ELISA试剂配制及实验流程
ELISA试剂及操作步骤
操作方法1、包被：用包被液CBS稀释包被抗原至菌含量为2×108cfu，酶标板中每孔加入50μl，湿盒内室温或4℃或37℃过夜包被。
2、洗涤：弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。
3、封闭：每孔加封闭液（1%BSA）250μl，（10ml 5%。
0.5g）37℃封闭2h。
4、洗涤：用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。
5、结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔50μl，要设立阴性对照，37℃孵育1.5h。
6、洗涤：同上。
7、结合二抗：每孔加用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP（稀释倍数根据产品不同有所不同，可按说明书进行）50μl，37℃孵育1.5h。
8、洗涤：同上。
9、显色：每孔加底物溶液（OPD）50μl (配10ml) ，置室温暗盒内显色10min。
10、待显色后，每孔加入50μl终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。
使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平。
ELISA 检测所用主要试剂：包被缓冲液：0.05mol/L ，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS ）Na 2CO 3 l.59gNaHCO 3 2.93g加去离子水水至1000ml ，调pH 值到9.6。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
磷酸盐缓冲溶液（1×PBS ）：0.01 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO4 0.2gKCl 0.2gNa 2HPO 4·12H 2O 2.9g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
10×PBS ：0.2 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO 4 2.4gKCl 2.0gNa 2HPO 4·12H 2O 36.05g 或Na 2HPO 4 14.4g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
ELISA操作规程
ELISA操作规程一、引言ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种常用的免疫学实验技术，用于检测特定抗原或者抗体的存在和浓度。
本文将介绍ELISA的操作规程，包括试剂准备、样品处理、板上反应、洗涤、检测和数据分析等步骤。
二、试剂准备1. 缓冲液的配制：根据实验需求，选择适当的缓冲液配方。
常用的缓冲液有PBS、TBST等。
按照配方将所需试剂溶解于适当的体积的去离子水中，并进行调节和混合。
确保所有试剂的pH值和浓度符合实验要求。
2. 标准曲线的制备：准备一系列已知浓度的标准样品，按照实验设计的需求进行稀释。
标准样品的浓度应该覆盖实验样品的范围，并且至少包含一个空白对照。
3. 酶标板的涂覆：根据实验需要，选择合适的酶标板（如96孔板），将需要检测的抗原或者抗体溶解在适当的缓冲液中，按照要求的浓度将其加入到酶标板的孔中。
尽量避免气泡的产生，并确保涂覆均匀。
三、样品处理1. 样品采集：根据实验目的，选择合适的样品类型（如血清、尿液、细胞上清等），并进行采集。
确保样品的采集过程符合规范，避免污染和损坏。
2. 样品稀释：根据实验要求，将样品进行适当的稀释。
通常，样品的初始浓度较高，需要进行多次稀释以使其浓度在标准曲线范围内。
3. 预处理：根据实验需求，对样品进行预处理，如去除杂质、离心沉淀等。
确保样品的处理过程不会影响到所需的分析结果。
四、板上反应1. 标准样品的加入：将标准样品按照实验设计的要求加入到酶标板的孔中。
每一个标准样品应该有至少两个孔进行重复测量，以提高结果的可靠性。
2. 样品的加入：将稀释后的样品加入到酶标板的孔中。
同样，每一个样品应该有至少两个孔进行重复测量。
3. 阳性和阴性对照的加入：为验证实验的准确性，加入阳性和阴性对照。
阳性对照顾该包含所需的抗原或者抗体，而阴性对照则不含。
4. 孔板的封闭：将酶标板封闭，避免样品的蒸发和污染。
可以使用密封膜或者盖板进行封闭。
五、洗涤1. 洗涤缓冲液的配制：根据实验要求，配制适当的洗涤缓冲液。
ELISA实验步骤及所需试剂耗材
转载自拓诚生物 2011年03月06日09:37ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
