DNA合成原理及操作经典.ppt
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DNA合成原理及操作
3. 氨解脱保护 合成完毕后取出载体进行切割并且脱保护。
一般40bp以内至少需要2小时，链越长需要 时间越长。
4. 纯化: 目前惯用的纯化方式主要有4种： OPC纯
化、 PAGE 纯化、脱盐纯化、 HPLC纯化
4.1 OPC纯化
利用OPC柱芯对DMT寡核苷酸特殊的亲和 力，将不带DMT的短片段用低浓度的有机溶剂洗 脱，吸附在柱芯里的DNA用酸除去DMT后用1ml 的20%乙腈洗脱。
缺点：不能批次生产，比较费时，有时样品接 收不好也不能有效分离。
5. 样品定量分装 样品纯化后洗脱在1ml的20%乙腈溶液
里，260紫外波长下测值，根据客户要求分 装，一般所有合成公司基本都会按1.2-1.5 倍放大给量。分装的样品干燥，经PAGE抽 样检测合格后交给市场。
合成时效：批次引物（按24条计算）在24小时之内可 以出货
DNA合成作业流程
1. 接收订单安排合成
合成部根据合成实际情况合理安排订单， 依次安排加急-测序-内部-外部，同一客户尽 量同批次安排合成，部分长链、G含量高、 合成量大的引物比较难合成，时间上可能会 有所延缓
2. 上机合成
不同型号的合成仪合成通量和合成时间均 不同，公司预定的仪器批次合成96条引物， 20bp长度合成需要2-3小时。
④氧自由基伤害 细胞代谢副产物O2-、H2O2等会造成碱基损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿 嘧啶等碱基修饰物，引起碱基配对错误。
三、 碱基插入或缺失 吖啶类分子带正电呈扁平状，易于嵌入DNA碱 基平面间，导致在复制或重组过程中缺失或插 入一个碱基。 DNA聚合酶在复个碱基的缺 失或插入。聚合酶在模板链上滑动易于造成缺 失，在生长链上滑动易于造成插入。 插入或缺失会导致读码框改变。
DNA复制、转录、翻译ppt课件
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4、解链、解旋酶类
DNA解链酶
解开DNA双链 每个bp消耗2个ATP
与单链DNA结合,维持单
单DNA结合蛋 白(SSB）
链状态 (“镇纸”)
使其不受核酸酶水解，保 持完整性。
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4、DNA拓扑异构酶
改变DNA分子构象，理顺DNA链，使复制能顺利进行。
拓扑异构酶Ⅰ 转轴酶
切断DNA双螺旋中的一 股，张力下降后封闭。
拓扑异构酶Ⅱ 旋转酶
切断DNA双链，使另一 双链经过此缺口，再封闭。
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5、引发体
RNA引物的合成和复制的起始必需。
蛋白质 DnaA蛋白
结合到DNA双链复制起始部位
DnaB蛋白 引物酶
解链酶的作用 合成RNA引物
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端粒酶：催化端粒复制的一种RNA-蛋白质复合物，
携带RNA模板（与端粒互补）的逆转录酶。
功能：1）起模板作用； 2）有逆转录酶的作用。
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端粒复制:
1）借RNA与末端DNA 互补；
2）以酶上RNA为模板 合成一段DNA；
3）延长的DNA反折为 双链。
是不依赖模板DNA 的复制来补偿切除引 物引起的末端缩短。
耐受
snRNA 极敏感 中度敏感
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（二）真核生物的RNA聚合酶
3种： Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
类型 部位
转录 产 物
对鹅膏蕈碱的敏感度
Ⅰ
核仁 5.8S\18S\28S rRNA
不敏感
Ⅱ
核质Leabharlann mRNA, snRNA, hnRNA
DNA合成原理
dT-phosphoramidite
O
OCH3 O N H3CO O O O P N N
OCH3 N
NH O N H
HN
H 3C O
O
O O O P
N
O
N
O
N
CN
CN
dG-phosphoramidite
dC-phosphoramidite
1. 脱DMT （Detritylation）
DM T O Base 1
多聚酶链式反应
寡核苷酸的化学合成原理
目前，oligo DNA的合成一般都采用固相亚磷酰胺三酯法，亚 磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上，经过四步循环反应：脱 保护、耦连、加帽、氧化，逐一将一个一个核苷酸单体连接上去， 最终完成DNA链的合成。此法具有高效、快速偶联、起始反应物比 较稳定的优点。
U 尿嘧啶 Uracil
H N H N N o g i l o O C 胞嘧啶
O N H N N N o l i g o H N H G 鸟嘌呤
O H N H N
N H N N N N o l i g o o g i l o O
T 胸腺嘧啶
A 腺嘌呤
寡聚核酸的用途
PCR扩增 DNA测序 亚克隆，点突变 基因建构（全基因合成） 反义核酸
各纯化方法的比较
