首批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准品的研制_杨化新

Simultaneous Determination of All-trans-and13-cis-Retinoic Acid in Human Serum by HPLCYu Zicheng,Yao Shuai and Yu Renhai(Ins titute of Clinical Phar mac ology,Ruijin Hospital,S hanghai Secon d Med ical Univer s ity,Sha nghai　200025)A bstract　Objective:To develop an isocratic H PLC for the simultaneous determination of all-trans-and13 -cis-retinoic acid(ATRA,13-cRA)in human serum.Methods:The serum sam ple(1m L)w as ex-tracted w ith5mL of ether for twice.The extract w as analyzed on anμBondapak C18(3.9mm×300mm)col-umn with a mobile phase consisting of85Vols.of methanol and15Vols.of NH4Ac buffer(pH6.0)at22℃. The flow rate w as0.8mL·min-1.The retinoids w ere detected at340nm and quantitated by internal standard method,DMAB w as used as an internal standard.Results:The linearity of method w as in the range of0.8to 1120μg·L-1for AT RA and0.82to1312μg·L-1for13-cRA.The limit of determinatio n w as0.6μg·L-1 in serum for both ATRA and13-cRA.Average recoveries w ere98.86%～105.2%for ATRA,101.6%～101.8%fo r13-cRA.Within-day and between-day percision of determination were0.84%～5.5%for ATRA and1.4%～5.7%for13-cRA.Conclusion:This method is sensitive,accurate and good enough to be utilized for the investigation of the clinical pharmacokinetics of ATRA.Key words　all-trans-retinoic acid,13-cis-retinoic acid,serum drug concentration,HPLC首批重组人组织纤溶酶原激活剂国家标准品的研制杨化新　张培培　孙　磊　徐康森(中国药品生物制品检定所　北京　100050)摘要　目的:建立rht-PA效价测定用国家标准品。

方法:用U V法测定蛋白含量;HPSEC法分析纯度;体外凝块裂解气泡上升法测定效价;用t-PA国际标准品(86/670)对国家标准品的效价进行标定。

结果:标准品的效价为每支30000I U,RSD=3.34%(n=10)。

结论:建立的rht-PA国家标准品可用于国内同类药物的研究开发和进口药品的质控。

关键词　重组人组织纤溶酶原激活剂　纯度　效价　标准品 重组人组织纤溶酶原激活剂(rht-PA)是治疗血栓栓塞性疾病的新药,它与天然人组织纤溶酶原激活剂(t-PA)具有相同的功效,尤其是治疗急性心肌梗塞见效快。

国外已有产品上市,国内正处在研究开发阶段,并有单位准备申报新药。

t-PA第1次和第2次国际标准品分别于1984年和1987年颁发,其t-PA均来源于melanoma 细胞衍生物[1,2]。

美国于1990年建立rht-PA国家标准品[3],欧洲亦于1998年建立了rht-PA的欧洲药典标准品[4]。

而我国t-PA标准品尚属空白。

为满足t-PA产品的研究开发及进口检验的需求,并与国际接轨,我们研制了rht-PA国家标准品。

1　仪器与材料rht-PA原料:由德国Boeninger Lingelheim 公司提供,为冻干品。

t-PA标准品:第2次国际标准品(86/670),每支850IU。

人凝血酶(每瓶1000单位)、人纤维蛋白原(每瓶500mg)、人纤维蛋白溶酶原(每瓶1.2mg)均为Calbiochem-Novabiochem Corporation产品。

岛津LC-10AD HPLC系统;日立UV-3210·228·　药物分析杂志　DOI:10.16155/j.0254-1793.2000.04.004分光光度计。

玻璃恒温水浴,玻璃试管(12mm ×100mm ),冰浴。

其它试剂均为国产分析纯。

2　实验方法2.1　HPLC 法　采用TSK3000SW (7.5mm ×600mm )色谱柱;流动相为2.76%磷酸二氢钠-0.1%SDS 水溶液(pH 6.8);流速0.5mL ·min -1;检测波长为210nm ;室温下测定非还原性rht -PA 溶液(1m g ·m L -1rht -PA 水溶液)和还原性rht -PA 溶液(取1mg ·mL -1水溶液与0.02mol ·L -1二硫苏糖醇流动相溶液3m L ,混匀,置80℃水浴3～5min ,放冷),进样量为50μL 。

2.2　蛋白含量测定　参照文献[4]。

2.3　效价测定2.3.1　溶液配制磷酸盐缓冲液:取磷酸二氢钠(含2H 2O )1.79g ,磷酸氢二钠7.10g ,叠氮化钠0.20g ,吐温-800.1g ,加水至1000m L 。