它是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。
此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。
(一)原理ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。
由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。
在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。
即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。
比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
(二)操作步骤方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
(简称洗涤，下同)。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及所需的材料和试剂。
一、所需材料和试剂：1.微孔板：常用的有96孔板和384孔板。
2.吸液罐：用于储存洗涤缓冲液，洗涤吸液时使用。
3.移液管和移液器：用于分配试剂和液体。
5.吸管：用于混合试剂。
6.洗涤缓冲液：用于洗涤微孔板。
7.阻断缓冲液：用于阻断非特异性结合位点。
8.抗原或抗体：需要检测的物质。
9.辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体：将HRP与特异性抗体结合，用于检测特定抗原或抗体。
10.底物：通常使用的底物为TMB（3，3'，5，5'四甲基苯胺）。
11.停止液：用于停止底物的反应，通常是盐酸。
二、基本步骤：1.预处理微孔板：将所需用的孔板放入洗涤缓冲液中，轻轻浸泡几分钟，然后在洗涤缓冲液中彻底洗涤。
2.标记孔板：使用墨汁笔在孔板上标记样品的不同位置和信息，以便识别。
3.加入抗原或抗体：将待检测的抗原或抗体加入到相应的孔中，注意控制孔中液体的体积。
4.孵育反应：将孔板覆盖并在恒温箱或孵育箱中孵育一段时间，以使抗原或抗体与微孔板结合。
5.洗涤孔板：轻轻地将孔板上的液体倾倒掉，然后将洗涤缓冲液加入到孔中，摇晃孔板以充分洗涤。
6.加入HRP标记抗体：将HRP标记抗体加入到孔中，使其与已检测的抗原或抗体结合。
7.孵育反应：将孔板覆盖并继续在恒温箱或孵育箱中孵育一段时间，以使HRP标记抗体与已结合的抗原或抗体结合。
8.洗涤孔板：重复步骤5以去除未结合的HRP标记抗体。
9.加入底物：将底物加入到孔中，用于检测HRP的酶活性。
10.反应时间：将孔板暴露在黑暗条件下，让底物与HRP反应一段时间，产生颜色反应。
11.加入停止液：用停止液停止底物反应，并阻止进一步的颜色生成。
12.测量：使用酶标仪或光度计测量孔板中各孔的颜色强度，颜色的强度与抗原或抗体的浓度成正比。
以上是ELISA试验的基本步骤及所需的材料和试剂。
ELISA试验具有灵敏度高、准确性好、高通量等优点，因此被广泛应用于医学、生物学、农业等领域的疾病诊断、免疫学研究和生物药物分析等。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA基本步骤和主要试剂、材料注意：本步骤为间接ELISA步骤一主要步骤1 包被取所要包被的物质，提前设计好所需浓度，根据包被孔数计算所需包被物的量，用包被液稀释至所需体积，分加至各孔中。
包被条件：两种选择：一是将ELISA板直接置4℃过夜；也可以先置37℃孵育2小时再转入4℃过夜。
2 洗涤包被结束后弃掉包被液，用PBST进行洗涤，方法为PBST加满每孔，静置5-10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封闭。
3 封闭常用10%小牛血清，取第2步的ELISA板加封闭液至每孔，体积至少为所加包被液的两倍。
封闭条件也有两种选择：直接置于4℃过夜，或者置于37℃温育2-4h，具体何种条件不同物质的ELISA可能不同。
4 洗涤封闭结束的ELISA板进行洗涤，方法同步骤2。
最后拍干等待加入一抗。
5 加入一抗一抗即为你要检测的物质，一般加之前需要稀释，具体稀释倍数不同实验不同需要自己摸索。
一抗样品一般用包被液稀释，稀释到所需浓度后加入到相应孔中。
反应条件为37℃孵育2h。
6 洗涤。
4具体同步骤．7 加相应HRP-标记的商品化二抗加相应的商品化HRP-标记的二抗（如一抗为鼠源物质则对应加抗鼠二抗），一般也用封闭液稀释，稀释倍数参考二抗说明书。
将稀释好的二抗加入各孔，37℃反应1-1.5h。
8 洗涤具体同步骤4。
9 显色常用OPD作为显色底物，但OPD致癌，也有用TMB作为底物，，这里只介绍前者。
