三、基因工程的基本条件-基因载体
D-DNA L-DNA cccDNA
沸水浴法：
用含有EDTA和Triton X-100的缓冲 液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA
5. 质粒载体必须具备的基本条件
（1） 具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因
是筛选的标志。理想的载体应该有两 种抗菌素抗性基因。 （3）若干限制性内切酶的单一位点： 用来插入外源DNA片断。且插入后不影 响复制功能。
如：F质粒（性质粒、或F因子）：
甚至能使寄主染色体上的基因随其一道 转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
大肠杆菌接合（conjunction）
非接合型质粒：
虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因， 因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。
Genetic Engineering
1.基因工程概述 2.基因工程的基础知识与基本技术 3.基因工程所需基本条件 4.基因工程的操作过程 5.目的基因的获取 6.克隆基因的表达 7.转基因生物技术
3 基因工程的基本条件 B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体载体 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体
沸水浴法 质粒DNA纯度底、快速、操作简便 碱溶法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法 和碱溶法之间
氯化铯密度梯度离心法：
用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加CsCl和溴乙锭 超速离心过夜 在紫外灯下吸取cccDNA 稀释沉淀cccDNA
proteins
ocDNA L-DNA cccDNA RNAs
i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp） 青霉素的衍生物。
a）抑菌原理 通过干扰细菌细胞壁合成的末端反 应，杀死生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml） a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀 死生长的细菌。
双链环状DNA。 （酵母的“杀伤质粒”是RNA）。
（4）质粒的空间构型：
① 共价闭合环状DNA（cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA） 一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
6. 质粒的选择标记及其工作原理： （1）选择标记
① 抗菌素抗性
绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性 标记：
氨苄青霉素抗性（Ampr）
卡那霉素抗性 （Kanr）
四环素抗性 （Tetr）
链霉素抗性 （Strr）
10
氯霉素抗性 （Cmlr）
常用抗菌素的抗性工作原理
➢ ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 ➢ pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 ➢ p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容
4. 质粒DNA的分离纯化
实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、 溴乙锭污染
碱溶法：
用含有细菌细胞壁
加NaOH和SDS的混合溶液，去T-DNA
膜释放内含物
ocDNA
加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体， 去除染 色体DNA及大部分蛋白质
离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去 除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA
用无DNase的RNase去除残余的RNA
符合基因工程的安全要求。
（1）R质粒（抗性质粒）：
带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状（resistance）。
（2）Col质粒： 带有控制大肠杆菌素（colicin）合 成的基因。
大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。
Col质粒或R质粒如果带有转移基因， 也可以成为接合型质粒。
携带其他基因，使宿主细胞呈现新的性状，如 抗性质粒R等
隐蔽质粒（concealed plasmid）
宿主内含有质粒，但无异样性状表现。但可 能有的新性状并不被人们发现。
3. 质粒的不相溶性
任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时 存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性， 不相容性的质粒组成不相容性群 以大肠杆菌的质粒为例：
外源DNA插入其中不影响载体的复制。
（4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。
二 质粒载体
大肠杆菌的质粒
1. 质粒的一般生物学特性
（1）分子小： 1—500 kb
（2）编码基因少： 2—3个中等大小的蛋白质。
如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性（非必须）。 （3）环形DNA分子：
（5）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同： scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L
SC
2. 质粒的类型
