酶工程

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酶工程的应用

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酶的固定化技术
研究新型的酶固定化技术，提高酶的稳定性和可重复使用性，降低生产成本。
酶工程与其他生物技术的结合应用
酶工程与代谢工程
将酶工程与代谢工程技术相结合，优化微生物细胞工厂的生产过程，提高目标产物的产量和效率。
酶工程与合成生物学
利用合成生物学技术构建人工酶系统，实现新酶类的设计和合成，拓展酶的应用领域。
04 酶工程的未来展望
新酶的发现与开发
发现新酶
通过基因组学和蛋白质组学技术，发现新的酶类，探索其在不同生物体内的功能和应用潜力。
酶的定向进化
利用进化工程和基因工程技术，对已知酶进行定向进化，提高其催化效率和特异性，以满足工业生产的需求。
酶的生产与应用技术的改进
高效表达系统
开发高效表达酶的微生物或细胞培养系统，提高酶的生产效率和产量。
基因治疗
酶工程在基因治疗中发挥关键作用，如用于基因编辑的酶。
农业领域
生物农药
利用酶工程生产具有生物活性的酶，可以开发出新型生物农药，减少化学农药的使用。
转基因作物
通过酶工程手段改良作物的遗传性状，提高作物的抗逆性、产量和品质。
有机肥料
利用酶工程促进有机物料的分解，提高肥料的利用率和土壤的可持续性。
酶工程的发展历程
酶的发现与分离提取
酶的固定化技术
自1833年以来，人们开始从动植物组织中分离提取酶，开启了酶工程的历史。
1960年代，人们开始研究酶的固定化技术，使酶能够重复使用，大大提高了酶的工业化应用价值。
酶的分子改造
酶工程的应用拓展
随着基因工程的不断发展，人们开始对酶进行分子改造，以改变酶的催化性质和适应特定反应条件。

酶工程

名词解释1. 酶工程:又叫酶技术,是酶制剂的大规模生产和应用的技术。

2.自杀性底物:底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露,再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂,这种底物叫自杀性底物??3.别构酶;调节物与酶分子的调节中心结合后,引起酶分子的构象发生变化,从而改变催化中心对底物的亲和力,这种影响被称为别构效应,具有别构效应的酶叫别构酶4.诱导酶:有些酶在通常的情况下不合成或很少合成,当加入诱导物后就会大量合成,这样的酶叫诱导酶5.Mol 催化活性:表示在单位时间内,酶分子中每个活性中心转换的分子数目6. 离子交换层析9比活力11葡萄糖效应13产酶动力学15双向凝胶电泳20固定化细胞21酶化学修饰1．酶的转换数：酶的转换数Kp。