显色需要配置显色液，具体方法为：在步骤8进行到一半使配置显色液，为10ml 底物缓冲液加0.015g OPD粉末（实际操作由于OPD有毒不方便称量故只需稍微加入一点即可），等待OPD完全溶解。
待步骤8完成后取150ul 3%过氧化氢溶液加入之前配置的10ml溶液中混匀，立即将此显色液分加至ELISA各孔中。
然后将ELISA板置于37℃反应约10min。
10 终止将ELISA板取出，每孔加终止液（2mol/L硫酸溶液）终止反应，立即到酶标仪上读数（OPD为底物是读数波长为490nm，TMB为底物时波长为450nm）。
如何配elisa标准品
如何配elisa标准品在进行elisa标准品的配制之前，首先需要准备好所需的材料和设备。
材料包括elisa标准品、稀释液、洗涤缓冲液、底物液、停止液等，设备包括移液器、离心机、洗板机等。
接下来，按照以下步骤进行elisa标准品的配制：步骤一，准备工作。
首先，准备好工作台面和所需的材料和设备，确保工作环境干净整洁，避免外界因素对实验结果的影响。
步骤二，标准品稀释。
取出elisa标准品，并根据实验方案中的要求，将其稀释至所需的浓度。
在稀释的过程中，需要使用移液器准确地加入适量的稀释液，确保标准品的浓度符合实验要求。
步骤三，洗板。
将elisa板放置在洗板机中，并加入洗涤缓冲液进行洗板。
洗板的目的是去除板上的杂质和残留物，保证实验的准确性。
步骤四，添加标准品。
将稀释好的elisa标准品加入洗净的elisa板中，每个孔位加入适量的标准品溶液，然后将elisa板放入孵育箱中进行孵育。
步骤五，底物反应。
取出孵育好的elisa板，倒掉板上的液体，然后加入底物液进行反应。
底物液的加入会引起颜色的变化，根据实验方案中的要求，控制反应的时间和温度。
步骤六，停止反应。
在底物反应的时间到达后，加入停止液停止反应。
停止液的加入会停止底物反应，避免颜色进一步变化，同时保留实验结果。
步骤七，测定吸光度。
最后，使用酶标仪或多功能酶标仪测定elisa板上各孔位的吸光度值，根据吸光度值计算出标准品的浓度，并绘制标准曲线。
通过以上步骤，我们就完成了elisa标准品的配制工作。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行操作，确保实验结果的准确性和可重复性。
同时，实验结束后要及时清理实验台面和设备，保持实验环境的整洁。
希望本文对您有所帮助，如有疑问，请随时与我们联系。
ELISA实验操作
Elisa一常用试剂1 pbs贮存液（1×）Nacl 8.5g Na2HPO4·12H2O 2.85g (或Na2HPO4··2H2O 1.13) KCL 0.2g KH2PO4 0.27g溶于1000ml，置室温或4℃保存备用2 抗原包被液（CBS 1×）碳酸盐缓冲液。
取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g ，去离子水950ml，调节ph9.6 加去离子水至1000ml。
4度保存。
3 封闭液称取5g脱脂奶粉，溶解于100mlPBS中，混匀4℃保存备用（4℃保存不宜超过3天）。
或牛血清蛋白2mg加入0.01mol/L PH=7.4 PBS 至100ml4 洗液将0.5mlTWEEN-20加入1L的PBS中，混匀，室温保存备用5 显色液①TMB贮存液：称TMB粉末，用DMSO (二甲基亚砜)配成1.5mg/ml的贮存液，－20℃分装保存。
②NaAc（乙酸钠）缓冲液：配制200mM的NaAc缓冲液,用HAc调节PH值至5.3③H2O2:配制0.03%的H2O2④使用时显色液配方：TMB贮存液：NaAc缓冲液： H2O2溶液＝1：4：5现配现用。
6 终止液（2M硫酸）将100ml浓硫酸缓慢加入900ml水中（注意：必须往水中滴加浓硫酸），室温保存备用二操作步骤1 包被：将抗原用CBS稀释，一般为5μg/ml，加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜（37℃ 1小时）2 封闭：将包被液弃去，洗板三次，每孔加入200μl封闭液，37℃放置1小时（或4℃过夜）3 加入样本：弃去封闭液，加入样本，每孔100μl，37℃放置1小时4 洗涤：每孔加入250μl洗液，洗涤4次，拍干5 加入二抗：酶标羊抗鼠用封闭液稀释至工作浓度，每孔加入100μl，37℃放置0.5小时（每个二抗都有自己的工作浓度，说明书中会给，但还有自己摸索）6 洗涤：每孔加入250μl洗液，洗涤4次，拍干7 加入显色底物：每孔加入100μl配好的TMB贮存液，37℃放置15分钟8 加入终止液：每孔加入2M硫酸50μl9 读数：酶标仪OD450读数。
ELISA试验基本步骤及材料和试剂
ELISA试验基本步骤及材料和试剂ELISA（酶联免疫吸附测定）是一种常用于检测蛋白质或抗体的定性和定量方法。
它的基本原理是利用酶-抗体偶联物来检测特定目标物质的存在，通过酶催化底物的变化来实现信号的放大和检测。