①根据质粒自身传递的性质分为： 接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
接合型质粒：
又叫自我转移型质粒。
除了带有自我复制所必需的遗传信息外 还带有一套控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
②根据质粒的复制特性分为：
严紧型质粒（stringent plasmid） 拷贝数少，只有1—3份拷贝。
（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 松弛型质粒（relaxed plasmid）
拷贝数多，有10—60份拷贝。 （非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。
③根据可否引起宿主出现新形状分为：
显性质粒（dominant plasmid）
一 载体的功能及特征
1. 载体 （Vectors）
在基因工程操作中，把能携带外源DNA进 入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分 子叫载体。
2. 基因工程对载体的要求
（1）具有对受体细胞的可转移性，并在宿主细胞 内能独立复制。
（2）有选择性标记，便于重组DNA分子的检测。 （3）有一段多克隆位点。
合集下载
基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程导论
（36 – 26）
用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的
转化子的筛选和鉴定（检）
重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
DNA的体外重组（切、接）
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程
切
接
转
增
检
B 基因工程的基本形式
1 基因工程的基本概念
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程
第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用: 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(rebination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系. 作动词时是指基因的分离与重组过程。
P
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
用于体外包装的蛋白质可直接从感染了l噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组l-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组l-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的
转化子的筛选和鉴定（检）
重组DNA分子的转化和扩增（转、增）
DNA的体外重组（切、接）
基因工程的操作过程
基因工程的操作过程
切
接
转
增
检
B 基因工程的基本形式
1 基因工程的基本概念
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程
第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用: 遗传工程(genetic engineering); 基因克隆(gene cloning); 分子克隆(molecular cloning); 基因操作(gene manipulation); 重组DNA技术(rebination DNA technique) 克隆(clone): 作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系. 作动词时是指基因的分离与重组过程。
P
PstI等产生的3‘粘性末端
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G … 3’
3‘ … C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’
PstI 37 ℃
5‘ … G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’
具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点
基因工程第五章-载体
第一个经改造的认为 较完善的质粒载体是 pBR313, 他是松弛型 载体，引入了两个标 记基因------抗四环素 基因Tecr和抗青霉素 基因Ampr, 他的外源 基因插入位点在两个 抗性基因中
质粒的序列含有必要区和非必要区。
必要区指的是与质粒DNA复制有关的基因，他们对 质粒的存活、复制极为重要。
❖ 对于天然质粒来说，他们的基因中含有控制质粒分配的功能 区，细胞分裂构成中，这个功能区保证质粒拷贝被平均分配。
❖ 人工构建的质粒这个功能区已经缺失，因此，它在细胞分 裂中是随机分配的，尽管出现无质粒的细胞的几率较低，但 在一定的条件下，比如――－细胞分裂较快或营养缺乏的情 况下，会出现无质粒的细胞。
❖ COL质粒：1952年发现的大肠杆菌含有这一因子可编码一种奇 怪的蛋白质抗菌物质――大肠菌素。
3. 质粒DNA的分子量和拷贝数：
按质粒的分子量大小，可分为量大类： 3――7kb，拷贝数多； 70－150kb，含有与质粒功能有关的更多基因，可自我传 递（可编码一套控制质粒DNA转移的基因，所以可从一 个细胞转到另一个细胞），如果一个细胞含有这种质粒， 他可以带动小质粒进行传递转移。这种质粒的拷贝数低。
3. 引入多种用途的辅助序列，构建具有特化功能的载体：
构建质粒可用于组织化学方法的鉴定：pUC18载体带有 一个Lac操纵子的DNA区段，宿主细胞具有与之互补的基 因，当质粒进入宿主后，由于互补作用，而实现β－半乳 糖苷酶的表达（诱导物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与操作 子脱离）。外源基因的插入会导致基因失活而检查重组子。
Section one
plasmids