又称为摩尔催化活性，是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。

2．酶的催化周期：酶进行一次催化所用的时间。

3．固定化酶的比活力：指每克干固定化酶所具有的6活力单位数，它是酶制剂纯度的一个指标。

4．抗体酶：又称催化行抗体。

是一类具有生物催化功能的抗体分子。

抗体是由抗原诱导产生的抗原特异结构免疫球蛋白，要使机体具有生物催化功能，只要在抗体的可变区赋予酶的催化特性，以及酶的高效催化能力。

是通过人工设计采用现代生物技术而获得的一类新的生物催化剂，有些是自然界原本不存在的。

5．端粒酶：是一种核酸核蛋白，包含蛋白质和RNA两种基本成分。

其RNA组分包含有构建端粒的重复序列的核苷酸摸板序列，在合成端粒的过程中，端粒酶以其本身的RNA组分为摸板把端粒的重复序列加到染色体DNA的末端上，使端粒延长。

6．核酶：核酸类酶。

为一类具有生物催化功能的核糖核酸分子。

它可以催化本身RNA剪切或剪接作用，还可以催化其他RNA，DNA多糖，酯类等分子进行反应。

7．KS分段盐析：指在一定温度和PH值条件下，通过改变离子强度使不同的酶和蛋白质分离的方法。

8．B分段盐析：指在盐和离子强度条件下，通过改变温度和PH使不同的酶或蛋白质分离的方法。

酶工程

名解：酶工程：又叫酶技术，是酶制剂的大规模生产和应用的技术。

也是酶的生产、改性与应用的技术过程。

自杀性底物：底物经过酶的催化后其潜在的反应基团暴露，再作用于酶而成为酶的不可逆抑制剂，这种底物叫自杀性底物。

别构酶：调节物与酶分子的调节中心结合后，引起酶分子的构象发生变化，从而改变催化中心对底物的亲和力，这种影响被称为别构效应，具有别构效应的酶叫别构酶诱导酶：有些酶在通常的情况下不合成或很少合成，当加入诱导物后就会大量合成，这样的酶叫诱导酶修饰酶：在体外用一定的化学方法将酶和一些试剂进行共价连接后而形成的酶模拟酶：利用有机化学合成的方法合成的比酶结构简单的具有催化作用的非蛋白质分子叫模拟酶。

抗体酶：是一种具有催化作用的免疫球蛋白，属于化学人工酶Mol催化活性：表示在单位时间内，酶分子中每个活性中心转换的分子数目离子交换层析：利用离子交换剂作为载体这些载体在一定条件下带有一定的电荷，当带相反电荷的分子通过时，由于静电引力就会被载体吸附，这种分离方法叫离子交换层析。

固定化酶：通过物理的或化学的方法，将酶束缚于水不溶的载体上，或将酶束缚于一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶发挥催化作用的酶酶反应器：是利用生物化学原理使酶完成催化作用的装置，他为酶促反应提供合适的场所和最佳的反应条件，使底物最大限度的转化为物。

底物抑制：在酶促反应中，高底物浓度使反应速度降低的现象。

稳定pH：酶在一定的pH范围之内是稳定的，超过这个限度易变性失活，这样的pH范围为此酶的稳定pH产酶动力学：主要研究细胞产酶速率及各种因素对产酶速率的影响，包括宏观产酶动力学和微观产酶动力学。

凝胶过滤：又叫分子排阻层析，分子筛层析，在层析柱中填充分子筛，加入待纯化样品再用适当缓冲液淋洗，样品中的分子经过一定距离的层析柱后，按分子大小先后顺序流出的，彼此分开的层析方法。

非水酶学：通常酶发挥催化作用都是在水相中进行的，研究酶在有机相中的催化机理的学科即为非水酶学液体发酵法：以液体培养基为原料进行微生物的繁殖和产酶的方法，根据通风方法不同又分为液体表层发酵法和液体深层发酵法。

酶工程

第一章绪论酶工程：酶的生产、改性和应用的技术过程。

酶的生产(enzyme production):通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶、动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。

酶的改性(enzyme improving ):通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化和酶定向进化等。

酶的应用(enzyme application):通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程，主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。

酶工程的主要内容包括微生物细胞发酵产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞和原生质体固定化，酶的非水相催化，酶反应器和酶的应用等。

酶工程的主要任务是经过预先设计，通过人工操作，获得人们所需的酶；并通过各种方法使酶充分发挥其催化功能。

酶是一类具有催化功能的生物大分子，亦称生物催化剂。

酶的分类：1、氧化还原酶（oxidoreductase）2、转移酶（transferase）3、水解酶（hydrolase）4、裂解酶（或裂合酶lyase）5、异构酶（isomerase）6、合成酶（synthease）或连接酶（ligase）酶的催化特性：高效性、高度专一性、反应条件温和且活力可调节影响酶催化反应速率的因素：底物浓度的影响，酶浓度的影响，pH、温度的影响，抑制剂的影响，激活剂的影响米氏方程式：[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度V max：最大反应速度(maximum velocity)Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)米氏常数Km的意义：☐重要特征物理常数，与酶浓度无关。

不同的酶具有不同K m值☐物理意义：Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。

☐Km值只是在固定的底物，一定的温度和pH条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。

☐K m值近似等于[ES]的解离常数，可表示酶与底物之间的亲和力：K m值大表示亲和程度小，酶的催化活性低; K m值小表示亲和程度大,酶的催化活性高☐从k m可判断酶的专一性和天然底物。