下面将介绍ELISA试验的基本步骤以及相关的材料和试剂。
1.涂板：首先，将微孔板（96孔板或其他规格的板）用目标蛋白质或抗体溶液涂覆在表面上，使其吸附固定。
这一步通常称为“涂板”。
2.阻断：将蛋白质或抗体涂覆后的微孔板用阻断剂（例如牛血清蛋白、BSA）进行阻断处理，以防止非特异性结合。
3.样品处理：将待检测的样品加入到微孔板中，并与目标蛋白质或抗体结合（如果存在）。
样品通常需要经过一系列稀释步骤，以便在量化检测时得出准确的结果。
4.洗涤：使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的物质。
5.二抗处理：加入与待检测物种类对应的二抗荧光素，使其与待检测物结合。
这一步通常称为“二级标记”。
6.洗涤：再次使用缓冲液反复洗涤微孔板，以去除未结合的二抗。
7.底物结合：加入底物（如TMB或ABTS）并等待一定的反应时间，使酶催化底物的变化产生可观察的颜色变化。
8.反应停止：加入停止液（如硫酸、盐酸）停止底物的反应。
9.测量：利用酶催化反应产生的颜色变化通过酶标仪或光谱仪进行测量，得出待测量物的浓度或定性。
1.微孔板：一般使用96孔的微孔板，也可根据需要选择其他规格的板。
2.涂板物质：目标蛋白质或抗体等。
3.阻断剂：常用的阻断剂有牛血清蛋白（BSA）等。
4.样品：待检测的生物样品，可以是血清、细胞提取物或其他组织液。
5.二抗：与待检测物种类对应的二抗，通常是抗体。
6.底物：用于酶催化反应并产生颜色变化的化学底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基苯基二胺）、ABTS等。
7.停止液：停止底物的反应，如硫酸、盐酸等。
8. 缓冲液：用于洗涤和稀释的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBST（含Tween-20的洗涤缓冲液）等。
ELISA实验具体步骤及详细说明
ELISA实验具体步骤及详细说明预实验设置1、酶联免疫吸附分析(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)是基于抗原和抗体的免疫反应和酶的高效催化反应而建立的一种生物分析技术，可用于对待测样本中目的蛋白进行定性、定量分析。
常见的待测样本为血清、血浆。
2、对于一个完整的 ELISA kits，内包含所有试剂，其相应的实验操作直接参考说明书即可。
对于第一次接触 ELISA实验而言，预实验是一个不错的选择；而对于待测样本而言，预实验可以实现样本的初步判断，比如样本是否需要稀释等。
3、那么如何做好预实验呢？3.1 首先需按说明书制备好样本；若说明书没提及，则需查找相应的样本处理方法；3.2 所有用到的试剂要按说明书要求配制或准备，预实验一般设置2条带（16孔），操作步骤请参考说明书，酶标板具体设置如下：以CSB-E04505m Mouse Brain derived neurotrophic facor, BDNF ELISA Kit 为例，标准品OD值如下：待测样本为脑组织K1、M1（为随机编号），选择不同的稀释倍数做预实验，其相应的OD如下：通过标准品的OD及浓度值，运用Curve Expert 1.4 软件，绘制标准曲线，如下：（具体绘制过程请参考/technical_con_3275.html）将不同稀释倍数的样本OD代入公式，即可得到相应的待测样本的浓度。
（对于有稀释倍数的，需要乘以相应的稀释倍数）。
选择使待测样本浓度处于曲线陡峭处，针对CSB-E04505m检测脑组织，可考虑原液检测。
4、预实验确定样本合适的稀释倍数，下面进行正式实验，排版如下，注意做好标识，正式实验操作步骤请参考相应的说明书。
（注意：竞争法的稍有不同，需严格按照说明书操作）。
elisa操作步骤及注意事项
elisa操作步骤及注意事项以elisa操作步骤及注意事项为题，本文将为大家介绍elisa（酶联免疫吸附测定法）的操作步骤和注意事项。
一、操作步骤1. 准备工作在进行elisa实验前，需要准备好实验所需的试剂和仪器设备，包括酶标板、试剂盒、洗涤缓冲液、底物溶液、阻断缓冲液等。
同时，需要对实验室台面和仪器进行消毒，并佩戴好实验手套和口罩，以确保实验的准确性和安全性。
2. 样品处理将待测样品（如血清、尿液、细胞培养上清液等）和对照样品放置在室温下静置，使其达到室温后，进行稀释处理。
通常情况下，待测样品需要按照一定比例进行稀释，以确保其浓度处于检测范围之内。
3. 酶标板涂覆将酶标板中的亲和素或抗体溶液加入到孔板中，然后将其在4℃下静置过夜，使亲和素或抗体能够均匀地吸附在酶标板上。
4. 标准曲线制备将标准品按照一定比例稀释，以制备出一系列浓度递增的标准品溶液。
然后将这些标准品溶液依次加入已涂覆的酶标板孔中，孔位之间要保持一定的距离。
5. 样品孔加样将样品溶液加入到酶标板的样品孔中，注意每个孔的加样量要保持一致。
为了保证实验的准确性，通常会设置阳性对照孔和阴性对照孔，以验证实验的可靠性。