一、质粒的生物学特性：
❖ 质粒最初发现于细菌中，是染色体外能自主复制的双 链共价闭合的环状DNA分子，是能够进行独立复制并 保持遗传恒定的复制子，大小在1――200KB。质粒 常含有一些编码对细菌生存有利的基因，比如说抗性 基因，降解复杂有机物的酶、细菌素，并且可赋予微 生物特殊的外形―――鞭毛、菌毛、芽孢等。
基因工程的载体
常用抗生素的作用方式及抗性机理
抗生素名称 氨苄青霉素 （Amp） 氯霉素 （Cm） 卡那霉素 （Kan） 链霉素 （Sm） 四环素 （Tet） 作用方式 抗性机理 一种青霉素的衍生物，通过干扰 bla抗性基因编码的一种周质酶，即β-内 细菌胞壁合成之末端反应，而杀 酰胺酶，可特异的切割amp的β-内酰胺 死生长细胞。 环，从而失去杀菌效力。 一种抑菌剂，通过同核糖体50S 亚基的结合作用，干扰细胞蛋白 质的合成，并阻止肽键的形成。 cat抗性基因编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活
λ噬菌体载体
结构特点: ①线性双链DNA分子 ②具非必需区(约1/3长度） ③两端具12个核苷酸单链互补粘性末端 ④可在E.coli中大量繁殖 ⑤可克隆15Kb左右的外源DNA
（2）质粒的基本特性
1) 2) 3) 4) 5) 自主复制性 不相容性 可扩增性 可转移性 携带遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传 标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需 的附加性状，包括：抗生素、抗抗生素、抗重金 属、产生细菌毒素等。对DNA重组分子的筛选具有 重要意义。
（3）质粒DNA的转移
质粒自主转移
导入
+
自主转移
+
无DNA转移
donor
H H
H
+
辅助转移
H
+
质粒的辅助转移
H
H
+
Notransfer
质粒的重组转移
R-重组DNA分子
重组
+
DNA 转移
R
+ R
（4）质粒的命名
人工组建的质粒 第一个字母是质粒的英文名字（Plasmid）的第一 个字符p, 用小写。后面有两个字母是大写，代表质 粒的发现者和实验室名称，再后面是质粒的编号。
基因工程实施的四个必要条件
基因工程实施的四个必要条件在现代科技的发展中，基因工程技术已经成为了生物科学领域的一个重要分支。
它不仅可以用来研究基因的功能，还可以用来治疗疾病、改善农作物品质等。
要想成功地实施基因工程，需要满足一定的条件。
本文将从四个方面来探讨这些必要条件。
一、明确的研究目标在进行基因工程实施之前，首先要明确研究的目标。
这个目标应该是具体、明确的，可以是治疗某种疾病、提高农作物产量等。
只有明确了研究目标，才能有针对性地进行基因工程的设计和实施。
二、合适的基因载体基因载体是基因工程的核心部分，它决定了基因在宿主细胞中的稳定存在和表达。
目前常用的基因载体有质粒、病毒、动植物病毒等。
选择合适的基因载体需要考虑多个因素，如载体的大小、携带基因的数量、是否具有抗生素抗性等。
只有在选择了合适的基因载体后，才能将目的基因导入到宿主细胞中，并使其正常表达。
三、详细的实验设计在进行基因工程实施时，需要进行详细的实验设计。
这包括确定实验步骤、操作流程、检测方法等。
实验设计应该尽量简单明了，避免出现不必要的错误和偏差。
还需要考虑到实验的安全性，确保实验过程中不会对人员和环境造成危害。
四、严格的质量控制在基因工程实施过程中，质量控制是非常重要的一环。
这包括对实验材料的质量控制、操作过程的质量控制以及结果的分析等方面。
只有严格按照质量控制的要求进行操作，才能保证实验结果的可靠性和准确性。
还需要对实验结果进行充分的分析和讨论，以便进一步优化和完善基因工程方案。
要想成功地实施基因工程，需要满足以上四个必要条件。
只有在这些条件的共同作用下，才能够取得良好的研究成果。
随着科技的不断进步和发展，未来可能会出现新的条件和方法，但这些基本的条件仍然是不可或缺的。
2.2 基因工程所需的基本条件
常用抗菌素的抗性工作原理
i）氨苄青霉素（ampicillin，Amp）
青霉素的衍生物。 a）抑菌原理 通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应， 杀死生长的细菌。 b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地切割氨 苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloromycetin，Cml）
a）抑菌原理
DNA连接酶类型：
（1）大肠杆菌连接酶
只能连接粘性末端
（2）T4噬菌体连接酶
不但能连接粘性末端；还能连接平末端
DNA连接的反应体系：
酶切纯化后的DNA片断 连接缓冲液 DNA连接酶
连接温度： 4~16C
（三）其他工具酶 工具酶 功 能
DNA聚合酶 DNA的合成，PCR 反转录酶 合成cDNA
2. 质粒的一般生物学特性 （1）分子小 （2）编码基因少 2—3个中等大小的蛋白质。 如抗生素抗性等，赋予细菌一些额外的特性（非 必须）。 （3）环形状 1—200 kb
双链环状DNA。
（4） 质粒的空间构型
① 共价闭合环状DNA (SC DNA)
呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， OC DNA）
指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性 核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数
（5）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并 复制和表达。
5. 质粒的选择标记
① 抗生素抗性标记 绝大多数质粒载体都是用抗生素抗性标记：
氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr） ② 遗传标记 使受体菌发生遗传性状的改变的基因。 如LacZ’基因互补显色（α -互补）
基因工程原理与技术-3
pBV221
rrnB
制备RNA探针的载体
两条链RNA 探针的制备程序
简化外源蛋白纯化的载体(标签载体) pBAD/His
常用的标签： 多聚组氨酸残基、 结合麦芽糖蛋白、 谷胱甘肽-s-转移 酶。
亲和层析法纯 化外源蛋白。
pBAD/His的三种变体(3种读码框)
BglII site of the MCS.