酶工程

用于加工和生产一些产品
用于化验诊断和水质临界测试
用于生物工程其他分支领域
酶制剂的生产
酶制剂的利用
生物工程各分支领域之间的关系
上游处理技术：基因工程和细胞工程下游处理技术：发酵工程和酶工程
酶制剂的生产过程
动植物组织细胞酶的提取分离、纯化
微生物发酵产物
直接利用酶制剂
固定化酶
谢谢
酶制剂的应用
1、酶制剂可用于治疗疾病。例如：从曲霉中提取的淀粉酶可用于治疗消化不良；溶菌酶可用于抗菌、消炎；尿激酶可用于治疗血栓病。
2、酶制剂可用于食品加工。
例如：果胶酶可用于澄清果酒和果汁；用木瓜蛋白酶制成的嫩肉粉，可以使肉丝、肉片等烹调后吃起来嫩滑可口。
酶制剂的应用
3、酶制剂用于生产一些药品。例如：青霉素酰化酶可用于生产氨苄青霉素 4、酶制剂可用于化验诊断举例：尿糖试纸检验糖尿病
酶工程拓展
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酶的概念酶工程
酶抑制剂
一、酶的概念
酶的概念
酶(Enzyme)是活细胞产生的一类具有生物催化作用的有机物。
二、酶工程
酶工程
概念：是指将酶所具有的生物催化功能，借助工程学的手段，应用于生产、生活、医疗诊断和环境保护等方面的一门科学技术。包括：酶制剂的生产酶制剂的应用
三、酶抑制剂
酶制剂的生产
包括：酶的生产提取分离纯化
液体
固体
制成酶制剂
酶制剂的生产
包括：酶的生产提取分离纯化
液体
固体
制成酶制剂
酶制剂：分离纯化的酶加入适量的稳定剂、填充剂。稳定剂：为了保证在提取过程中不使酶被破坏而加入的具有保持酶活性的物质。填充剂：那些能够改变酶的原有状态，若使浓度增加，但不改变酶的性质所添加的一些物质。

酶工程

酶工程：又称酶工艺，是围绕酶所特有的催化性能使其在工业、农业医疗保健事业及其其它各方面发挥作用的应用技术，主要为酶制剂的生产和应用。

酶工程的主要内容：1酶的发酵和产2酶的分离纯化3酶和细胞的固定化4酶的分子修饰5酶的发应动力学和反应器6酶电板/酶传感器7酶的应用8有机介质中的酶反应9抗体酶，人工酶和模拟酶使用微生物进行酶生产时，利用微生物的优点：1微生物的种类多，酶种丰富，菌株易诱变2微生物生长繁殖快，易提取酶3培养基价格便宜，微生物培养不受季节，地理限制4发酵生产易自动控制5易获得工程菌，提高酶产率，开发新酶培养基营养成分：碳源，氮源，无机盐，微量元素，生长因子，产酶促进剂发酵条件对产酶的影响因素：温度，PH，通气量，搅拌，泡沫，湿度提高酶产量的方法：1选育优良的产酶细胞株系2添加诱导物3控制阻遏物浓度4添加表面活性剂5添加产酶促进剂提高植物细胞产物产量的途径：1选择高产出的细胞株2代谢途径的调节3控制细胞生长和分化程度4诱导物或加入前体5两相培养及次生产物的释放6毛状根（发根）培养技术酶发酵动力学：研究在发酵过程中细胞生长速度，产物生成以及环境因子对这些速度的影响。

酶的分离纯化:包括三个基本环节：一是抽提，即把酶从材料转入溶剂中来制成酶溶液；二是纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；三是制剂，即将酶制成各种剂型。

三个基本原则：1、注意防止酶的变性失活：（1）除少数情况外，所有操作必须在低温下进行，特别是有机溶剂存在时更要特别小心；（2）大多数酶在PH<4或PH>10的条件下不稳定,故不能过酸过碱（3）酶溶液常易形成泡沫而使酶变性,故应防止泡沫的形成（4）重金属能引起酶失活,有机溶剂能使酶变性,微生物污染,蛋白质使酶变性,都必须予以防止2、酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”手段。

此外，由于酶和它的底物，抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提供了更多条件和方法可供采用3、酶具有催化活性，检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当的方法和条件提供了直接依据。