6. 孔板洗涤使用洗涤缓冲液对酶标板进行洗涤，去除未结合的物质和杂质。
洗涤时要注意洗涤液的温度和洗涤次数，以确保洗涤的充分彻底。
7. 酶标记物加入将酶标记的二抗或酶标记的亲和素加入到酶标板的孔中，使其与靶分子结合。
然后，将酶标板置于恒温摇床上，进行孵育反应，使酶标记物与靶分子发生特异性结合。
8. 反应终止通过加入反应终止溶液，使酶标记物的酶活性停止，并终止酶标记物与靶分子的结合。
终止溶液的选择要根据实验所使用的底物和酶标记物来确定。
9. 读板测定使用酶标仪或多功能酶标仪对酶标板进行测量，测定底物的反应产物的吸光度。
根据吸光度值，可以计算出样品中靶分子的浓度。
二、注意事项1. 严格控制实验条件在进行elisa实验时，需要严格控制实验条件，包括温度、湿度、时间等。
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E L I S A试剂配制及实验流程
ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。
以双抗体夹心法举例说明。
试剂配制：
(1) 包被缓冲液 + 碳酸盐缓冲液)：
Na
2CO
3
NaHCO
3
加蒸馏水至1000ml。
（用时稀释成1x，加%BSA）(2) 洗涤缓冲液 0.15M PBST)：
%Tween-20
加在PBS缓冲液1000ml中。
PBS缓冲液：
KH
2PO
4
0.27g
Na
2HPO
4
·12H
2
O 3.58g
NaCl 8g
KCl
加蒸馏水至1000ml。
(3) 封闭缓冲液：
牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g
（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。
(4) 稀释液：
牛血清白蛋白 %
加PBS 缓冲液100ml。
(5) 底物缓冲液：
Na
2HPO
4
(无水L，带12结晶水L) 取
柠檬酸(无水L，带1结晶水L) 取加蒸馏水至100ml。
(或Na
2HPO
4
·12H
2
O 1.84g
柠檬酸·H
2
O 0.51g
加蒸馏水至100ml)
(6) TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP-
TMB(2mg/ml水)
底物缓冲液
30% H
2O 2
总体积1ml。
TMB, 1mg/ml-DMSO溶解
(7) 或配OPD(邻苯二胺)显色液（显黄棕色）（现配避光）：
OPD（干粉） 0.004g
底物缓冲液 10ml
30% H
2O
2
总体积10ml。
(8) 终止液(2M H
2SO
4
)：
在水中，逐滴加入浓硫酸(18M，约98%)，边加边摇。
操作步骤：
1. 包被：用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。
在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。
(简称洗涤，下同)。
2. 封闭：加封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。
然后洗涤。
3. 加样：加待检样品于反应孔中，置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
(同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔)。
4. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
5. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。
37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。
6. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。
7. 终止反应：各反应孔中加入2M硫酸。
（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）
8. 结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。
测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD 底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。
间接法操作步骤：
1. 包被：用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定）， 4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。
