健脾活血方对2型糖尿病大鼠肝细胞膜胰岛素受体的影响

健脾活血方对2型糖尿病大鼠肝细胞膜胰岛素受体的影响（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的探讨健脾活血方对2型糖尿病胰岛素抵抗(Insulin Resistance,IR)大鼠肝细胞膜胰岛素受体（Insulin Receptor,InsR）mRNA表达的改善作用及机理。

方法取Wistar大鼠60只，雌雄各半，采用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)加高脂饮食造成2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠模型。

设空白组、模型组、健脾活血方低剂量组、健脾活血方高剂量组和罗格列酮组，以RT-PCR法检测大鼠肝细胞膜InsR mRNA的表达。

结果健脾活血方高剂量组大鼠肝脏InsR mRNA的表达与罗格列酮组相当，与模型组比有显著性差异（P0.01）。

结论健脾活血方能够上调大鼠肝细胞膜InsR mRNA的表达，从而改善胰岛素抵抗。

【关键词】健脾活血方2型糖尿病大鼠肝细胞膜InsR Abstract：ObjectiveTo explore the effect of Strengthening Spleen and Activating Blood Prescription on expressions of insulin receptor gene in the liver membrane of Type 2 Diabetes Mellitusrats and its mechanism.Methods60 Wistar rats ,half male and half female, were randomly devided into five groups: normal control group,model group, Strengthening Spleen and Activating Blood Prescription lowdose group and highdose group, and Rosiglitazone group. The model of insulin resistance of type 2 diabetebes mellitus was established by STZ injection and high-fat diet. Expression of insulin receptor gene in liver membrane was detected.ResultsThe expressions of liver insulin receptor gene in Strengthening Spleen and Activating Blood Prescription high dose group was the same with Rosiglitazone group. There were significant differences compared with model group (P0.01). ConclusionStrengthening Spleen and Activating Blood Prescription can up-regulate the expressions of liver insulin receptor gene in type 2 diabetic rats, and improve insulin resistance.Key words：Strengthening Spleen and Activating Blood Prescription；Type 2 Diabetes Mellitus rats；Liver membrane insulin receptor；Experimental research目前普遍认为，IR与Ins分泌缺陷是2型糖尿病的发病基础，其中IR是贯穿于2型糖尿病发生、发展的全过程的重要因素，IR被认为是基因与环境间相互作用的结果［1～3］，已经证实有不同种族的许多基因与2型糖尿病的发生有关联，这些后选基因包括：胰岛素基因、InsR基因等［4，5］。

它们通过影响胰岛素信号传递和葡萄糖利用等机制在IR的发生发展中起作用［6］。

本研究将从分子水平探讨健脾活血方对肝细胞膜InsR mRNA表达的改善作用和机理。

1 材料与仪器1.1 动物Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重220～240 g，清洁级，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

1.2 药物健脾活血方由人参、黄芪、三七、丹参、生地等组成。

饮片购自哈尔滨世一堂制药厂。

将以上中药按配方煎成200%的药液(即每毫升药液含2 g原生药材煎出物)，冷却后密封，4℃保存备用；罗格列酮：太极涪陵制药有限公司，批号0511020。

试验动物用药0.20 g/Kg，临用前将罗格列酮用蒸馏水配制成混悬液，4℃保存备用。

1.3 试剂抗胰岛素受体β亚单位抗体和抗β-actin抗体：博士德公司；RT-PCR试剂盒：美国Promega公司；上、下游引物来源于美国生物信息中心（NCBI），引物设计使用Primer5.0软件设计，上海捷倍思基因技术公司合成；胰岛素放射免疫分析药盒（FR-FJ-021）：北京市福瑞生物工程公司；STZ:Sigma公司；β-actin （长度540 bp）5’-GTCACCCACACTGTGCCCATC-3’；肝细胞膜InsR上游引物(长度370bp) 5’-CCGGCGTGGC GTGCTCTGAT-3’；肝细胞膜InsR下游引物(长度370bp) 5’-ATGATCACAGACTACCTGCT-3’。

1.4 仪器数字凝胶成像系统Chemi Imager4000（Algpha Innotech Corporation）：美国安来公司；DU640核酸分析仪：美国生产；电泳凝胶图象分析系统：Backman公司；血糖仪及试纸：美国强生公司。

2 方法2.1 动物分组与处理造模参照文献方法［7］加以改造，将60只Wistar大鼠给予基础饲料及自来水适应性喂养1周。

第2周，将大鼠随机分为两组。

空白组12只给予基础饲料，饮用自来水；造模组48只喂高脂饲料,饮用自来水。

两组鼠分别喂养8周。

第10周开始，造模组按体重25 mg/kg一次性腹腔注射0.25% STZ（溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲溶液，pH4.4）；空白组腹腔注射等体积0.lmmol/L、pH4.4枸椽酸盐缓冲液。