《酶工程》课后习题答案

① 酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或者服务于其它目的地一门应用技术。

② 比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或者 RNA 所拥有的酶活力单位数。

③ 酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。

其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。

④ 酶活国际单位 : 1961 年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件 )下，每分钟内能转化1 μmol 底物或者催化1 μmol 产物形成所需要的酶量为 1 个酶活力单位，即为国际单位(IU)。

⑤ 酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。

酶的研究简史如下：(1)不清晰的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。

(2)酶学的产生： 1777 年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验； 1822 年，美国外科医生 Beaumont 研究食物在胃里的消化； 19 世纪 30 年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。

1684 年，比利时医生Helment 提出 ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素(酵素)；1833 年，法国化学家 Payen 和Person 用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶； 1878 年，德国科学家 K hne 提出 enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”(希腊文)。

(3)酶学的迅速发展(理论研究)： 1926 年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930 年，美国的生物化学家 Northrop 分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。

I.酶工程发展如下：①1894 年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908 年，德国的Rohm 用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911 年， Wallerstein 从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949 年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960 年，法国科学家 Jacob 和 Monod 提出的控制子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971 年各国科学家开始使用“酶工程”这一位词。

酶工程与生物催化

酶工程与生物催化酶工程是一门利用生物催化技术对酶进行研究、应用和开发的科学。

生物催化是利用酶作为催化剂来促进和加速化学反应的过程。

在现代生物技术的推动下，酶工程和生物催化已经成为生物制药、食品加工、环境保护等领域中重要的研究和应用方向。

一、酶工程的基本概念与原理酶是生物催化过程中起关键作用的大分子催化剂，能够在温和的条件下加速化学反应的速率，提高反应的选择性和效率。

酶工程的基本概念是指通过改变酶的结构和性质，使其在特定条件下具有更高的催化活性和稳定性。

酶工程主要包括两个方面的内容：一是通过基因工程技术改变酶的基因序列，使其具有更好的性能；二是对酶进行物理化学性质的调控，提高酶的稳定性和催化效率。

酶工程的原理是通过对酶进行定向进化和有针对性的改造，提高酶的催化活性和选择性。

定向进化是利用自然选择的原理，在实验室中对酶进行多次重复的遗传突变和筛选过程，筛选出表现出更高活性和稳定性的突变酶。

有针对性改造是通过改变酶的结构和特性，使其适应特定反应条件，提高催化效率和产物选择性。

二、酶工程在生物制药中的应用1. 酶在药物合成中的应用酶催化合成药物的方法相对传统化学合成方法更加温和、高效和环保。

通过酶工程技术可以改变酶的催化性能，使其适应特定反应条件，提高反应产物的选择性和纯度。

同时，酶工程还可以提高酶的稳定性和催化活性，延长酶的使用寿命，降低生产成本。

2. 酶在生物催化合成药物中的应用利用酶催化合成药物可以降低合成工艺的复杂性和成本，提高产物的纯度和选择性。

在生物催化合成药物中，酶通过催化底物的转化，生成所需的目标产物。

酶工程技术可以有效提高酶的催化效率和选择性，降低反应副产物的生成，从而提高合成药物的产量和质量。

三、酶工程在食品加工中的应用1. 酶在食品加工过程中的应用酶在食品加工过程中有广泛的应用，例如面包、啤酒、乳制品、果汁等的生产中都涉及到酶的应用。

酶可以促进面团发酵、提高啤酒的醇味、改善乳质口感和提高果汁的澄清度。

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第一章酶工程1、什么是酶工程？酶工程研究的主要内容有哪些？酶工程(Enzyme Engineering)又称为酶技术。

酶工程是酶制剂的大批量生产和应用的技术。

它从应用的目的出发，将酶学理论与化学工程相结合研究酶，并在一定的反应装置中利用酶的催化特性，将原料转化为产物的一门新技术。

包括下列主要内容：酶的产生；酶的制备；酶和细胞固定化；酶分子修饰；有机介质中的酶反应；酶传感器（酶电极）；酶反应器；抗体酶、人工酶和模拟酶；酶技术的应用2、酶分为哪几类？酶的组成和结构特点是什么？1．氧化还原酶(Oxidoreductase)包括脱氢酶(Dehydrogenase) 、氧化酶(Oxidase) 、过氧化物酶、细胞色素氧化酶等。

