一文读懂免疫组化步骤、结果分析及注意事项
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析在免疫组化实验中，结果分析是一个关键的步骤，它能够帮助研究者准确评估目标分子的表达情况。
通过对免疫组织染色结果的观察和分析，我们可以了解到免疫反应的程度和位置，从而为研究提供有力的依据和指导。
本文将围绕免疫组化实验结果的分析展开讨论。
1. 实验结果描述在开始分析之前，首先要对实验结果进行描述。
描述应当包括样本编号、实验日期、染色报告等基本信息，并对结果进行文字描述，如颜色的强度、分布情况、阳性细胞数量等。
此外，还可以结合图像或照片进行结果展示，以便更直观地表达实验结果。
2. 染色结果的分析根据染色结果的颜色强度和阳性细胞的分布情况，可以分析免疫反应的程度和位置。
通常，颜色较深且阳性细胞较多的区域表示目标分子的高表达区域，而颜色较浅或无阳性细胞的区域则表示其低表达或无表达区域。
通过对颜色和阳性细胞数量的定量分析，可以量化目标分子的表达水平，并与其他样本进行比较和分类。
3. 阳性细胞计数和分布情况在免疫组化实验中，阳性细胞的计数和分布情况是结果分析的重要指标之一。
通过对染色结果图像的定量分析，可以计算出阳性细胞的数量，并使用统计学方法对不同样本之间的差异进行比较和验证。
此外，还可以通过细胞计数的分析，了解阳性细胞在组织中的分布情况，从而为目标分子的功能和作用机制提供线索。
4. 结果的统计学分析除了定性和定量分析，还可以使用统计学的方法对结果进行进一步的分析。
例如，可以计算平均值、标准差和标准误等统计指标，并进行方差分析和t检验等统计检验，以评估不同样本之间的显著性差异。
此外，还可以使用聚类分析、主成分分析等多元分析方法，对大规模的实验结果进行系统整理和分类。
5. 结果的生物学意义和临床应用最后，要将实验结果的分析归纳到生物学意义和临床应用上。
通过对目标分子的表达情况进行分析，可以了解其在生理和病理过程中的功能和作用机制，进而为相关疾病的预防、诊断和治疗提供新的线索和靶点。
此外，还可以将实验结果的分析与其他实验数据进行综合，构建更完整和准确的分子机制模型。
免疫组化的注意事项操作要点和技巧
免疫组化的注意事项、操作要点和技巧一些教训：1、对于多甲灌注固定的标本，如要长期保存，要先脱水后冻存，此法对于采用漂片法IHC 较适合。
正确操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——蔗糖梯度脱水——负70度保存——冰冻切片错误操作：多甲灌注固定——多甲或甲醛后固定——负70度保存——蔗糖梯度脱水——冰冻切片，结果是会有大量冰晶形成。
2、如果能确认使用石蜡切片并使用贴片法进行下一步IHC，多甲或甲醛后固定后应尽快脱水并石蜡包埋。
要点和操作技巧：1.固定：最好用4%的多聚甲醛固定液。
对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。
有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。
Bouin S固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。
PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。
适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
2．组织脱水，透明：时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。
3．切片时展片：有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。
4．烤片：60℃ 30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。
5．蜡块及切片的保存：最好在4℃保存6．脱片问题：Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。
如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。
在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。
7．灭活内源性酶：HRP系统：3%双氧水灭活；AP系统：3%HAc灭活。
免疫组化结果分析
免疫组化结果分析篇1:免疫组化（IHC）经验超全总结做过病理实验的人都知道，实验看似容易，但真想把它做好，还是需要花上很长一段时间去积累和摸索经验。
我从事病理实验已有6年多了，在这段时间里，我做过许许多多病理相关实验，刚开始啥也不懂，一味按照网上操作流程来做，但做的结果往往并不是十分理想，最终结果未能达到预期的效果。
经过一段时间的浏览和学习，在论坛内学习、请教，并结合实践操作，我经历了初级——查找资料和摸索方法；中级——问题求助和不断总结；高级——难题解答和经验分享这三个阶段，也学到了不少知识，积累了很多宝贵经验，与大家一起分享。
一、石蜡切片和冰冻切片的比较？要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，这是我向一老师请教得出的结论。
因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冰冻切片。
冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。
缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冰冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。
石蜡切片的优点是可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80oC的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的切片，为了防止RNA降解，保存一贯很重要。
由于石蜡切片可以切到4μm左右，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冰冻切片好。
二、一抗的选择要点和技巧是什么？单克隆和多克隆抗体的选择。
由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。
单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就像导弹精确地命中目标一样。
另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤引言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。
它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。
本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。
步骤一：样本制备1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。
2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。
步骤二：切片制备1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。
2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调装置。
3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片间的附着力。
步骤三：固定和脱水1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。
2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。
3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇。
步骤四：抗原修复1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。
这可以通过热、酸或酶消化等方法进行。
2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。
步骤五：阻断和孵育1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非特异性结合。
2.孵育时间通常为30分钟至1小时。
步骤六：一抗孵育1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。
2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。
步骤七：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的一抗去除。
2.洗涤时间和次数根据实验要求和抗体特性进行优化。
步骤八：二抗孵育1.加入荧光标记的二抗，与一抗结合形成复合物。
2.二抗可以识别一抗的种类，常见的二抗有荧光标记的抗鼠IgG、抗兔IgG等。
步骤九：洗涤1.使用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将未结合的二抗去除。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
免疫组化检测注意事项