纯化方法
C18柱脱盐
优 点 和 缺 点
省时省力，但只能去除盐分，不能去除比目的片段短的小片段。
OPC PAGE HPLC
省时省力，纯化效果略好于C18柱，但对于小片段的去除效果 不太好，并且吸附量低，对于长于25bp的片段纯化效果不好。
纯化效果较好，能去除小片段，与C18柱联用效果更好，缺点 是费时费力，样品损失大。 自动化程度高、省人力，可以去除小片段，纯化效果较好，缺 点是设备昂贵，纯化量小，通常不能纯化40bp以上的片段。
第十三章-DNA的生物合成-复制PPT课件
• 引物酶需组装成引发体才能催化RNA引物的合成。
• 在 E. coli 中 ， 含 有 DnaB 蛋 白 、 DnaC 蛋 白 、 引 物 酶 （DnaG蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构被称为 引发体（primosome） 。
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• 许多与DNA复制直接相关的基因被称为dna基 因；不过也有其他不同的名称。
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动画：DNA replication 5
DNA半保留复制的实验证明
• 1958 年 Meselson 和 Stahl 用同位素示踪和密度梯度离 心的方法证明了DNA的半保 留复制。
• 该实验首先将大肠杆菌在含 15N的培养基中培养约15代， 使其DNA中的碱基氮均转变 为15N。然后将大肠杆菌移至 只含14N的培养基中同步培养 一代、二代。分别提取DNA， 作密度梯度离心，将具有不 同密度的DNA分离开。
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4. 单链DNA结合蛋白
• 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB），是一些能够与单链DNA结合的 蛋白质因子。
• 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳 定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；
• 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。
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1. 模板（template）
DNA复制是模板依赖性 的，必须要以亲代DNA 链作为模板。亲代DNA 的两股链解开后，可分 别作为模板进行复制。
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2. 底物（substrate）
• 以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、 dGTP、dCTP、dTTP。
• dNMP和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱 氧核苷三磷酸。
• 在 E. coli 中 ， 含 有 DnaB 蛋 白 、 DnaC 蛋 白 、 引 物 酶 （DnaG蛋白）和DNA复制起始区域的复合结构被称为 引发体（primosome） 。
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• 许多与DNA复制直接相关的基因被称为dna基 因；不过也有其他不同的名称。
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动画：DNA replication 5
DNA半保留复制的实验证明
• 1958 年 Meselson 和 Stahl 用同位素示踪和密度梯度离 心的方法证明了DNA的半保 留复制。
• 该实验首先将大肠杆菌在含 15N的培养基中培养约15代， 使其DNA中的碱基氮均转变 为15N。然后将大肠杆菌移至 只含14N的培养基中同步培养 一代、二代。分别提取DNA， 作密度梯度离心，将具有不 同密度的DNA分离开。
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4. 单链DNA结合蛋白
• 单链DNA结合蛋白（single strand binding protein, SSB），是一些能够与单链DNA结合的 蛋白质因子。
• 使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳 定单链DNA，便于其作为模板复制子代DNA；
• 保护单链DNA，避免核酸酶的降解。
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1. 模板（template）
DNA复制是模板依赖性 的，必须要以亲代DNA 链作为模板。亲代DNA 的两股链解开后，可分 别作为模板进行复制。
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2. 底物（substrate）
• 以四种脱氧核苷三磷酸为底物，即dATP、 dGTP、dCTP、dTTP。
• dNMP和dNTP代表任意一个脱氧核苷酸和脱 氧核苷三磷酸。