2.转移酶(Transferase⏹包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等。

3.水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶。

4.裂合酶(Lyase)这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。

如醛缩酶、脱氨酶、脱羧酶5异构酶(Isomerase)此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等6连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase)这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等含高能磷酸键的物质作为结合能源，有的还需金属离子辅因子。

分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。

7．核酶（Ribozyme⏹核酸酶是唯一的非蛋白酶。

它是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。

3、目前公认的酶的作用机制有哪些？1）锁和钥匙模型（2）诱导契合模型4、酶作为催化剂的显著特点是什么？影响酶活性的因素有哪些？四、影响酶活力的因素激活剂酶浓度底物浓度pH温度抑制剂失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。

2.抑制作用抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。

3. 去激活作去激活作用是指某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。

4. 阻遏作用阻遏作用是指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化。

竞争性抑制：V max不变，K m增大；非竞争抑制：V max变小，K m不变；反竞争抑制：V max变小，K m变小。

5、蛋白质纯化应遵循的原则有哪些？比较成功的大规模纯化酶的方法有哪些？一、分离纯化用的原料来源要方便、成本要低；目的蛋白质含量、活性相对要高；可溶性和稳定性要好。

二、生物活性分子一旦离开它赖以生存的生态环境则易破坏天然构象，易变性。

因此，破碎细胞的条件要尽可能十分温和。

三、分离纯化的大部分操作是在溶液中进行。

四、建立灵敏、特异、精确的检测手段，是评估纯化方法，判断目的蛋白质产率、活性、纯度的前提。

五、纯化策略的选择。

P20表1－7列出了蛋白质、酶在重组蛋白纯化中，依其蛋白质性质选用的各种纯化技术。

常用的有凝胶过滤、离子交换等方法。

蛋白质大规模分离纯化技术:⏹大规模层析技术：第一步必须能处理大体积溶液，并能减少样品的总体积。

用于大规模纯化蛋白质的层析方法有离子交换层析、凝胶过滤、疏水层析、亲和层析和高效液相层析。

⏹大规模电泳技术：一般说来，电泳法在分析和小规模制备上广泛应用，然而最近也出现了大规模应用的趋向。

方法有：自由流动区带电泳、膜固定pH梯度等电聚焦法。

第二章酶与细胞的固定化固定化酶:在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复利用。

1、与游离酶相比，固定化酶优点和缺点有哪些？优点:纯化简单,可以装塔连续反应，提高酶的稳定性,酶反应过程可严格控制，提高产物收率和质量,酶可多次使用，成本降低，应用范围广缺点:首次酶活力有损失,投入成本高适用于可溶性底物，大分子底物较困难，与完整菌体相比，不适于多酶反应。

2、制备固定化酶（细胞）的基本原则是什么？1.必须注意维持酶的催化活性及专一性，固定化时采取尽量温和的条件。

2.固定化的载体必须有一定的机械强度，有利于生产的自动化、连续化。

3.固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍与底物的接近，以提高产品的产量。

4.酶与载体必须结合牢固，有利于反复使用。

5.固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与产物等发生化学反应。

6.固定化酶成本要低，以利于工业使用。

4、酶固定化的方法有哪几类，试比较各类方法的特点？2、酶的固定化方法物理吸附：利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上。

⏹优点：酶活性中心不易破坏及酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。

⏹缺点：相互作用力弱，酶易脱落。

离子键结合法：优点：酶高级结构和活性中心不易被破坏，回收率较高。

缺点：酶易脱落，共价键结合法：优点：结合牢固，稳定性好，不会轻易脱落。

缺点：往往造成固定后酶活力丧失，回收率一般为30%左右，甚至底物专一性发生改变。

交联法⏹常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N,N′-乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。

应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成shiff碱。

包埋法：定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。

1．固定化对酶活性的影响（降低）原因：酶结构的变化；空间位阻；内扩散阻力；大分子底物不能通过膜（包埋）。

固定化对酶稳定性的影响（升高）2．固定化酶的最适pH变化.载体带负电荷（阴离子聚合物），固定化酶的最适pH较游离酶偏高，外部溶液的pH向碱性方向移动;载体带正电荷，外部溶液的pH向酸性方向移动。