(简称洗涤，下同)。
2. 封闭：加封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。
然后洗涤。
3. 加一抗：各反应孔中加入新稀释的抗体。
置37℃温育1~2小时。
然后洗涤。
4. 加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。
37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。
5. 加底物液显色：各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。
6. 终止反应：各反应孔中加入2M硫酸。
（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）
7. 结果判定：白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。
测OD值：在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD
底物法使用492nm检测。
通常大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性(以空白对照孔调零后计算)。
------罗凯明师兄----------
包被缓冲液（NaHCO3-Na2CO3缓冲液）量取0.2MNaHCO317mL，0.2MNa2CO38mL 溶于75mL双蒸水中
PBS称取NaCl8.0g,Na2HPO412H2O2.9g，KCl2.0g，KH2PO40.2g溶于1000mL双蒸水中
洗涤液（PBST）量取Tween-20溶于1000mLPBS中
酶标抗体稀释液量取4mL新生小牛血清CS溶于96mLPBST中
底物液称取OPD4mg溶于40mL3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，临用前配制磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液量取mL0.1M柠檬酸钠，mL0.2MNa2HPO4，加双蒸水至100mL
明胶封闭液称取1g明胶溶于100mLPBS中
小牛血清封闭液量取10mL小牛血清溶于90mLPBS中
酶反应终止液（2MH2SO4）量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中
ELISA步骤：----------根哥给的方法----------- 1）实验材料
目的抗原
BSA或其他对照抗原(15uμg/ml)
PBS
96孔ELISA板；
96孔ELISA封板膜；
移液枪
封闭液：5%脱脂牛奶(w/v)-PBS
抗血清
% (v/v) Tween20-PBS
HRP-兔抗鼠多克隆抗体
TMB(A，TMB：称取固体TMB 溶于DMSO 配成1mg/ml液体，避光保存，最好4度用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将其融化；B，底物缓冲液为0.1M 醋酸钠-醋酸缓冲液，；使用时用底物缓冲液稀释A液至100μg/ml；50ml缓冲液加入10μl 30% H2O2)。
稀硫酸(1M)
酶标仪
2）实验步骤
(1). 用PBS缓冲液将抗原(目的抗原、BSA或其他对照抗原)稀释至μg/ml。
(2). 每孔加入100μl抗原稀释液，4℃包被过夜。
(3).以用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。
每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。
(4). 弃封闭液，以% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。
每孔加入100μl已稀释好的抗血清，37℃孵育2h。
(5). 以% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS 洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。
6. 弃洗涤液，每孔加入100μl按说明书比例稀释的HRP-兔抗鼠多克隆抗体，37℃孵育h。
7. 以% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS 洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。
8. 弃洗涤液，每孔加入100μl底物液，室温孵育10min（视情况而定）。
孔内的液体将显示为蓝色。
9. 每孔加入50μl稀硫酸(1M)终止反应。
10. 测定OD450和OD650，并以OD450的值减去OD650的值，作为最后的检测结果。
ELISA。