禁食12 h。

除空白组12只鼠外，造模组断尾采血，挑选空腹血糖≥11.1 mmol/L的大鼠，共有40只大鼠进入实验。

造模组根据体重随机分为4组，即模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、罗格列酮组。

空白组大鼠和模型组大鼠灌胃给予蒸馏水；高剂量组和低剂量组给予健脾活血方，分别为16 g/kg和8 g/kg，罗格列酮组按0.20 g/kg的剂量灌胃罗格列酮组混悬液，连续给药2周后，处死大鼠，取出肝脏，于低温冰箱（MDF-U50V型）中保存备用。

整个实验过程中，模型组大鼠死亡2只，中药低剂量组大鼠死亡1只。

2.2 检测指标及方法2.2.1 空腹血糖（FBG）测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，断尾采血。

用血糖仪测定血糖。

2.2.2 空腹胰岛素（Fins）测定给药前及给药2周后，大鼠禁食12 h，眼眶静脉丛取血5 ml，用LG-10A 离心机37℃恒温离心（2500 r/min,10 min）15 min，取血清，采用放射免疫双抗体法测定。

2.2.3 胰岛素敏感性指数（ISI）ISI=Ln［1/（FINS×FBG）］［8］2.2.4 肝细胞膜InsR mRNA的表达RT-PCR法检测。

2.2.5 统计方法数值以±s表示，用STATA 7.0软件计算。

P﹤0.01，P﹤0.05为差异具有显著性。

3 结果3.1 对大鼠FBG，Fins，ISI的影响结果显示，造模后，各组大鼠FBG、Fins显著升高，ISI显著下降，与空白组相比，有显著性差异(P0.01)，说明造模成功。

给药后，各组大鼠血糖下降，其中以罗格列酮组疗效最显著，与模型组比，有显著性差异(P0.01)；健脾活血方组与模型组比有明显差异(P0.05)，且健脾活血方高剂量组较低剂量组疗效显著，但其降血糖作用不及罗格列酮。

经治疗后，各组大鼠Fins均下降，ISI提高，其中以中药高剂量组和罗格列酮组改善最为显著，与模型组比有显著性差异(P0.01)，中药高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。

见表1～2。

表1 给药前大鼠FBG，Fins，ISI（略）表2 给药后大鼠FBG，Fins，ISI（略）与模型组比较，﹡﹡P0.01，﹡P0.053.2 对大鼠肝脏细胞膜InsR mRNA表达的影响RT-PCR产物在琼脂糖电泳凝胶紫外灯下均可见：各β-actin电泳条带亮度一致，扩增片段均为300bp。

肝脏InsR mRNA的500bp片段，但各组电泳条带亮度有明显差异，模型组大鼠InsR mRNA的表达减弱，与空白组比较有显著性差异（P0.01）；各治疗组大鼠肝脏InsR mRNA的表达增强，以罗格列酮组和健脾活血方高剂量组的改善最为明显，与模型组比较有显著性差异（P0.01）；健脾活血方低剂量组与模型组比亦有明显差异（P0.05）。

健脾活血方高剂量组与罗格列酮组比较无统计学意义。

见图1～2和表3。

表3 对大鼠肝脏InsR/β-actin mRNA RT-PCR电泳产物灰度扫描比值的影响（略）与模型组比较，﹡﹡P0.01，﹡P0.054 讨论InsR广泛分布于全身各组织细胞膜，每个细胞约有l×103～105个受体。

InsR是由2个-α亚基及2个-β亚基构成。

α亚基肽链N端及富含半胱氨酸残基的结构域是胰岛素的结合位点［6］。

β亚基跨膜存在于胞质，具有酪氨酸蛋白激酶活性，它又可分为三区：胞外结构域、跨膜区及胞质结构域。

胞质结构域又由含酪氨酸的三个区域构成：即近膜结构域、酪氨酸激酶结构域及C末端结构域［6］。

近膜结构域为InsR β亚基与胞质内InsR底物结合所必需，在胰岛素信号的传递上发挥关键作用。

酪氨酸激酶结构域具有三磷酸腺苷结合部位。

InsR β亚基C末端两个酪氨酸磷酸化部位与信息传递蛋白Grb10结合，参与细胞增殖［9］。

InsR数目异常及功能缺陷均可影响胰岛素的信号转导。

已知胰岛素是通过细胞膜上的InsR起作用的，其作用受细胞上受体密度和亲和力的变化调节。

多项研究证明STZ糖尿病大鼠的肝脏、肌肉细胞膜InsR数目受血中胰岛素浓度的影响，即血胰岛素浓度对InsR量呈负向调节：胰岛素浓度升高，受体数目降低，反之则受体数目升高［10］。