表达载体
(根据受体细胞)
原核细胞表达载体 真核细胞表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的转运)
分泌型表达载体 非分泌型表达载体
表达载体
(根据表达蛋白的组成)
融合型表达载体 非融合型表达载体
大肠杆菌表达载体的特征(与克隆载体相比)：①强启动
子；如Lac、Trp、Tac、PL、PR、T7启动子。②SD序列； ③强终止子。如rrnB。
大多数)、双链线形 DNA、RNA(酵母的 杀伤质粒)。
提取的质粒有三 种构型：①闭合环形 DNA(超螺旋构型)， ②开环形DNA，③线 形DNA。
2、质粒的复制类型 严紧型：严格受宿主控制，1~3拷贝
松弛型：不严格受宿主控制，10~200拷贝
质粒的复制类型与宿主有关，如R1质粒在大肠杆菌中 是严紧型，而在奇异变形杆菌是松弛型；ColE1-K30质粒与 R1质粒正好相反。
起点和选择标记、可在两种不同的宿主细胞中存活和复制 的质粒载体。
如：大肠杆菌-土壤农杆菌穿梭质粒载体(植物转化载 体)、大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体(见下图)、大肠杆菌枯草芽孢杆菌穿梭质粒载体(pHV14、pEB10)、大肠杆菌-动 物细胞穿梭质粒载体(pBPV-BV1)，但还没有大肠杆菌-植物 细胞穿梭质粒载体。
例如，将λ噬菌体在EcoRI限制-修饰的宿主和EcoRI限制-修 饰缺陷型宿主之间反复地循环生长，筛选到完全失去了 EcoRI酶切位点的λ噬菌体。然后将突变体同野生型λ噬菌体 在体内进行重组，选择得到仅在非必需区段具有1~2个 EcoRI酶切位点的重组体噬菌体。
基因工程第三章基因工程的载体
基因工程载体的种类
质粒载体
质粒是一种裸露的、独立于细菌 拟核DNA之外的DNA分子，具有 自我复制能力，可携带外源DNA 片段。
病毒载体
病毒载体是指能够将外源DNA片 段插入到病毒基因组中，并利用 病毒的复制机制将外源DNA片段 导入到受体细胞中的媒介。
基因工程载体的作用
基因转移
基因工程载体能够将外源DNA片 段导入到受体细胞中，实现基因 的转移和表达。
通过优化载体结构，提高其在宿主细胞内的稳定性，降低丢失和突变 的风险。
开发NA的载体，提高基因工 程的效率和安全性。
拓展载体功能
通过基因工程技术对载体进行改造，赋予其新的功能，如表达调控、 靶向输送等。
智能化载体
利用合成生物学和纳米技术，开发具有智能响应能力的基因工程载体， 实现基因治疗的精准化和个性化。
利用基因工程载体生产食品添加剂、 酶制剂等，提高生产效率和产品质量。
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此外，噬菌体载体还可以用于疫苗研 发和生物治疗等领域。
04 人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体是一种通过基因工程技术 构建的染色体，具有与天然染色体相 似的结构和功能。
人工染色体具有高容量、可定制和可 调控等特性，能够承载和表达大量的 外源基因，为基因治疗、生物制药等 领域提供了新的工具。
质粒载体的应用
总结词
质粒载体在基因工程中广泛应用于基因克隆、表达和基因治疗等领域。
详细描述
质粒载体此外，质粒载体还可以用于基因治疗和疫苗研制等领域， 为疾病治疗和预防提供了新的手段。
03 噬菌体载体
噬菌体的生物学特性
基因克隆
基因工程载体可作为基因克隆的 工具，将外源DNA片段插入到载 体中，通过复制和扩增实现基因 克隆。
基因工程概论(3)
5’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T… 3’
3’ … C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A… 5’
Zn2+
T-G-G-A-G-T… 3’
A-C-C-T-C-A… 5’