免疫组化检测注意事项嘿，咱今儿就来说说免疫组化检测那些事儿！这免疫组化检测啊，就像是一场对细胞的大探秘，可不能小瞧了它。
你想想，细胞那么小，要搞清楚它们的情况可不容易。
就好像在一个满是人的大广场上，要找出特定的几个人一样。
免疫组化检测就是我们的法宝啦！但要做好这个检测，可得注意好多细节呢。
首先说样本，那可是检测的基础啊！样本要是没采集好，就好比盖房子没打好地基，后面可就麻烦啦。
采集样本的时候可得小心再小心，别把不该采的采进去了，也别把该采的给弄丢了。
就跟做饭似的，食材不好，怎么能做出美味佳肴呢？然后就是实验过程啦，这可得像走钢丝一样，小心翼翼。
各种试剂就像是不同的调味料，加多加少都不行，得恰到好处。
温度、时间这些也都得把握好，不然结果能准吗？这就跟烤蛋糕一样，火候不对，蛋糕不就烤砸啦？还有啊，操作的时候一定要仔细认真，不能有一丝马虎。
一个小失误可能就会让结果大不一样，那可就误大事了。
这就像绣花，一针一线都得精心，不然绣出来的花能好看吗？检测人员也得专业呀，他们就像是经验丰富的侦探，能从那些小小的线索中找出真相。
要是个新手，那能行吗？那不等于让个小孩子去破案嘛！而且做完检测后，分析结果也很重要。
不能看到个结果就随便下结论，得综合考虑各种因素。
这就像解一道难题，得一步一步分析，不能着急。
咱可得重视免疫组化检测呀，这可是关系到健康的大事呢！只有把每个环节都做好，才能得到准确可靠的结果，才能更好地帮助医生诊断和治疗疾病。
不然，那不是白忙活一场嘛！大家说是不是这个理儿呀？所以啊，大家一定要牢记这些注意事项，让免疫组化检测发挥出它最大的作用！原创不易，请尊重原创，谢谢!。
免疫组织化学染色的实验步骤及注意事项
十五、免疫组化流程
1、65℃烤片1-2h
2、从65℃烤箱中拿出切片立即放入二甲苯Ⅰ中脱蜡15min，二甲苯Ⅱ15min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，95%乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min。
3、自来水冲洗5min。
4、蒸馏水冲洗3遍。
5、高压修复（先将修复液煮沸后，将片子放入煮沸溶液中，将压力锅盖盖好，当气阀冒气时，开始计时2分40秒，此时将温度调至140℃）。
6、将电磁炉电源关闭，用自来水冲洗压力锅锅盖，至气阀自然落下，将锅盖打开，自然降至室温（约40min左右）。
7、PBS浸泡5min*3次。
8、3%的H2O2封闭30min。
9、蒸馏水冲泡2次。
10、PBS浸泡5min*3次。
11、加Ⅰ抗8张片子，每片80μl8*80=640μl
配700μl700μl（释液）+7μl（Ⅰ抗）
12、室温放置30min，放4℃过夜。
13、第二天拿至室温平衡30min（提前准备PBS）
14、PBS洗5min*3次
15、加Ⅱ抗 50-100μl张37℃ 30min，或室温1小时
16、PBS洗5min*3次
17、DAB显色（2min）。
18、流水中止，流水冲洗5min。
19、苏木素复染（2min），流水中止，流水冲洗5min。
20、梯度酒精脱水各5min（从无水乙醇拿出风干片子，再放入二甲苯中）。
21、二甲苯透明各15min。
22、用中性树胶封片。
盐酸酒精500ml无水乙醇+250ml蒸馏水+6ml盐酸
氨水600ml蒸馏水+2m氨水
氨水作用：返蓝。
免疫组化操作程序
免疫组化操作程序免疫组化操作程序是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达及定位的方法。
它是一种广泛应用于生物医学研究和诊断中的技术，可以帮助我们了解细胞和组织中的分子机制并在疾病诊断中起到重要的作用。
本文将详细介绍免疫组化操作程序的步骤和注意事项。
一、实验前准备：1.样本准备：收集并固定适当的组织样本，使用适当的方法固定样本，如福尔马林或酒精。
2.抗体选择：根据所需研究的蛋白质，选择合适的一抗和二抗。
同时，选择用于检测的标记物，如酶、荧光物质等。
3.条件优化：根据本实验的具体情况，优化实验条件，包括温度、时间和浓度等。
二、免疫组织染色步骤：1.切片制备：将固定的组织样本切片，厚度约为4-6微米。
2.抗原修复：根据实验需求，选择适当的方法进行抗原修复，如高温加热、酶解或酸解等。
3.阻断非特异性结合：将组织切片加入阻断液，如10%牛血清蛋白（BSA）或5%牛血清中所含的非离子阻断剂。
封闭其非特异性结合位点。
4.一抗孵育：将选择的一抗溶液滴于组织切片上，孵育在适当的温度和时间下，让一抗与目标蛋白结合。
5.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的一抗。
6.二抗孵育：将选择的针对一抗的二抗溶液滴于切片上，孵育在适当的温度和时间下，让二抗结合到一抗上。
7.洗涤：用缓冲液清洗切片，去除未结合的二抗。
8.标记物检测：根据选择的标记物，使用适当的方法检测其在切片上的存在，如化学染色、荧光显微镜等。
9.涂覆封片：将固定和染色好的切片放置在玻璃片上，并用适当的封片溶液覆盖切片。
三、实验注意事项：1.样本处理：合适的样本处理和固定方法对实验结果至关重要。
选择适当的固定剂并注意固定时间。
2.抗原修复：不同的抗原修复方法适用于不同的蛋白质，需要根据实验要求选择适当的方法。
3.阻断非特异性结合：添加适当的非特异性结合阻断剂能够减少非特异性结合。
4.孵育温度和时间：根据抗体和样本的特性选择适当的孵育温度和时间，以提高特异性和灵敏度。
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一文读懂 免疫组化步骤、结果分析及注意事项...
导语实验室花花师姐正在教导新来的师弟：“想拿高分
文章，不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话：
“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉
献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的
教诲......
免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一
项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定
组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。免疫组化
主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡
切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组
织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，
但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方
法。 免疫组化步骤详解 免疫组化结果分析很多时候，我们
千辛万苦地染出了一张张漂亮的免疫组化片子。但是却不知
道如何正确地分析，得出理想的结果。这实在是一件憾事。
如下图，正常的结果应该是这样的：镜下细胞核呈蓝色，阳
性结果呈深浅不一的棕色。结果分析主要有两种方法，阳性
着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10个
视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色
程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）
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和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分
76-100%）评分，最终分数相加。
免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝
技。
1.对照染色
和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立
对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照
一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身
对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照
就足够了。
2.定位
抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK
应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等
等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结
果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？
这就要用到上一段提到的对照染色了。
3.半定位
现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没
有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。
因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的
半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。