人凝血酶溶液:取人凝血酶,加磷酸盐缓冲液制成每1m L 中含33单位的溶液。

人纤维蛋白原溶液:取人纤维蛋白原,加磷酸盐缓冲液制成每1m L 含可凝蛋白2mg 的溶液。

人血纤维蛋白溶酶原溶液:取人血纤维蛋白溶酶原,加磷酸盐缓冲液制成每1m L 含1mg 的溶液。

混合溶液:临用前取等体积的标准品溶液或供试品溶液与人凝血酶溶液,混匀,置冰浴中。

标准品溶液的制备:取t -PA 国际标准品用磷酸盐缓冲液制成浓度分别为每1m L 含850,425,213,107,54,27I U 的溶液。

供试品溶液的制备:取待标定的样品同标准溶液配制。

2.3.2　测定法　取试管6支,加人血纤维蛋白溶酶原溶液20μL 与人纤维蛋白溶液1m L ,混匀,置冰浴中,依次加不同单位的混合溶液200μL ,立即摇匀并置(37±0.5)℃水浴中,分别计时。

反应系统应在30s 内凝结,当凝块内所有气泡上升至表面时作为反应终点,计时。

以rht -PA 浓度的对数为横坐标,反应时间(s )的对数为纵坐标,进行线性回归,其相关系数不得低于-0.9900。

同法测定供试品溶液。

3　结果与讨论3.1　标准品的原料选择　原料的选择是制备标准品的关键,我们选择了国外的3批rht -PA 为原料,对其纯度、蛋白含量及效价进行分析。

3.1.1　HPLC 纯度分析　rht -PA 是由真核细胞(CHO )表达的一种高分子量糖蛋白。

其产品的纯度,除了比活力外,还要检查单体和单链[4,5]。

rht -PA 是一种含有多个二硫键的单链分子(单体),但是在其第275～276氨基酸残基之间的肽键容易断开,而二硫键未被破坏时,容易形成含切口的分子(亦称双链)。

在非还原条件下,由于链内二硫键的存在,单、双链分子的分子量相同,用HPSEC 不能区分2者(见图1-A ),但能检测出产品中的聚合体,从而计算出单体含量;在还原条件下,rht -PA 分子中的二硫键被打开,含切口的分子变成了2条肽链(见图1-B )。

含切口分子更易受攻击,可能进一步降解成低分子量片断,而影响rht -PA 的活性稳定性,因此,标准规定单体含量不少于95%,含单链应大于60%[4,5]。

3批原料的单体含量均为99%,单链含量分别为86%,85%,82%。

图1　非还原(A )与还原(B )rht -PA 的HPSEC 图谱1.rht -PA 单体2.精氨酸3.单链rht -PA4.双链rh t -PA5.二硫苏糖醇3.1.2　比活力　效价单位数与蛋白含量的比值为比活力(IU ·mg -1)。

3批rht -PA 每瓶蛋白含量分别为53.0,52.0和53.5mg ;每瓶效价分别为27.8×106,29.0×106和33.3×106IU ;比活力分别为5.3×105,5.6×105和5.7×105I U ·mg -1。

rht -PA 原料的比活力符合要求(不少于5.0×105I U ·mg -1)[1,5]。

3.2　标准品的制备3.2.1　配方的选择　配方的选择关系到标准品的稳定性和标准品与供试品的量效曲线是否平行。

本文选用了与t -PA 国际标准品一致的配方,其中人血清白蛋白(HSA )具有长期稳定的作用,精氨酸在达到一定浓度时,可促进溶解也具有稳定作用;吐温-80具有促溶作用,磷酸盐缓冲液(pH 7.3)最适于t -PA 。

3.2.2　分装和熔封　取rht -PA 原料,加适量水溶解后,再用含白蛋白的精氨酸磷酸缓冲液制成约·229·　20(4),2000　60000IU ·mL -1的溶液,在恒温,避光,无微生物及其它化学物质污染处分装,每支0.5m L ,经冷冻干燥后,熔封,于-20℃保存。

3.3　标准品的标定3.3.1　方法的选择　本文所用体外凝块裂解气泡上升法为国际上公认的方法,是t -PA 国际标准品标定、USP 和EP 均采用的效价测定法,此法要求标准品与样品曲线平行,相关系数在-0.9900至-1.0000;重复试验的RSD 不得过10%。

3.3.2　均一性试验　随机抽取冻干后待标品10支,每支用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至5.0m L ,取1.25m L 置25m L 量瓶中,加磷酸盐缓冲溶液至刻度。