gap
核酸修饰酶 末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）：
TdT的基本特性：来自小牛胸腺
不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs 5’ p 3’ HO
3’ HO
TdT
5’ p 3’ HO AAAAAAAAAAA
Co2+
dATP AAAAAAAAAAAAAA OH 3’
p 5’
3 基因工程的基本条件
B 用于基因克隆的载体
载体的功能及特征
质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA
考斯质粒（cosmid）
载体的功能及特征 载体的功能：
运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件
DNA pol I
5’ ppp dN Mg2+
3’ … G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A… 5’
5’ … C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OH
DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 I 大片段（ Klenow ） ：
Klenow 酶的基本性质：
大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得C端三分之二的大 肽段，即为Klenow酶。 Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性，
5’ … G-C-T-G-A-A-T-T-OH
3’ … C-G-A-C-T-T-A-A-P
… 3’
… 5’
基因工程中载体的必备条件
基因工程中载体的必备条件基因工程这玩意儿听起来挺高大上的，其实咱们聊起来就像喝茶聊天一样轻松。
说到载体，大家可能会想，这个东西到底是干啥的。
简单来说，载体就像一个小车，专门用来装载咱们想要搬的基因。
想象一下，载体就像是个快递箱，专门帮咱们把基因送到目的地。
可是，光有个快递箱还不行，得有一些必备的条件，让它能好好地干活。
载体得有个“身份”，对吧？就像身份证一样，得让别人认得出它。
一般来说，常用的载体有质粒、病毒等。
它们都是经过优化的“快递小哥”，能在细胞里转悠自如。
可别小看这点，身份清晰的载体才能顺利进入细胞，确保咱们的基因顺利落地。
载体的大小也很重要。
这个小家伙不能太大，否则就进不去细胞；也不能太小，装不下咱要运送的基因。
就好比咱们出门旅行，背个行李箱，既不能太大拖累，也不能太小漏东西。
大小适中，才能完美地达到目的。
载体得有个好“工作能力”。
就像一位优秀的快递员，得能顺利把东西送到指定地点，甚至能在目标细胞里顺利表达。
这里面可有门道，载体里面得有合适的启动子和调控元件。
启动子就像发动机，调控元件则是开关，只有它们配合得当，咱们的基因才能按时发货。
安全性也不能忽视。
咱们都希望快递能安全送到，基因工程里也一样，载体要确保不会对宿主细胞造成伤害。
这就像咱们点外卖，选的餐厅得干净卫生，不然谁敢吃？所以，科学家们会经过一系列的测试，确保载体不带来意外的麻烦。
还有一点，载体得有“多重功能”。
这就好比一位全能选手，能应对各种挑战。
比如，载体可以在不同类型的细胞里工作，也能携带多种基因，真是灵活得很。
这样一来，咱们在进行基因工程的时候，就能更加得心应手，随心所欲地进行实验。
适应性也很重要。
载体得能适应各种环境条件，毕竟细胞里面的环境复杂得很。
就像咱们走在大街上，随时可能遇到风吹雨打，得有足够的应变能力。
载体若能在不同的条件下都能稳定工作，那真是太棒了，咱们也能更放心地进行基因操作。
所以说，基因工程中载体的必备条件可不少，得考虑身份、大小、工作能力、安全性、多重功能和适应性。