以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光
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和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）
=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）%
x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值1.5者为(+++)。4.
图像分析仪
如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像分析
仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐
的是一款图像分析软件：Image J。毛博当年在米国做博士猴
的时候，就是用的这款软件。这是NIH开发的免费软件。一
般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到
了1.50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所
示。现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像
分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。
那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？首先，要把彩
色的图像转换成黑白图像。步骤如下：Image→Type→16-bit。
转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。步骤
如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有
的细胞被标示出来。有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计
数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。步骤
如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，
这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地
被计数成了2个细胞。然后，就可以正式开始分析了。步骤
如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，
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还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞，那么Size
项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。
一般就取默认值。最后的结果如下图所示。软件自动测量了
每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞
的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，
平均大小为295.64。免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，
还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片
子，最后都希望得出自己想要的结果。以上，毛博介绍了一
些自己的心得体会。希望广大的实验狗们都能做出自己想要
的结果，早点发文章。 非特异性染色的八大原因然而，结
果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的
一张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异性染色。1. 抗
体问题，真的是一分钱一分货啊！
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，
高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。
单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特异性
染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯
具，所以要注意抗体的有效期。
2. 抗体浓度过高/孵育时间过长一抗浓度太高也是出现非特
异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新
抗体前应该多做预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简
单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。
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解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器，提
醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。
3. DAB染色时间太长/变质DAB的孵育时间过长，会造成背
景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的，主要靠
自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马
上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕
色的时间过长，表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥
的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗的有
些晚了；图2就是刚刚好，染色效果棒棒哒!4. 内源性酶和生
物素内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一些
内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。
处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪
唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即
能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用
50 mmol/L的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用
0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸
于25 μg/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即
可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。
5. 组织变干
一下子染太多片子的时候，容易出现这种情况。解决的办法
就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆
盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画
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一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该
距离组织边缘3-4 mm。6. 浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。这都
是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。毛博的独
门秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里，过夜
完全没有问题。
7. 清洗不充分
清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配，用之前再次测
PH值。缓冲液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl
即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。
8. 封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫
血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。用PBS
稀释为3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分钟。这里不用
洗，直接甩掉即可。毛博再贡献一个独门绝招，直接用奶粉
也可以。用5%的脱脂奶粉就可以了。而且效果还不错。怎
么样？简单吧。
师傅领进门，造化看个人了。