3．最适温度变化：酶的热稳定性提高，故最适温度也提高4．底物特异性变化：有空间位阻的酶作用于低分子底物;特异性没有明显变化；无空间位阻的酶；底物特异性变化不大6．米氏常数K m的变化，K m值随载体性质变化（1）电中性载体与酶结合，由于扩散限制造成表观K m’上升；（2）载体与底物电荷相反，静电作用，固定化酶的表观K m’<K m，即使在溶液的底物浓度较低时，也可达到最大反应速度；（3）载体与底物带相同电荷，K m’>K m，降低了酶的亲和力5、辅酶固定化的意义及方法是什么？⏹载体结合法与辅基固定方法相似，主要用于制备亲和吸附剂。

包埋法中，由于辅酶相对分子质量小，先将辅酶与水溶性高分子载体结合，然后再包埋。

⏹辅酶固定化⏹ 1. 引入功能基团和间隔臂对于一些腺苷酸的辅酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。

⏹固定化细胞的定义:细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能反复或连续使用的活力6、简述固定化细胞的优缺点优点⏹无需进行酶的分离和纯化，减少酶的活力损失，同时大大降低了成本；⏹保持了酶的原始状态，比固定化酶的稳定性更高，对污染的抵抗力更强；⏹细胞本身含多酶系统，可催化一系列反应，且不需添加辅助因子；⏹细胞生长停滞时间短，细胞多，反应快等。

固定化活细胞的缺点⏹必须保持菌体的完整，需防止菌体的自溶，否则影响产物的纯度；⏹必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的分解；⏹胞内多酶的存在，会形成副产物；⏹载体、细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。

二、细胞固定化的制备方法化学法：化学试剂的毒性会破坏细胞。

但细胞间、细胞和载体之间的键不易破坏，故操作稳定性高。

吸附法：固定条件温和，方法简便，但载体和细胞间吸附力弱，细胞易脱落，故操作稳定性差，但可再生包埋法：细胞和载体间没有束缚，固定后保持高活力，但只适用小分子底物。

交联法：没有良好的机械强度，不适于实际应用。

但可得到高细胞浓度，难以再生。

一、评价固定化酶（细胞）的指标1. 固定化酶的比活力：每克干固定化酶所具有的酶活力单位。

或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。

连续测定条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需要的时间（t1/2）。

3.偶联率偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力×100%4.活力回收率，活力回收=固定化酶总活力/游离酶的总活力×100%5.相对活力，相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)×100%第三章酶的化学修饰1、什么是酶的化学修饰，其优点是什么？酶分子的化学修饰：在分子水平上对酶进行改造（引入或除去化学基团），以达到改构和改性的目的。

即在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团(物质)，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。

这种物质被称为修饰试剂。

优点:一热稳定性增加.二颗部分消除抗原.三.延长体内半衰期..四.产生新的催化能力三、酶化学修饰的基本原理1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境2、影响酶功能基反应性的因素有哪些？影响修饰反应的因素有哪些？酶蛋白功能基的反应性微区的极性：是决定基团解离状态的关键因素之一。

氢键效应：蛋白质或其离子通过氢键来维持稳定性。

静电效应：带电基团之间的相互影响造成的。

位阻效应：当烷基在空间上紧靠着蛋白的功能基，会使修饰剂不能与功能基接触，这时会出现位阻效应。

修饰剂的反应性选择吸附：修饰剂根据各自特点，选择性地吸附在低极性区域或高极性区，形成蛋白质－修饰剂复合物，加速修饰过程。

静电相互作用：带电修饰剂可以选择性地吸引在蛋白质表面带相反电荷的部位。

位阻因素：位阻因素都可能阻止修饰剂与功能基的正常反应。

催化因素：不同的修饰剂，其反应速度和反应部位有明显差异，较大程度上与酶的酸碱催化有关。

局部环境的极性：大多反应会与溶剂的极性有关，且溶剂效应相当复杂。