简述动物细胞培养过程中细胞复苏,传代,冷冻的操作方法
动物细胞操作实验步骤
一、实验目的1. 熟悉动物细胞培养的基本原理和操作技术。
2. 掌握动物细胞传代、冻存、复苏等基本操作方法。
3. 了解动物细胞在生物学研究中的应用。
二、实验原理动物细胞培养是将动物组织或细胞在体外模拟体内环境条件下，进行生长、繁殖的一种技术。
通过动物细胞培养，可以研究细胞生物学、分子生物学、遗传学等方面的知识，为生物医学研究和药物开发提供实验材料。
三、实验材料1. 细胞：小鼠胚胎成纤维细胞、小鼠胚胎肺细胞等。
2. 培养基：DMEM、RPMI-1640等。
3. 培养试剂：胎牛血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶等。
4. 仪器：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机、水浴锅等。
四、实验步骤1. 细胞复苏（1）将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37℃水浴锅中解冻。
（2）用移液器将细胞悬液转移至离心管中，1000g离心5分钟。
（3）弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
（4）将细胞悬液转移至培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
2. 细胞传代（1）将培养至80%汇合度的细胞取出，用胰蛋白酶消化。
（2）将消化后的细胞悬液转移至离心管中，1000g离心5分钟。
（3）弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
（4）将细胞悬液按1:2或1:3的比例传代至新的培养瓶中。
（5）置于37℃、5%CO2培养箱中培养。
3. 细胞冻存（1）将培养至70%汇合度的细胞取出，用胰蛋白酶消化。
（2）将消化后的细胞悬液转移至离心管中，1000g离心5分钟。
（3）弃去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞。
（4）将细胞悬液按1:1的比例转移至冻存管中。
（5）加入10%DMSO，混匀。
（6）将冻存管置于-80℃冰箱中过夜，然后转入液氮罐中保存。
4. 细胞观察（1）将培养好的细胞取出，用胰蛋白酶消化。
（2）将消化后的细胞悬液转移至载玻片上，滴加适量固定液。
（3）室温固定10分钟。
细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)
背景知识：细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。
因此及时进行细胞冻存十分必要。
细胞冷冻储存在—70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中,温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
原理:细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
主体内容(操作步骤）：一、材料（一)仪器1。
净化工作台2. 离心机3。
恒温水浴箱4. 冰箱(4℃、—20℃、—70℃）5。
倒置相差显微镜6. 培养箱7. 液氮冰箱易生物仪器库：http://www.ebioe。
com/yp/product—list-42。
html（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头、直头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1。
吸头2. 枪头3。
胶塞4。
移液管(10ml）5. 15ml离心管6. 冻存管（1～2ml)（四)其他物品1。
微量加样枪2. 红血球计数板3. 记号笔4. 医用橡皮膏5。
移液枪（五)试剂1。
D—Hanks液2. 小牛血清3。
培养液4。
双抗（青霉素、链霉素）5。
胰蛋白酶(0。
08%）6. 1NHCl7。
7.4%NaHCO38。
DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油易生物试剂库：http：//www。
ebioe。
com/yp/product-list—43.html二、操作步骤（一）细胞冻存1。
