果符合模型在置信区间 Y±2.20 的浮动误差， 5 次试验得到洛伐他汀产量平均值为 142.51 mg/L。
最终确定最优培养基组成成分为：甘油 60 mL/L，N aNO33 g/L，黄豆粉 3 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7 H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L，
PH 5.0。最优发酵工艺参数为：培养温度 28.43℃，
接种量 10.10%，溶氧量 96.7%，培养时间 15d。在 此培养条件下，得到 H8 红曲霉发酵合成洛伐他汀 的产量为 142.51 mg/L。