配制含10%DMSO或甘油、10～20％小牛血清的冻存培养液;2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、;3. 离心1000rpm，5min；4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107 /ml；5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；6。
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞复苏的原理和方法
细胞复苏的原理和方法细胞复苏的原理是将冻存在液氮或者-70℃冰箱中的细胞解冻之后重新培养，使细胞恢复生长的过程。
细胞复苏的原理是当细胞从冷冻状态恢复到常温状态时，细胞的形态结构保持正常，生化反应即可恢复。
与细胞冻存不同，细胞复苏过程升温要快，原则是慢冻快融，防止在解冻过程中水分进入细胞，形成冰晶，影响细胞存活。
细胞复苏的方法如下：1. 将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化。
在融化的过程中，要注意用镊子夹住冷冻管并在水浴中不时晃动，使细胞受热均匀且速度越快越好，这样可以最大限度的保存细胞活力，并防止水浴锅的水进入细胞冻存管造成细胞污染。
细胞融化后要尽快（约1min）移出37℃水浴。
如果37℃水浴时间延长，会提高细胞死亡率。
2. 完全融化后，用75%酒精擦拭冷冻管外杀菌后，打开盖子，取出冻存管的细胞悬液，缓慢加入到有培养液的T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
如果细胞需要去除冷冻保护剂，用移液枪将细胞悬液注入15mL无菌离心管中，再加5ml完全培养基，根据细胞类型选择合适的离心速度，低速离心5min，弃去上清，加入2-3mL预热的完全培养基，轻轻吹匀，保证细胞完全重悬。
3. 用培养液适当稀释后，将重悬的细胞接种到培养皿或者T25或者是T75的培养瓶中，37℃、5%CO2培养。
24h后，更换新鲜培养基，去除死细胞。
三天可进行一次换液。
当细胞长到有80-90%汇合时进行传代。
此外，还有一些注意事项：1. 取冻存细胞时应做好防护措施，戴好防冻手套、护目镜。
如果冻存管密封不严，液氮可被吸入。
由于解冻时冻存管中的气温急剧上升，将可能发生爆炸。
2. 打开细胞冻存管之前要用酒精棉球将冻存管消毒并晾干。
注意无菌操作，细胞复苏后的操作在4℃冰盒中进行，以减少冷冻保护剂对细胞的毒性。
3. 解冻时间在2min以内完成，且整个过程尽量避免吹打细胞产生气泡，导致细胞复苏后的生长状态不佳。
4. 复苏细胞的时候尽量避免冻存管接缝处沾水，防止支原体污染。
动物细胞培养及传代
一些特殊的促细胞附着的物质可能参加细胞的贴附过程。 （存在于细胞膜表面或培养液尤其血清中的蛋白质）
贴附过程：带阳电荷的促贴附因子先吸附于介质上，悬
浮的圆形细胞再与已吸附有促贴附因子的介质附着，以后 细胞将伸展成其原来的形态．
运动的接触抑制及生长的密度抑制 接触抑制:
当两个正常的细胞移动而互相靠近时，其中之一或两 个将停止移动并向另一个方向离开，使细胞不会重叠。 当一个细胞被其他细胞围绕致无处可去而发生接触时, 细胞不再移动,此即接触抑制。 正常细胞不互相重叠于其上面生长,但肿瘤细胞可重叠 生长。
5、还原剂 某些还原剂在细胞培养中有特殊作用。β－巯基乙醇 在杂交瘤细胞培养中能刺激抗体分泌，并促进胱氨酸 利用。
DMEM培养基配方(1L)
DMEM粉末 碳酸氢钠 谷氨酰胺 丙酮酸钠 青霉素 链霉素 HEPES
13.48g 3.7g 0.584g 0.11g 105U/L 105U/L 5.96g
核移植 细胞融合 细胞培养
胚胎移植
动物细胞培养技术之成就与贡献
生物制品
细胞生理\ 药理\病理 研究
有毒物质
检测
• 病毒疫苗 • 干扰素 •单克隆抗 体
•筛选抗癌 药物
动物细胞培养
动物细胞培养
教学目标
理解动物细胞的特点； 掌握动物细胞培养的定义； 理解动物细胞的体外培养生长特性； 掌握动物细胞培养过程、条件及 了解动物细胞的特点掌握动物细胞培养 的定义 基本技术。
（7）促生长因子等物质
通常情况下,血清可以提供这些生长因子.
血清 常用的血清是小牛血清CS、胎牛血清FBS、 马血清HS和人血清HS。最常用的是小牛血清, 胎牛血清次之。 血清是极其复杂的混合物
简述细胞复苏流程与注意事项
简述细胞复苏流程与注意事项
细胞复苏流程：
1、将冻存的细胞从液氮罐中取出，立即放入37°C的水浴中进行融化，轻柔晃动，加速融化，直到小瓶中只剩下一小块冰，时长应控制在1min 中；
2、用70%乙醇擦拭瓶外后转移无菌操作台中，打开瓶盖前，用酒精灯火焰对瓶口进行消毒；
3、将预加热的新鲜完全培养基滴入小瓶中。
缓慢用移液枪吸取瓶中液体至15ml离心管中，加入适量浓度和体积的完全培养基，轻柔混合均匀；
4、200 ×g左右细胞悬浮液离心5-10分钟。
实际的离心速度和持续时间因细胞类型而异。
弃掉上清，加入新鲜完全培养基重悬细胞，并将其转移到适当的培养容器和推荐的培养环境中。
注意事项：
1、液氮温度低，小心低温对人造成的伤害，在液相中储存的冷冻瓶在解冻时存在爆炸的风险，因此，取出冻存管的时候，要做好个人防护。
2、通常细胞集中储藏在液氮中，取出时应迅速，避免温差对其他冻存
细胞造成影响。
3、复苏细胞的核心技术，简而言之就是快融，将在37°C水浴中快速解冻冷冻细胞(< 1分钟。
4、解冻时，冻存管先放入无菌一次性PE手套中，再放入水中融化，避免污染也方便操作。
5、用预热过的培养基慢慢稀释解冻的细胞。
6、解冻细胞后，在培养皿中培养时，应尽量维持高密度，以提高细胞存活率。
7、注意无菌操作，避免细胞发生污染。
动物细胞传代的主要操作步骤_理论说明以及概述
动物细胞传代的主要操作步骤理论说明以及概述1. 引言1.1 概述在科学研究和生物工程领域中，动物细胞传代技术被广泛应用于细胞生长、培养和实验操作。
通过传代技术，可以使细胞不断增殖并保持其特定功能和特征，为研究细胞的生物学行为提供了重要的手段。
本文将详细介绍动物细胞传代的主要操作步骤，并对其理论说明进行探讨。
1.2 文章结构本文共分为五个部分。
引言部分简要介绍了动物细胞传代技术的概述以及文章结构。
接下来的“2. 动物细胞传代的主要操作步骤”部分将详细介绍该技术涉及到的三个主要步骤：细胞筛选与培养、细胞分裂与增殖以及细胞冻存与解冻。
在“3. 理论说明”部分中，我们将深入探讨动物细胞传代的原理、影响其效率的因素以及目前传代技术发展现状。
最后，在“4. 结论”部分，我们将总结主要操作步骤和理论说明的内容，并对动物细胞传代技术的未来展望和意义进行讨论。
最后，如果有相关参考文献，将在“5. 参考文献”部分列出。
1.3 目的本文旨在提供一个基本的指南，帮助读者了解和掌握动物细胞传代技术的主要操作步骤以及其背后的理论原理。
通过深入了解该技术，读者可以更好地应用于实验室研究、医学治疗以及生物工程等领域中。
同时，我们也希望通过对该技术发展现状和未来展望的讨论，进一步推动细胞传代领域的研究和创新。
2. 动物细胞传代的主要操作步骤2.1 细胞筛选与培养在动物细胞传代中，一个重要的步骤是对初代细胞进行筛选和培养。
首先，选择适合传代的种类或类型的细胞，并确保其健康和纯度。
通常使用显微镜来观察细胞形态和增殖情况，以确定其适用性。
然后，将选定的细胞转移到培养皿中，并提供适当的培养基。
培养基应包含必需的营养物质、氧气和适宜的温度和湿度条件。
通过提供合适的环境，使细胞能够在体外生长和繁殖。
2.2 细胞分裂与增殖细胞传代过程中，细胞分裂与增殖是不可或缺的步骤。
一旦细胞达到足够数量，可以进行传代操作。
在这个阶段，需要注意几个关键因素。
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简述动物细胞培养过程中细胞复苏,传代,冷
冻的操作方法
动物细胞培养过程中的细胞复苏、传代和冷冻是常见的操作步骤。
具体方法如下：
1. 细胞复苏：
a. 将冷冻保存的细胞样品快速解冻，可以将冰冻管置于37°C的水浴中缓慢解冻。
b. 解冻后，将细胞迅速转移到含有预暖的培养基的离心管中。
c. 用培养基轻轻洗涤细胞，并将其移至培养皿中，使细胞附着于培养器皿表面。
d. 增加足够的预热培养基，将细胞放回合适的培养条件中进行复苏。
2. 细胞传代：
a. 当细胞达到适当的密度或已达到培养器皿的最大生长容量时，需要进行细胞传代。
b. 首先，先用无菌PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，以去除残留的培养基和细胞碎片。
c. 使用无菌酶消化液（如胰蛋白酶）轻轻润湿细胞，然后加入等量的无菌培养基来停止消化。
d. 耐心地将细胞悬浮液吸取并转移到新的培养皿中，保持适当的稀释比例，并加入新的预热培养基。
e. 将新的培养皿放入培养箱中，提供适当的温度、湿度和氧气供应。
3. 细胞冷冻：
a. 将细胞按照细胞传代的方法进行收获和洗涤。
b. 用细胞冻存试剂（如DMSO）缓慢添加到细胞悬浮液中，最终细胞密度通常为1-2×10^6个细胞/mL。
c. 将细胞悬浮液转移至预冷的冻存管中。
d. 快速将冷冻管放入冷冻等温器中，以确保细胞迅速冷冻。
e. 细胞冷冻后，将冷冻管转移到液氮罐中进行长期储存。
请注意，动物细胞培养的具体操作方法可能因细胞类型和研究需要而有所不同。
在进行这些操作之前，应仔细阅读并遵守相应的实验室指南和安全操作规程。